肝硬化患者胃黏膜微生物菌群特征及其與胃腸道癥狀的相關(guān)性分析

陳燕飛，郭靜，陳春雷，石鼎，方戴瓊，季峰*，李蘭娟,*

1. 引言

研究表明，腸道菌群失衡在肝硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。此外，越來越多的證據(jù)表明，肝硬化患者腸道中存在口腔常駐菌群過度定植的情況[2]。多項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)腸道和口腔微生物失調(diào)與機(jī)體炎癥狀態(tài)和肝硬化進(jìn)展密切相關(guān)[2-6]。然而，胃作為連接口腔和腸道的中間器官，人們對(duì)肝硬化時(shí)其黏膜的微生物結(jié)構(gòu)狀態(tài)尚缺乏深入的了解。本研究擬深入解析胃黏膜菌群在肝硬化狀態(tài)下的狀態(tài)及其與疾病的相關(guān)性。

由于其極酸的環(huán)境和其他抗菌因素存在，人類的胃黏膜一直被認(rèn)為僅有幽門螺桿菌（H. pylori）定植。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，胃黏膜菌群分析得到了極大的發(fā)展。除了幽門螺桿菌外，胃黏膜上還有許多其他微生物定植，構(gòu)成群落結(jié)構(gòu)。

胃細(xì)菌中最主要的是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria）[7,8]。各種證據(jù)表明，胃微生物群落在胃病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[9,10]。此外，胃微生物群定植與病理、免疫反應(yīng)以及促炎和癌相關(guān)基因的mRNA表達(dá)相關(guān)[11]。非幽門螺桿菌在胃內(nèi)定植也與胃癌、胃息肉等疾病有關(guān)[12]。從淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生到腸型胃癌，不同的胃病中存在不同的胃微生物群[10,13-15]。

肝硬化患者很多合并消化道癥狀，具體病理生理機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，可能涉及結(jié)構(gòu)改變、心理困擾、胃對(duì)膨脹的敏感性增加以及腸道轉(zhuǎn)運(yùn)延遲等多種因素[16-19]。內(nèi)鏡下肝硬化主要表現(xiàn)為黏膜改變和靜脈曲張[20]。肝硬化的胃黏膜改變包括慢性胃炎、糜爛性胃炎、胃潰瘍等[21]。靜脈曲張?jiān)谑彻芎停ɑ颍┪傅鬃畛Ｒ姟４蠖鄶?shù)肝硬化患者存在胃排空延遲或小腸蠕動(dòng)功能受損[17]。胃內(nèi)微環(huán)境包括pH值、供氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、離子和理化環(huán)境在肝硬化中明顯異常，這可能對(duì)于一些特定菌株的定植有利。而特定黏膜細(xì)菌也可能通過誘導(dǎo)黏膜炎癥而導(dǎo)致胃癥狀。

本研究旨在以正常健康人群為對(duì)照，采用16S rRNA高通量測(cè)序和聚類分析肝硬化患者胃黏膜微生物群的特征及其與胃部癥狀的相關(guān)性。我們的研究結(jié)果顯示，肝硬化患者幽門螺桿菌定植率降低。幽門螺桿菌陰性受試者的胃黏膜微生物菌群表現(xiàn)出相當(dāng)大的異質(zhì)性。某些胃微生物結(jié)構(gòu)與之前內(nèi)鏡下靜脈曲張?zhí)自委熀臀改c道癥狀嚴(yán)重度有關(guān)。

2. 方法

2.1. 研究對(duì)象

研究對(duì)象均來自浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院?；颊呓M包括29例肝硬化患者，均在醫(yī)院接受了上消化道內(nèi)鏡檢查。肝硬化的診斷是基于肝活檢或超聲支持的臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)共同確認(rèn)。肝硬化病因包括乙肝相關(guān)性24例（82.8%），原發(fā)性膽汁性肝硬化3例（10.3%），酒精性肝硬化兩例（6.9%）。采用Child-Pugh評(píng)分評(píng)價(jià)肝硬化患者的肝功能狀態(tài)。Child-Pugh A級(jí)為代償期，B級(jí)為功能損害，C級(jí)為失代償性疾病[22]。病例組中肝硬化組Child-Pugh A 25例（86.2%），Child-Pugh B 3例（10.3%），Child-Pugh C 1例（3.4%）。另外召集了31例接受胃鏡體檢，而且內(nèi)鏡檢查結(jié)果基本正常的健康個(gè)體作為對(duì)照。肝硬化患者組和對(duì)照組在年齡和性別比例上匹配。本研究排除了在過去兩個(gè)月內(nèi)接受過抗生素或質(zhì)子泵抑制劑（PPI）治療的個(gè)體。所有受試者在進(jìn)行胃鏡檢查前接受（PAGI-SYM）問卷調(diào)查，對(duì)其胃腸道疾病癥狀嚴(yán)重程度指數(shù)進(jìn)行評(píng)分[23]。

