我國(guó)豬源和雞源大腸桿菌抗生素耐藥性相關(guān)基因研究進(jìn)展

周 煒，周芷錦,沈紅霞, 倪柏鋒, 王 彬, 陳 凱, 穆 琳, 陳 勇, 張恩寶，曲道峰， 趙靈燕*

(1.浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 杭州 311119；2：浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018)

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)是腸桿菌科細(xì)菌中分布最廣泛的革蘭氏陰性菌，也是獸醫(yī)臨床中常見(jiàn)病原菌之一。自1885年德國(guó)小兒科醫(yī)師Escherich首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌以來(lái)，先后有279種血清型被證實(shí)[1]。正常情況下，大腸桿菌是動(dòng)物腸道的共生菌，但當(dāng)動(dòng)物機(jī)體免疫力低下或菌群失調(diào)時(shí)，腸侵襲性(EIEC)、腸出血性(EHEC)、腸致病性(EPEC)、腸黏附性(EAEC)、彌散粘附性(DAEC)和腸產(chǎn)毒性(ETEC)大腸桿菌等致病性大腸桿菌可引發(fā)宿主腸道、呼吸道、血液系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多器官系統(tǒng)疾病，例如受到廣泛關(guān)注的腸出血性家族的O157:H7型、O2血清型等。由于血清型復(fù)雜，且極易產(chǎn)生變異和耐藥性[2]，大腸桿菌引發(fā)的疾病并無(wú)理想的疫苗可用于預(yù)防，獸醫(yī)臨床多用抗菌藥物進(jìn)行治療。按照《中華人民共和國(guó)獸藥典 獸藥使用指南 化學(xué)藥品卷》的分類，目前獸醫(yī)臨床常用于豬、雞大腸桿菌病防治的藥物主要有β-內(nèi)酰胺類(阿莫西林、頭孢噻呋)、氨基糖苷類(新霉素、安普霉素)、喹諾酮類(恩諾沙星)、磺胺類(磺胺氯噠嗪鈉)、多肽類(硫酸黏菌素)和酰胺醇類(氟苯尼考)，以及其他合成抗菌類藥物(乙酰甲喹)。在長(zhǎng)期抗菌藥選擇進(jìn)化過(guò)程中，大腸桿菌通過(guò)非遺傳性耐藥/藥物耐受[3]和耐藥基因遺傳/轉(zhuǎn)移[4]，從而產(chǎn)生水解酶/鈍化霉、抗菌藥物靶位改變、胞吞/胞吐作用改變、形成生物被膜及細(xì)胞膜通透性改變等變化，進(jìn)而產(chǎn)生抗生素耐藥性。因而，大腸桿菌被視作耐藥性指示菌和耐藥基因庫(kù)被廣泛研究。目前，已有大量關(guān)于動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性相關(guān)基因的研究，但由于各研究者的關(guān)注點(diǎn)不同，研究中所檢測(cè)的耐藥基因也不相同。本文擬根據(jù)耐受抗菌藥物種類，對(duì)這些基因作用機(jī)理及分布情況等方面進(jìn)行綜述，闡明大腸桿菌的耐藥基因類型，分析比較各類耐藥基因在全國(guó)各地的分離檢出率。

1 介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐受的相關(guān)基因

表達(dá)產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactmases，ESBLs)，是大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥最主要的機(jī)制，還可引起對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類藥物、多西環(huán)素和氟苯尼考等藥物耐藥，引發(fā)了科學(xué)界最廣泛的關(guān)注[5]。國(guó)內(nèi)獸醫(yī)界關(guān)注的產(chǎn)ESBLs基因型主要有：TEM、CTX-M、SHV、OXA。