在進(jìn)入研究前，所有研究對(duì)象均已充分了解研究目的及方案，提供了書面的知情同意書。本研究完全遵循1975年《赫爾辛基宣言》的倫理準(zhǔn)則。研究方案于2013年12月11日通過浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.2. 胃鏡檢查及取樣

所有胃鏡檢查操作均由同一位胃腸科醫(yī)生（季峰醫(yī)生）進(jìn)行。正常對(duì)照組的內(nèi)鏡檢查結(jié)果基本正常。每位研究對(duì)象獲取胃竇活檢組織兩塊。一塊組織用于常規(guī)病理分析。另一塊組織活檢樣本放置在無菌生理鹽水中，在-80 ℃保存，用于后續(xù)16S rRNA微生物高通量測(cè)序。

2.3. 黏膜組織DNA抽提

黏膜組織DNA抽提采用QIAamp DNA分離試劑盒（Qiagen, Valencia, CA, USA）結(jié)合打珠法進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說，活檢組織在180 μL QIAamp ATL緩沖液中加入20 μL蛋白酶K，在56 ℃下孵育1 h。然后，加入不同直徑的玻璃微珠（0.1 mm, 0.5 mm, 1 mm, Sigma, St. Louis, MO,USA）。然后，使用FastPrep FP120打珠機(jī)（Bio 101,Morgan Irvine, CA, USA）以4 m·s-1的速度進(jìn)行樣品均質(zhì)30 s。然后，在56 ℃下再孵育1 h。將裂解液加入RNase A 4 mL （100 mg·mL-1）和AL緩沖液200 μL中，70 ℃孵育30 min。在加入200 μL無水乙醇后，在制造商指定的QIAamp柱上純化裂解物。用AE緩沖液共200 μL洗脫。

2.4. 16S rRNA焦磷酸測(cè)序

用通用PCR引物（27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′, 533R 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′）擴(kuò)增16S rRNA基因（V1-3區(qū)），如前所述[24]。16S rRNA基因的焦磷酸測(cè)序是在454 GS FLX Titanium測(cè)序儀上進(jìn)行的，使用羅氏/454的軟件工具。

2.5. 生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用QIIME軟件（1.7.0）用于處理和比較16S rRNA 序列 [25]。最小讀取長(zhǎng)度為200 bp，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25。剔除引物序列有兩次以上錯(cuò)配的序列。均聚物在序列中授權(quán)數(shù)量的上限設(shè)置為6。生成高質(zhì)量序列數(shù)量484 105條，每個(gè)樣本平均包含8068條（最低5491、最高13 957），平均序列長(zhǎng)度為464 bp。為平衡測(cè)序深度，從每個(gè)樣本中隨機(jī)抽取5491條序列，進(jìn)行后續(xù)α/β多樣性和分類群比較。操作分類單元（operational taxonomic unit, OTU）的相似性閾值設(shè)置為97%。選取序列最豐富的OTU作為代表性序列。使用Greengene數(shù)據(jù)庫（gg_13_8_otus）對(duì)代表性序列進(jìn)行物種分類。使用USEARCH進(jìn)行嵌合體識(shí)別[26]。用R包系統(tǒng)序列分析QIIME結(jié)果[27]。功能基因含量的預(yù)測(cè)是基于群落系統(tǒng)發(fā)育調(diào)查的PICRUSt軟件[28]。

肝硬化患者與對(duì)照組的差異性及臨床參數(shù)的顯著性檢驗(yàn)采用雙側(cè)學(xué)生t檢驗(yàn)法。鑒別幽門螺桿菌陰性的四種聚類的細(xì)菌分類、功能模塊和臨床特征的差異，采用單因素方差分析、Tukey’s檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。上述分析方法用R中的語句包“mixOmics”“plyr”和“reshape2”完成。

3. 結(jié)果

3.1. 臨床特點(diǎn)及內(nèi)鏡檢查結(jié)果

本研究共納入60名研究對(duì)象（31例對(duì)照組和29例肝硬化患者）。表1總結(jié)了研究對(duì)象的臨床特征。肝硬化患者的PAGI-SYM評(píng)分明顯高于對(duì)照組（6.7±4.8 vs 3.2±2.7,p= 0.001）。其他臨床特征（年齡、體重指數(shù)和性別）在疾病組和對(duì)照組中基本一致。

29例肝硬化患者的內(nèi)鏡檢查結(jié)果匯總在補(bǔ)充材料中的表S1中。所有肝硬化患者均表現(xiàn)為食管或胃底靜脈曲張[29]。根據(jù)新意大利內(nèi)鏡協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，有15例（51.7%）患者患有門脈高壓性胃病。胃十二指腸潰瘍3 例（10.3%），其中胃潰瘍兩例，十二指腸潰瘍一例。4 例（13.8%）為糜爛性胃炎。兩例（6.9%）為萎縮性胃炎。31例對(duì)照組的內(nèi)鏡檢查結(jié)果基本正常。

3.2. 肝硬化患者胃內(nèi)幽門螺桿菌感染率低

32.3%（10/31）的健康對(duì)照者組織學(xué)檢出幽門螺桿菌，而僅6.9%（2/29）的肝硬化患者H. pylori陽性。肝硬化患者的H. pylori感染率顯著降低（p= 0.03）（表 1）?；?6S rRNA基因序列的微生物譜分析也顯示，H.pylori陽性個(gè)體與陰性個(gè)體之間的幽門螺桿菌屬相對(duì)豐度存在顯著差異。H. pylori陽性樣本的平均幽門螺桿菌屬序列占所有序列的97.1%（范圍為90.1%～99.9%），H.pylori陰性樣本的平均幽門螺桿菌屬序列占所有序列的0.7%（范圍為0.0%～8.5%，見補(bǔ)充材料中的表S2）。幽門螺桿菌陽性和陰性的胃微生物群之間的細(xì)菌豐度顯著降低，以觀察到的OTU個(gè)數(shù)相比，H. pylori陽性對(duì)照為76±45，H. pylori陰性對(duì)照為203±35（p＜ 0.001），Shannon指數(shù)在幽門螺桿菌陽性對(duì)照組為0.37±0.01，而幽門螺桿菌陰性對(duì)照組為3.5±0.47（p＜ 0.001）（表1）。

表1 研究對(duì)象的臨床特征和α多樣性

3.3. 幽門螺桿菌陰性胃黏膜菌群的4個(gè)聚類

H. pylori陽性樣本黏膜菌群以H. pylori序列為主。為了更好地發(fā)掘胃內(nèi)除幽門螺桿菌外的其他菌屬改變，我們對(duì)H. pylori陰性樣本的黏膜菌群進(jìn)行了深度分析。肝硬化組和對(duì)照組胃黏膜微生物群落在Bray-Curtis聚類分析表現(xiàn)出很大的相似性（見補(bǔ)充材料中的圖S1）。進(jìn)而我們采用了另一種探索性的非監(jiān)督數(shù)據(jù)分析方法聚類，探討這些胃微生物菌群是否存在自然分組。為了確定最優(yōu)的聚類數(shù)量，計(jì)算基于OTU水平相對(duì)豐度的Jensen-Shannon距離矩陣。發(fā)現(xiàn)4個(gè)聚類是最優(yōu)方案，4個(gè)聚類的Silhouette指數(shù)為1.83，表明4個(gè)聚類具有較強(qiáng)的可靠性。類間分析顯示4個(gè)聚類之間有明顯的差異[圖 1（a）]。此外，4個(gè)聚類的Calinski-Harabasz值最高，也支持4個(gè)聚類作為最佳聚類數(shù)[圖1（b）]。然而，4個(gè)聚類之間的微生物多樣性比較無顯著差異（表2）。