1.1TEM型ESBLsTEM型ESBLs是由TEM-1和TEM-2廣譜酶的編碼基因發(fā)生1～4個(gè)氨基酸突變而形成的一系列蛋白酶。目前，已知的TEM型酶有115種，是目前數(shù)量最多的ESBLs[6-7]。根據(jù)徐英春等[8]的綜述，TEM-1、TEM-2、TEM-13和屬窄譜β-內(nèi)酰胺酶，而TEM-30～36、38～40、44～45、51、59、65、73～78和80屬耐酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺酶，并非ESBLs。關(guān)于動(dòng)物源大腸桿菌中的TEM基因檢測(cè)，國(guó)內(nèi)的研究通常不細(xì)分至亞型。劉雅妮等[9]對(duì)2010～2011年間上海地區(qū)296株豬源大腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果表明，52株產(chǎn)ESBLs菌株中TEM基因和CTX-M基因檢出率分別為88.5%和28.8%。曲志娜等[10]發(fā)現(xiàn)，2012年山東萊西地區(qū)的43株雞源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中CTX-M和TEM基因的檢出率分別為93%和72%。2019年，張明亮等[11]針對(duì)豫北地區(qū)21株豬源大腸桿菌開(kāi)展了TEM-1基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢出率為100%。

1.2CTX-M基因型ESBLsCTX-M基因型ESBLs，是20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一類主要作用于頭孢類藥物的ESBLs。其對(duì)頭孢噻肟的水解能力最高，同時(shí)可水解氨曲南和頭孢曲松，而對(duì)頭孢吡肟的水解力很弱。截至2015年，已知的CTX-M基因型ESBLs已達(dá)160種(http:∥www.lahey.org/studies/，2015年7月關(guān)閉)，按基因同源性其可分為5組[12]：CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9和CTX-M-25。張成東等[13]對(duì)2018年從河南省規(guī)?；i場(chǎng)分離得到的704株大腸桿菌的耐藥基因進(jìn)行了研究，CTX-M、CTX-M-G9和CTX-M-G2的檢出率分別為78.4%、38.4%和69.9%，而CTX-M-G1、CTX-M-G8和CTX-M-G25均未檢出。2015年，楊守深[14]等報(bào)道了在213株閩西地區(qū)豬源大腸桿菌中17.4%的菌株檢出CTX-M-9G基因，且均與耐喹諾酮類基因共存。李進(jìn)福等[4]對(duì)河南地區(qū)31株豬源大腸桿菌的研究表明，CTX-M-U基因檢出率為25.8%，其中CTX-M-1和CTX-M-9亞群菌株均檢出3株。杜向黨等[15]2009年的研究發(fā)現(xiàn)：94株雞源大腸桿菌中，CTM-X型基因攜帶率分別為56.4%，CTX-M-9組26株、CTX-M-2組14株、同時(shí)攜帶CTX-M-9和CTX-M-2組13株；46株豬源大腸桿菌中，25株檢出CTM-X型基因，CTX-M-9組17株、CTX-M-2組7株、同時(shí)攜帶CTX-M-9和CTX-M-2組1株；CTX-M-1、CTX-M-8、CTX-M-25組均未檢出。2016年，張利鋒[16]等發(fā)現(xiàn)山東某雞場(chǎng)及其加工場(chǎng)的373株大腸桿菌中，有54.7%的菌株攜帶CTX-M系列耐藥基因，其中CTX-M-55(屬于CTX-M-G1組)、CTX-M-65和CTX-M-14(屬于CTX-M-G9組)檢出率最高，并檢出同于CTX-M-G9組的CTX-M-27基因。張冬冬等[17]2018年的研究結(jié)果表明，四川地區(qū)29株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中CTX-M的檢出率為100%，如圖1所示，7種亞型的檢出率依次為：CTX-M-65>CTX-M-55>CTX-M-14>CTX-M-79>CTX-M-27>CTX-M-15>CTX-M-123。

圖1 四川地區(qū)7種CTX-M基因亞型的檢出率Fig 1 Ratios of the 7 kinds of CTX-M gene in Sichuan

1.3SHV型基因型ESBLsSHV型β-內(nèi)酰胺酶是由廣譜的SHV-1酶編碼基因發(fā)生1～4個(gè)氨基酸突變而形成的，一系列可不同程度水解頭孢菌素類和氨曲南的蛋白酶。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)39種SHV型酶，其中SHV-1屬窄譜β-內(nèi)酰胺酶。李進(jìn)福等[4]發(fā)現(xiàn)2015年間河南地區(qū)31株豬源大腸桿菌中SHV基因檢出率為61.3%，曲志娜等[10]對(duì)2013年山東萊西地區(qū)分離得到的49株豬源和53株雞源大腸桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的流行基因主要為CTX-M和TEM，而SHV基因非主要流行基因。2016年，張炳亮等[18]等在洛陽(yáng)某豬場(chǎng)分離得到的17株致病性大腸桿菌中均未檢出SHV基因。

1.4OXA型基因型ESBLs 目前已知的OXA型β-內(nèi)酰胺酶有40種，僅16.1%的亞型是從大腸桿菌中分離得到的[11]。OXA-10和OXA-35屬窄譜β-內(nèi)酰胺酶，OXA-23～27屬碳青酶烯酶。2018年，張成東等[13]在河南地區(qū)704株豬源大腸桿菌中，檢出173株攜帶OXA基因的菌株，檢出率低于攜帶CTM-X(552株)和TEM(231株)基因株，高于SHV基因株(18株)。王豪舉[1]對(duì)2014～2016年間重慶地區(qū)分離到854株雞源和493株豬源大腸桿菌進(jìn)行的ESBLs基因分析，發(fā)現(xiàn)盡管僅1株豬源菌單純攜帶OXA-10基因，但攜帶OXA-10基因的菌株占產(chǎn)ESBLs菌株的9.8%，低于TEM株(占比94.5%)和CTX-M株(占比26.7%)，高于SHV株(占比6.9%)。

盡管各研究中時(shí)間、地域、動(dòng)物種類和探討的基因亞型各有不同，總體而言，我國(guó)產(chǎn)ESBLs動(dòng)物源大腸桿菌中TEM和CTX-M為優(yōu)勢(shì)基因型。

除上述4類基因型外，還有關(guān)于PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、DHA、PSE(PSE-1)、BES、STO、TLA等基因的研究報(bào)道[1]。此外，李慶周等[19]在2013～2015年間四川地區(qū)20個(gè)規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)分離得到的367株雞源大腸桿菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)33株產(chǎn)CMY-2的菌株，在這些菌株中TEM-1等耐藥基因的檢出率均在70%以上，且表現(xiàn)出對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸100%的耐藥性。盧亞蘭等[20]分析了2018年浙江和陜西地區(qū)分離得到的2株攜帶NDM-5質(zhì)粒的禽源大腸桿菌的耐藥性，2菌株檢出10種和16種耐藥基因，分別在體外表現(xiàn)出對(duì)10種和12種抗菌藥物耐藥，耐受的藥物包括頭孢他定、頭孢噻呋和氨芐西林等β-內(nèi)酰胺。

2 介導(dǎo)氨基糖苷類抗菌藥物耐受的相關(guān)基因

大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐受的基因研究，主要集中在16S rRNA甲基化酶和3種產(chǎn)氨基糖苷鈍化酶的編碼基因。16S rRNA甲基化酶可使菌體30S核糖體亞單位中16S rRNA位點(diǎn)的某一個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生甲基化，阻斷了氨基糖苷類藥物與作用靶點(diǎn)的結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥性。目前，至少已有rmtA～E、npmA和armA等7種16S rRNA甲基化酶基因被證實(shí)。產(chǎn)氨基糖苷鈍化酶的編碼基因是：產(chǎn)O-腺苷轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside adenylase，AAD)基因、產(chǎn)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside acetytranserase，AAC)基因和產(chǎn)O-磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside phosphotransferase，APH)基因。國(guó)內(nèi)獸醫(yī)學(xué)界關(guān)注的AAC編碼基因亞型最多，包括：aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(3)-Ⅲ、aac(3)-Ⅳ、aac(6')-Ⅰ、aac(6')-Ⅱ、aacA4、aacC2。AAD編碼基因的研究主要集中于aadA1和aadB中，APH編碼基因則主要關(guān)注aph(3’)系列。其中，aph(3’)系列包括aph(2'')、aph(3')-Ⅰ、aph(3')-Ⅱa、aph(3')-Ⅲ、aph(3')-Ⅵ等亞型。