表2 幽門螺桿菌陰性胃黏膜菌群的4個(gè)聚類的臨床特征及α多樣性比較

48例幽門螺桿菌陰性患者中，聚類1和2各為10例（21%），聚類3為15例（31%），聚類4為13例（27%）。各聚類的臨床特征匯總見表2。雖然每個(gè)聚類中都有肝硬化患者和對(duì)照組，但各個(gè)聚類中肝硬化患者的比例是不同的。聚類1和2中的肝硬化患者比例為80%，聚類3中僅20%（p= 0.02）。采用PAGI-SYM評(píng)分比較各組上消化道癥狀的嚴(yán)重程度。PAGI-SYM評(píng)分在聚類2組（9.6±4.6）最高，聚類1組（6.1±4.0）和聚類4組（4.9±3.8）次之，聚類3組（3±2.9）評(píng)分最低（p= 0.001）。此外，經(jīng)內(nèi)鏡下靜脈曲張?zhí)自‥VL）治療的患者比例在聚類2組（62.5%）高于聚類1組（25%），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p= 0.18）。在每組患者中，既往靜脈曲張出血、存在靜脈曲張或肝硬化嚴(yán)重程度（Child-Pugh）、使用心得安和存在門脈高壓性胃病的情況無顯著差異。

圖1. 幽門螺桿菌陰性患者胃黏膜菌群可以被分為4個(gè)聚類。（a）基于OTU水平的Jensen-Shannon距離主成分分析。圖標(biāo)顏色代表聚類分組：聚類 1（藍(lán)色）；聚類2（紅色）；聚類3（黑色）；聚類4（綠色）。（b）分為4個(gè)聚類獲得了最高的Calinski-Harabasz (CH)值，是最佳分類數(shù)。

3.4. 幽門螺桿菌陰性的胃菌群分析

對(duì)相對(duì)豐度大于1%的菌類豐度進(jìn)行分析，以確定各個(gè)聚類的特征菌群（圖2）。發(fā)現(xiàn)四個(gè)聚類之間菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。在門水平[圖2（a）]，聚類2中擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著低于聚類3和聚類4（p= 0.0007）。聚類1中變形菌門的相對(duì)豐度顯著高于其他集群（p=0.00002）。厚壁菌門在聚類2中含量較高，在聚類1中含量較低，在聚類3和聚類4中含量中等（p= 0.015）。放線菌門的相對(duì)豐度在聚類4中顯著高于聚類1（p=0.002）。

在科的水平[圖2（b）]，聚類2的擬桿菌科細(xì)菌相對(duì)豐度顯著低于聚類3和聚類4（p= 0.0002）。聚類2中擬桿菌科（Bacilli）的相對(duì)豐度最高（p= 1×10-7）。聚類1中β-變形菌科（Betaproteobacteria）比例最高（p=1×10-6）。α-變形菌門（Alphaproteobacteria）在聚類2中的含量明顯高于其他聚類（p= 1×10-5）。

在屬水平上[圖2（c）]，與其他聚類相比，β-變形菌科的奈瑟菌屬（Neisseria）在聚類1中比例增加（p=1×10-5）。4個(gè)聚類中，鏈球菌屬（Streptococcus）在聚類2中的比例最高（p= 1×10-8）。普雷沃菌屬（Prevotella）在聚類4中的相對(duì)豐度顯著高于聚類1和聚類2（p=0.002）。梭桿菌屬（Fusobacterium）的相對(duì)豐度在聚類1中明顯高于聚類2和聚類4（p= 0.002）。

圖2. 聚類間不同分類層面差異顯著的細(xì)菌相對(duì)豐度。（a）門水平；（b）綱水平；（c）屬水平。數(shù)據(jù)用小提琴圖可視化，其中中間的線是中值，方框代表四分位數(shù)范圍。從框延伸出來的細(xì)線表示數(shù)據(jù)中的上（最大值）和下（最小值）相鄰值。不同顏色的圖表示不同的簇。M：組間中等水平，顯著高于最低，顯著低于最高；ML：最高和中間組之間無顯著性差異。