鄧向東[21]分析了2012-2013年間四川地區(qū)134株豬源和雞源大腸桿菌中rmtA～rmtE、npmA和armA等7種16S rRNA甲基化酶基因，僅5株菌株檢出rmtB基因，其它6種16S rRNA甲基化酶基因均未檢出。劉河冰[22]檢測(cè)了2008年間河南鄭州地區(qū)120株雞源大腸桿菌中6種16S rRNA甲基化酶基因，結(jié)果表明僅檢出armA和rmtB基因，兩者檢出率分別為2.5%和7.5%。

2009年，孫金福等[23]對(duì)遼寧地區(qū)27株禽源大腸桿菌進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)apH(3’)-Ⅱ、aadA1和aacA4基因檢出率分別為55.6%、44.4%和27.8%。2005年，馬孟根等[24]分析比較了四川地區(qū)22株豬源和雞源大腸桿菌中aadA1、aadA2、aadB、apH(3’)-Ⅱ和acc(3)-Ia五種基因的攜帶率，結(jié)果表明aadA1和apH(3’)-Ⅱ?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因，兩者檢出率分別為59.1%和54.5%，acc(3)-Ia未檢出。朱永江等[25]所檢測(cè)的2015-2016年間揚(yáng)州地區(qū)分離得到的40株豬雞源大腸桿菌中，aac(3)-Ⅱ和aac(6’)-Ib的檢出率分別為17.5%和2.5%。

在多族耐藥基因比較的研究中，張炳亮[18]的研究結(jié)果顯示2016年洛陽(yáng)地區(qū)17株豬源大腸桿菌aac(3)-Ⅱ基因檢出率88.2%，高于其他所測(cè)試的β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥基因。2019年，張明亮[11]等的研究發(fā)現(xiàn)aadA1和aph(3’)-Ⅱa的檢出率分別為57.1%和76.2%，低于其所試的2種四環(huán)素和1種β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，但高于酰胺醇類和磺胺類耐藥基因。

3 介導(dǎo)喹諾酮類抗菌藥物耐受的相關(guān)基因

對(duì)喹諾酮類耐藥基因的研究主要集中于：質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基質(zhì)(plasmid mediated quinolone resistance，PMQR)和喹諾酮作用靶位基因決定區(qū)的突變基因(Quinolone resistance determining regions，QRDQ)。其中，PMQR基因族又主要包括qnr系列、aac(6’)-Ib-cr、oqxA/B和qepA。嚴(yán)格地，oqxAB和qepA均是質(zhì)粒介導(dǎo)的外排泵基因[26]。

qnr基因通過(guò)保護(hù)DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ不受藥物的抑制來(lái)降低菌體對(duì)喹諾酮類藥物敏感性，已有報(bào)道的qnr主要包括qnrA、B、S、C、D、VC等。楊守深等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在2015年福建地區(qū)分離得到的213株豬源大腸桿菌中37株檢出CTX-M-9G基因，97.3%的菌株還攜帶有qnr基因，其中qnrS、qnrB和qnrA基因檢出率分別為73.0%、37.8%和5.4%，oqxA、oqxB和qepA的檢出率則依次為70.3%、75.7%和18.9%。aac(6’)-Ib-cr基因易被誤讀為EBSLs編碼基因，其中“-cr”系指環(huán)丙沙星耐藥(Ciprofloxacin resistance)，是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的新型變異基因編碼的滅活酶。南海辰等[27]對(duì)2010～2013年間新疆地區(qū)的183株畜源大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果表明，aac(6’)-Ib-cr的檢出率呈現(xiàn)出一定的動(dòng)物種屬差異，豬、羊和牛源的檢出率分別為5.0%、22.9%和12.5%。由于豬源、羊源和牛源大腸桿菌菌株數(shù)分別為79株、96株和8株，aac(6’)-Ib-cr在不同物種間檢出率的差異可能受樣本量影響。

喹諾酮類藥物作用靶位是DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，DNA促旋酶由gyrA和gyrB基因編碼，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ則由parC和parE基因編碼。因而，QRDQ系列基因的研究圍繞這4個(gè)基因開(kāi)展。張艷芳等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，DNA促旋酶的GyrA和GyrB亞基上發(fā)生的氨基酸替代與喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。張秀英[29]等利用中藥處理耐喹諾酮類藥物的大腸桿菌，可使GyrA和ParC亞基從耐藥狀態(tài)恢復(fù)至敏感狀態(tài)。

4 介導(dǎo)四環(huán)素類抗菌藥物耐受的相關(guān)基因

已知的四環(huán)素類耐藥基因，根據(jù)其耐藥機(jī)制可分為3大類[30-31]：①外排泵基因，通過(guò)編碼膜相關(guān)蛋白，加速四環(huán)素排出細(xì)胞漿外。包括：tet(A)～tet(E)、tet(G)、tet(H)、tet(J)、tet(K)、tet(L)、tet(V)、tet(Y)、tet(Z)、tet(30)、tet(31)、tet(33)、tet(35)、tet(38)、tet(39)、otr(B)、otr(C)、tcr和tetA(P)。②核糖體保護(hù)蛋白基因，通過(guò)編碼核糖體保護(hù)蛋白，使核糖體免受四環(huán)素作用。包括：tet(M)、tet(O)、tet(Q)、tet(S)、tet(T)、tet(W)、tet(32)、otr(A)和tetP(B)。③滅活/鈍化四環(huán)素基因，通過(guò)編碼滅活或鈍化四環(huán)素的酶而發(fā)揮作用。包括：tet(X)、tet(34)和tet(37)。

2018年，王學(xué)君[31]對(duì)貴州地區(qū)783株豬源大腸桿菌中四環(huán)素耐藥基因攜帶率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)tetA、tetB、tetC和tetD等4種外排泵基因檢出率分別為92.6%、41.5%、58.8%和58.6%，核糖體保護(hù)蛋白基因tetM的檢出率為70.1%，滅活/鈍化四環(huán)素基因tetX的檢出率為78.8%。李進(jìn)福等[4]對(duì)2015年間河南地區(qū)31株豬源大腸桿菌的外排泵基因(tetA、tetB、tetC、tetK、tetL)和核糖體保護(hù)蛋白基因(tetM、tetO、tetW)兩類耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，tetA和tetM基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因，兩者檢出率分別為87.1%和54.8%。6株tetL基因檢測(cè)陽(yáng)性，tetC和tetO各有1株呈陽(yáng)性，未檢出tetB、tetK和tetW基因。在張炳亮[18]等2015年的研究中，豬源大腸桿菌中tetA檢出率為70.6%，而tetC則未檢出。2018年，李蘊(yùn)玉等[32]對(duì)唐山和秦皇島地區(qū)22株雞源大腸桿菌中tetA和tetB基因進(jìn)行了檢測(cè)，兩者的檢出率均在80%以上。2016年，張雅為等[33]在遼寧阜新地區(qū)33株雞源大腸桿菌中tetB、tetC、tetM、tetK和tetL等5種四環(huán)素耐藥基因分析中，33.3%菌株檢出tetK基因，tetL、tetB、tetC、tetM檢出率在15%～30%之間，tetA基因均未檢出。

5 介導(dǎo)酰胺醇類抗菌藥物耐受的相關(guān)基因

關(guān)于酰胺醇類耐藥基因的研究主要集中在cat、clmA和flor三種基因，此外還有一些關(guān)于fexA、cfr、pexA和estdl136的報(bào)道。cat基因負(fù)責(zé)編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使菌體對(duì)氯霉素和甲砜霉素耐藥，但對(duì)氟苯尼考沒(méi)有作用。cat基因可以分為A型和B型，其中A型又有catⅠ～Ⅳ、catA～D、catP、catS、catQ等16種亞型，B型有cat和catB2種亞型。cmlA和flor均是外排泵蛋白基因，前者只介導(dǎo)氯霉素和甲砜霉素耐藥，而后者則還可以介導(dǎo)對(duì)氟苯尼考耐藥[34]。