3.5. 幽門螺桿菌陰性的胃菌群功能基因分型

我們進(jìn)而通過PICRUSt分析獲得胃黏膜菌群京都基因和基因組百科全書（KEGG）模塊的預(yù)測(cè)功能基因圖譜。當(dāng)比較1級(jí)KEGG途徑[圖3（a）]時(shí)，發(fā)現(xiàn)聚類2中涉及遺傳信息處理的功能基因顯著低于其他3個(gè)聚類（p= 0.0005）。在KEGG途徑水平2和水平3，遺傳信息處理下降涉及的功能分類主要包括核糖體和翻譯核糖體生物發(fā)生、折疊分類和降解途徑[圖3（b）]。在聚類2中，涉及模塊折疊、分選和降解的功能基因相對(duì)豐度最低（p= 1×10-5）。途徑翻譯核糖體模塊在聚類2中的比例顯著低于聚類1和聚類3（p= 0.006）。另一個(gè)途徑翻譯模塊核糖體合成在聚類2中顯著低于聚類3和聚類4（p= 0.001）。與聚類3和聚類4相比，聚類1的氨基糖和核苷酸糖模塊的相對(duì)豐度顯著降低，聚類2介于中間（p=0.001）。聚類2糖原合成和代謝模塊功能基因水平低于其他組（p= 0.0005）。

圖3. 聚類間差異顯著的細(xì)菌不同層級(jí)功能模塊。（a）1級(jí)；（b）第2和第3級(jí)。數(shù)據(jù)用小提琴圖進(jìn)行可視化，其中中間的線是中值，方框代表四分位數(shù)范圍。從框中延伸來的細(xì)線表示數(shù)據(jù)中上部（最大值）和下部（最小值）的相鄰值。不同顏色的圖表示不同的簇。

4. 討論

腸道菌群失衡在肝硬化并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。然而，以前的大多數(shù)研究都在分析糞便菌群。我們首次描述了肝硬化患者胃黏膜菌群的特征。研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的幽門螺桿菌感染率明顯低于對(duì)照組。在幽門螺桿菌陰性患者中，胃微生物群聚成4個(gè)不同的聚類：聚類1和聚類2（主要是肝硬化患者），聚類3（主要是健康對(duì)照）和聚類4（肝硬化和健康對(duì)照各占一半）。這些聚類在菌群組成和功能上存在顯著差異，尤其是聚類2。從臨床特征來看，聚類2中大多數(shù)肝硬化患者既往有EVL治療史和嚴(yán)重的上消化道癥狀，這表明在肝硬化中胃微生物群、EVL和上消化道癥狀之間可能存在關(guān)聯(lián)。

幽門螺桿菌是胃定植菌中研究最多的細(xì)菌。本研究顯示肝硬化患者幽門螺桿菌感染率較低。近期Chang和Hu [30]報(bào)道，在臺(tái)灣人群中，失代償期肝硬化和消化性潰瘍代償期肝硬化患者與非肝硬化患者相比，幽門螺桿菌感染率更低。與之前的研究一致，我們的結(jié)果再次證實(shí)了幽門螺旋桿菌不是肝硬化患者胃十二指腸病變的主要病因[31]。肝硬化導(dǎo)致胃幽門螺桿菌定植減少的機(jī)制尚不清楚，可能有以下幾個(gè)原因。首先，肝硬化患者胃pH值高于對(duì)照組，有較大比例的肝硬化患者出現(xiàn)胃酸過少的情況[32]。其次，在肝硬化患者中，胃萎縮和腸上皮化生發(fā)生頻率明顯高于健康對(duì)照組[33]。萎縮性胃炎的發(fā)生會(huì)伴隨幽門螺桿菌的定植減少或消除[34]。肝硬化患者常因惡心、嘔吐和消化道出血等癥狀而服用制酸劑。肝硬化患者幽門螺桿菌發(fā)病率低也可能與頻繁服用PPI有關(guān)。這些結(jié)果與最近一項(xiàng)關(guān)于PPI對(duì)健康犬胃腸道微生物群的影響的研究一致，發(fā)現(xiàn)奧美拉唑給藥期間，胃內(nèi)幽門螺桿菌有所減少[35]。長(zhǎng)期以來胃黏膜幽門螺桿菌的存在被認(rèn)為與包括消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤等多種胃病有關(guān)[36]。然而，最近有一些數(shù)據(jù)表明幽門螺桿菌對(duì)自身免疫和變應(yīng)性疾病有保護(hù)作用[37]。幽門螺桿菌的下降是否參與肝硬化的并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展需要未來的研究加以證實(shí)。