2019年，張明亮[11]等在豫北地區(qū)21株豬源大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)4株cat1基因陽(yáng)性，檢出率19.0%。同年，吳方達(dá)[35]發(fā)現(xiàn)福建地區(qū)的17株耐氟苯尼考的大腸桿菌，floR基因檢出率為100%。羅永乾[34]對(duì)2014～2016年間重慶地區(qū)393株雞源、194株豬源和108株牛源大腸桿菌中cat、clmA、flor、pexA、cfr、fexA和fexB基因進(jìn)行了檢測(cè)，695株菌中各基因總的檢出率依次為：flor(58.7%)>cat(37.0%)>cfr(0.9%)，pexA、fexA和fexB均未檢出。

6 介導(dǎo)多粘菌素耐受的相關(guān)基因

大腸桿菌耐多粘菌素基因包括：arnBCDTEF基因和mcr系列基因。arnBCDTEF(亦作pmrHFIJKLM)操縱子，其通過(guò)脂質(zhì)A的共價(jià)修飾，減少菌體細(xì)胞外膜的凈負(fù)電荷，從而降低對(duì)帶正電荷的多粘菌素的吸附。mcr系列基因?qū)倭姿嵋掖及忿D(zhuǎn)移酶編碼基因，同樣通過(guò)減少菌體細(xì)胞外膜的凈電荷而產(chǎn)生耐藥性[36]。自2015年沈建忠院士團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道m(xù)cr-1以來(lái)，先后又發(fā)現(xiàn)了mcr2～mcr5等基因[37]，但獸醫(yī)學(xué)界尚主要關(guān)注mcr-1基因。祝瑤[36]對(duì)2016年?yáng)|三省732株動(dòng)物源大腸桿菌進(jìn)行了mcr-1基因攜帶率檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)mcr-1基因在294株雞源大腸桿菌中的檢出率為15.3%，255株豬源菌株中檢出率為9.4%。

7 介導(dǎo)磺胺類抗菌藥物耐受的相關(guān)基因

磺胺類藥物主要作用于細(xì)菌的二氫蝶酸合成酶(Dihydropteroate synthase，DHFAS)。因而，對(duì)大腸桿菌磺胺類藥物耐藥的研究主要集中于DHFAS突變基因folp及DHFAS替代基因。獸醫(yī)學(xué)界主要關(guān)注于后者中的sul1、sul2和sul3基因亞型。2018年，方結(jié)紅[38]對(duì)浙江地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)分離得到的350株大腸桿菌的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，34株菌檢出sul1、sul2和sul3基因。其中，17株菌存在2～3種基因共存，sul1、sul2和sul3基因?qū)﹃?yáng)性菌株的貢獻(xiàn)率分別為58.8%、47.1%和38.2%。李慶周[19]等發(fā)現(xiàn)在2013～2015年間四川地區(qū)20個(gè)規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)分離得到的產(chǎn)CMY-2的大腸桿菌中，sul1、sul2和sul3基因檢出率為84.8%、72.7%和36.4%。

8 介導(dǎo)多重藥物耐受的相關(guān)基因

除前述的7類藥物的耐藥基因外，國(guó)內(nèi)獸醫(yī)學(xué)界還對(duì)cfr(chloramphenicol-florfenicol resistance)基因、外膜通道蛋白和被膜等有關(guān)的耐藥性編碼基因進(jìn)行了研究。