胃微生物群的組成受飲食習(xí)慣、藥物、胃黏膜炎癥、疾病、遺傳背景等多種因素的影響[38]。對(duì)于幽門螺桿菌陰性個(gè)體，通過直接比較肝硬化患者和對(duì)照組患者并不能觀察到很多特征性的差異（見補(bǔ)充材料中的圖S1）。這一結(jié)果表明肝硬化本身可能并不是胃微生物群的主要塑造者。然后，對(duì)所有幽門螺桿菌陰性研究對(duì)象，根據(jù)微生物組成將人群分為4個(gè)聚類。聚類1和聚類2中肝硬化患者明顯增多，提示有一定的疾病相關(guān)的菌群狀態(tài)。

肝硬化常伴有胃腸道癥狀。一般認(rèn)為與肝臟疾病的嚴(yán)重程度、腸道功能障礙（如胃對(duì)膨脹的敏感性增加和腸道轉(zhuǎn)運(yùn)延遲）和心理壓力相關(guān)的因素[39]。PAGISYM是廣泛用于疾病相關(guān)的胃腸道癥狀評(píng)估指標(biāo)[23]。本研究中，肝硬化患者的平均PAGI-SYM評(píng)分明顯高于對(duì)照組。根據(jù)PAGI-SYM評(píng)分，聚類2組的上消化道癥狀最嚴(yán)重。從分類上看，聚類2的特征是Bacilli增加，而擬桿菌綱（Bacterodia）相對(duì)下降。近來有多個(gè)研究提出胃腸道癥狀與胃微生物群之間存在相關(guān)性。Han等[40]報(bào)道胃中幽門螺桿菌的相對(duì)豐度與組織學(xué)及內(nèi)鏡下胃炎密切相關(guān)，但與癥狀性胃炎無顯著相關(guān)性。PAGISYM評(píng)分與下列菌種Corynebacterium segmentosum,Prevotella nanceiensis,Neisseria enlongata,Pantoeasp.和Actinobacillus parahaemolyticus的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，而與Prevotella pallens,Propionibacterium acnes和Staphylococcus epidermids等的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)[40]。最近，F(xiàn)ukui和他的研究小組發(fā)現(xiàn)功能性消化不良的胃黏膜腸鏈球菌明顯增多，而且鏈球菌的相對(duì)豐度與上消化道癥狀呈正相關(guān)[41]。微生物群可能通過神經(jīng)源性炎癥過程和腸神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)來改變癥狀敏感性[42]。雖然很少有研究探索胃微生物群和胃腸道癥狀之間的關(guān)系，但人們對(duì)腦-腸道微生物組（BGM）軸內(nèi)的雙向相互作用越來越感興趣[43]。BGM軸的改變不僅與功能性腸疾病如腸易激綜合征有關(guān)[44]，也與胃腸道共病的精神和神經(jīng)疾病有關(guān)[45]。胃腸道癥狀與胃黏膜微生物菌群相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)應(yīng)是BGM軸的一部分，有待進(jìn)一步研究闡明。

曲張靜脈出血是肝硬化最常見的并發(fā)癥之一。EVL是目前在肝硬化患者中應(yīng)用最廣泛的治療方法。它不僅是曲張靜脈出血急性發(fā)作的首選，也是二級(jí)預(yù)防的首選[46]。目前還沒有研究系統(tǒng)評(píng)估EVL對(duì)腸道微生物群的影響。但有報(bào)道提示EVL與包括吞咽困難、食管潰瘍、胸骨后、吞咽痛、胃灼熱、咽喉痛和發(fā)熱等多種不良事件相關(guān)[47]。EVL后患者經(jīng)常出現(xiàn)上消化道運(yùn)動(dòng)障礙[48]。聚類1和聚類2均包含較高的肝硬化患者比例。然而，與聚類1相比，聚類2中有更多的患者曾經(jīng)歷EVL。我們的結(jié)果提示EVL可以誘導(dǎo)胃內(nèi)鏈球菌屬的增加。雖然證據(jù)有限，但人們一直擔(dān)心EVL后的細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)。接受侵入性治療的患者，革蘭氏陽性球菌引起的感染率較高[49]。鏈球菌是肝硬化感染的主要原因之一。既往研究在肝硬化患者的糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了更多的鏈球菌[6]。兩例EVL患者的血液標(biāo)本中分離出膿鏈球菌和表皮葡萄球菌，但未出現(xiàn)細(xì)菌感染[50]。鏈球菌屬于正常的口腔微生物群，可引起牙齒和牙周感染。我們?cè)谶@里的結(jié)果表明，EVL可能增加細(xì)菌從口腔轉(zhuǎn)移到胃的風(fēng)險(xiǎn)。