cfr基因，是因耐受氟苯尼考和氯霉素而得名的2kb左右的小基因，但后經(jīng)證實(shí)其可通過(guò)產(chǎn)物-甲基化轉(zhuǎn)移酶使藥物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，而可同時(shí)介導(dǎo)五類抗生素耐藥。除cfr基因外，大腸桿菌中還存AcrR和Mar等與多重耐藥有關(guān)的基因[39]。AcrAB、ACREF、EmrAB、Ecr和QacE等均需于大腸桿菌的主動(dòng)外排系統(tǒng)，其中AcrAB-TolC外排系統(tǒng)是最主要的。AcrR、MarA、MppA、SdiA、Rob和SoxS等調(diào)控基因因子，可作用于AcrAB-TolC外排系統(tǒng)，調(diào)節(jié)大腸桿菌的外排效能，形成耐藥。馬紅霞等對(duì)rob[40]、SdiA[41]基因的研究表明，這2種基因的高水平表達(dá)時(shí)，均可形成多重耐藥。

MdtM編碼一種大腸桿菌細(xì)胞膜蛋白，可非特異性增加抗菌藥物的泵出效率，從而介導(dǎo)多重耐藥。劉嬋嬋[37]在81株人源大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)54株攜帶有MdtM基因的菌株，表現(xiàn)出多重耐藥性。ompF編碼大腸桿菌外膜蛋白(OMPs)中的一種親水性非特異孔道蛋白，王藝凝等[42]的研究表明ompF基因通過(guò)對(duì)被膜及排出泵的作用，而影響大腸桿菌的耐藥性水平。

9 展 望

綜上所述，大腸桿菌不同的耐藥表型對(duì)應(yīng)不同的耐藥基因，同樣的耐藥表型也可能對(duì)應(yīng)不同的耐藥基因，因而在研究目標(biāo)區(qū)域流行的耐藥基因時(shí)，需注意三方面因素的影響：首先，各類藥物耐藥機(jī)制和基因亞型均具多樣性，選擇哪些基因進(jìn)行研究分析就顯得尤為重要。其次，從微觀層面的基因、蛋白表達(dá)，到宏觀的耐藥表型，還有很多因素在發(fā)揮影響，尤其是當(dāng)目標(biāo)菌株已表現(xiàn)出多重耐藥時(shí)，耐藥基因與表型是否完全一一對(duì)應(yīng)，需審慎地總結(jié)。其三，因指示菌與致病菌/繼發(fā)感染菌的差異、藥物劑型/佐劑的差異等諸多因素影響，體外試驗(yàn)的耐藥性與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果并不完全一致。

國(guó)內(nèi)獸醫(yī)學(xué)界對(duì)動(dòng)物源大腸桿菌各類耐藥性相關(guān)基因進(jìn)行深入研究。其中，β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類的相關(guān)耐藥基因研究較多。氨基糖苷類和四環(huán)素類藥物很少用于畜禽大腸桿菌感染的防治，但兩類藥物的耐藥基因檢出率很高，這可能與2方面原因有關(guān)：1、依據(jù)原《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第168號(hào)》，氨基糖苷類的越霉素A預(yù)混劑、潮霉素B預(yù)混劑、硫酸安普霉素預(yù)混劑、鹽酸林可霉素及硫酸大觀霉素預(yù)混劑、硫酸新霉素預(yù)混劑、硫酸安普霉素；四環(huán)素類的土霉素鈣和金霉素(飼料級(jí))預(yù)混劑，允許作為促動(dòng)物生長(zhǎng)使用。在長(zhǎng)期低劑量的四環(huán)素類藥物壓力作用下，與動(dòng)物共生的大腸桿菌自身產(chǎn)生了耐藥性。2、其他種類細(xì)菌產(chǎn)生的相關(guān)耐藥基因，通過(guò)質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)遺傳元件橫向遷移至大腸桿菌內(nèi)，再通過(guò)繁殖擴(kuò)增，使這些耐藥基因得以縱向傳播。

隨著國(guó)家獸藥規(guī)范化使用行動(dòng)和遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性行動(dòng)的逐步實(shí)施與推進(jìn)，《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)》等法規(guī)的相繼頒布與實(shí)施，以及養(yǎng)殖主體生物防控意識(shí)的不斷增強(qiáng)，動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性必將逐步減輕。