在我們的研究中，微生物組的功能基因分析揭示了聚類中功能基因豐度變化。我們發(fā)現(xiàn)，與其他3個(gè)聚類相比，聚類2中涉及糖基生物合成、代謝和遺傳信息處理的基因豐度顯著降低。棲息在人體腸道中的共生微生物以分解多糖和聚糖，包括宿主黏液分泌的內(nèi)源性聚糖和膳食聚糖獲取能量為生[51]。對(duì)于胃黏液微生物來說，內(nèi)源性聚糖是其主要的營(yíng)養(yǎng)來源。內(nèi)源性多糖的化學(xué)多樣性要求黏膜微生物產(chǎn)生各種不同的降解酶，以利用這些多相聚合物[51]。從生態(tài)學(xué)的角度來看，聚類2中聚糖生物合成和代謝基因的下降可能表明該菌群不是一個(gè)長(zhǎng)期進(jìn)化的穩(wěn)定群落。EVL等侵入性操作會(huì)干擾微生物群，將微生物引入口腔等上游。細(xì)菌生活在不斷變化的環(huán)境中。為了快速適應(yīng)，它們進(jìn)化出了多種機(jī)制來調(diào)節(jié)從轉(zhuǎn)錄起始到蛋白質(zhì)失活和降解的每一個(gè)細(xì)胞過程[52]。利用PICRUSt進(jìn)行的生物信息學(xué)分析顯示，重金屬暴露等惡劣環(huán)境對(duì)環(huán)境和遺傳信息處理的富集功能有強(qiáng)烈影響[53]。聚類2中與遺傳信息處理相關(guān)的功能基因豐度相對(duì)較低，也說明該菌群不是適應(yīng)惡劣環(huán)境的原始成員。

本研究仍存在一定的局限性。首先，大多數(shù)來就診的人都有上消化道不適。雖然健康對(duì)照組的內(nèi)鏡檢查結(jié)果基本正常，但他們可能不是嚴(yán)格意義上的健康對(duì)照。其次，胃微生物群的組成也可能受到飲食環(huán)境和藥物等其他因素的影響[38]。本研究沒有記錄和比較飲食環(huán)境。盡管，我們排除了胃鏡取樣前4周服用過PPI、抗生素和益生菌的患者來降低藥物的影響。然而，長(zhǎng)期來看，肝硬化患者經(jīng)常服用藥物，因此可能會(huì)影響微生物群。這些因素的影響有待于在今后大樣本研究中分析。再次，基于Picrust的功能基因預(yù)測(cè)并不是真正的宏基因組結(jié)果。在未來，基于鳥槍法的宏基因組分析應(yīng)得到應(yīng)用。此外，本研究的結(jié)果還不足以探討幽門螺桿菌在肝硬化中的潛在作用。具體機(jī)制有待進(jìn)一步增加樣本量研究。

總之，本研究對(duì)肝硬化患者胃黏膜微生物群與健康對(duì)照組進(jìn)行了比較。在肝硬化患者中幽門螺桿菌定植下降。對(duì)于幽門螺桿菌陰性個(gè)體，直接比較肝硬化和對(duì)照組并不能觀察到很多差異。然而，H. pylori陰性個(gè)體的胃微生物可聚為4個(gè)聚類，其中兩個(gè)聚類（聚類1和聚類2）的肝硬化患者較多。在結(jié)構(gòu)和功能上差異最明顯的聚類2中，經(jīng)歷過EVL治療和具有嚴(yán)重胃腸癥狀的患者相對(duì)較多。我們的研究表明，胃微生物群、上消化道癥狀和肝硬化患者的侵入性治療（如EVL）之間可能存在聯(lián)系。需要進(jìn)一步的大隊(duì)列研究來證實(shí)。此外，微生物靶向治療改善上消化道癥狀的具體機(jī)制也有待進(jìn)一步探索。

致謝

本研究受國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81790631）和浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY15H030012）資助。

Compliance with ethics guidelines

Yanfei Chen, Jing Guo, Chunlei Chen, Ding Shi, Daiqiong Fang, Feng Ji, and Lanjuan Li declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.04.014.