3株豬源綠色氣球菌的分離鑒定

錢麗敏，何依蓉，陳夢婷，陳培富

(云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，昆明 650201)

氣球菌屬介于葡萄球菌屬和鏈球菌屬之間，其模式種為綠色氣球菌(Aerococcusviridans)[1]，還包括尿道氣球菌、柯氣球菌、血氣球菌和人尿氣球菌[2]。綠色氣球菌是一類重要的機會致病菌[3]，廣泛存在于自然界，如空氣、土壤、動植物以及健康動物體表，若未做好消毒，可隨空氣和粉塵傳播。綠色氣球菌也被視為一種人獸共患病原菌，當人和動物機體免疫力水平降低、免疫功能不健全以及體表產(chǎn)生開放性外傷時，可引起人尿道感染、心內(nèi)膜炎、主動脈假性動脈瘤及皮膚血管炎等疾病[4-6]。據(jù)報道[7]，綠色氣球菌感染可增加豬患其他感染性疾病的風險，最終導致仔豬生長發(fā)育受阻，出欄時間延遲，乃至引起死亡，造成重要經(jīng)濟損失。

近年，云南省不同地區(qū)3個豬場陸續(xù)發(fā)生多起仔豬非急性死亡病例，患病仔豬均表現(xiàn)出明顯的四肢運動障礙。2015年3月芒市某小型豬場仔豬群發(fā)病，前期表現(xiàn)發(fā)熱和呼吸困難，呈犬坐姿勢，后期腹瀉和四肢僵直，死亡率高達10%，病理剖檢見胸腔有積液、肝臟有腫塊、肺臟呈蝦肉樣病變，與胸膜粘連，肺組織經(jīng)PCR擴增檢出豬肺炎支原體陽性。2018年4月富民縣某豬場部分2月齡仔豬出現(xiàn)生長緩慢，肌肉震顫，后期出現(xiàn)體溫升高、全身皮膚潮紅，跛行，無法站立，按壓背部及臀部肌肉表現(xiàn)疼痛，經(jīng)青霉素連續(xù)治療4 d，無效死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)頜下淋巴結(jié)顯著腫大。2019年1月祿勸縣某養(yǎng)豬場發(fā)生溫和型豬瘟(取白細胞經(jīng)RT-PCR擴增檢測豬瘟病毒核酸呈陽性)，病豬全身體表發(fā)紅，精神沉郁，肌肉震顫，關節(jié)腫脹，死前口鼻流血。為確定以上3個豬場仔豬發(fā)生四肢運動障礙的病原因素，無菌采集病死仔豬內(nèi)部組織樣品進行病原檢測，為防控此類疾病提供必要的參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 病料來源 分別從上述各豬場發(fā)病期間采集病豬組織樣品。芒市小型豬場無菌采集病死仔豬脾臟、肝臟和肺臟各5份；富民縣某豬場無菌采集病死仔豬肝臟、脾臟、頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)及心包積液各2份；祿勸縣某養(yǎng)豬場采集3月齡患病仔豬抗凝血液2份。

1.2 主要試劑 小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Lot：EG101-01)購自北京全式金生物技術有限公司，DH5α感受態(tài)大腸桿菌細胞(Lot：CB101)購自天根生化科技有限公司，胰蛋白酶大豆胨綿羊血瓊脂等細菌培養(yǎng)基由實驗室自行配制。

1.3 儀器設備 PCR 儀(型號EDC-810)購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；高速離心機(型號H1650-W)購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號GELDOC-XR)購自BIO-RAD；電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號303-S)購自滬南試驗儀器廠；超低溫冰箱購自日本SANYO 公司；立式壓力蒸汽滅菌器(型號YXQ-50SII)購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

2 方 法

2.1 細菌分離培養(yǎng) 無菌取病變組織或體液涂布綿羊血瓊脂、LB瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落繼續(xù)做劃線培養(yǎng)，直至形成外觀形態(tài)完全一致的菌落，隨機挑取單菌落少許菌樣做革蘭染色，鏡檢并記錄細菌個體形態(tài)。

2.2 生化試驗 對細菌純培養(yǎng)物進行葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、山梨醇、棉籽糖、七葉苷、乙酰甲基甲醇(VP)等生化試驗。37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄反應結(jié)果。挑取經(jīng)液體培養(yǎng)的細菌置于兩張潔凈玻片上，一張滴加少量現(xiàn)配的3% H2O2溶液，另一張滴加蒸餾水作為對照，觀察觸酶試驗結(jié)果。

2.3 分離菌株16S rRNA基因序列測定 取1 mL新鮮培養(yǎng)菌液12000 r/min離心5 min棄上清，留取沉淀，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株DNA，以其為模板進行16S rRNA基因的PCR擴增。16S rRNA基因通用引物[8](上游引物：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物：5′-CGG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸反應10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物做TA克隆，隨機取白色菌落樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將所獲基因片段序列于NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，選取同源性最高的7條序列(GenBank：CP014164、CP046334、GQ161096、HQ465288、KU922464、MG576151、MN932266)為參考序列，應用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 藥敏試驗 選用9種獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物，以紙片擴散法(K-B法)測定菌株敏感性。取純培養(yǎng)菌液150 μL均勻涂布于M-H瓊脂平板表面，每個平板貼4～5片藥敏片，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，按說明書判定菌株敏感性。

3 結(jié)果與分析

3.1 細菌分離培養(yǎng) 芒市脾臟樣品、富民縣肝臟和淋巴結(jié)樣品、祿勸縣血液樣品在血瓊脂均只形成白色圓形、隆起光滑、直徑約1 mm并產(chǎn)生明顯溶血環(huán)的菌落(圖1)，轉(zhuǎn)種LB瓊脂，均形成光滑、平整的灰白色小菌落(圖2)。分離菌株依次命名為ASV-1、ASV-2和ASV-3。革蘭染色鏡檢為陽性球菌，可見四聯(lián)、成團塊狀排列，也有單個或成雙排列(圖3)。

圖1 血瓊脂菌落形態(tài)Fig 1 The morphology of colonies on blood agar

圖2 LB瓊脂菌落形態(tài)Fig 2 The morphology of colonies on LB agar

圖3 革蘭染色(1000×)Fig 3 The Gram stain(1000×)

3.2 生化鑒定 3個菌株都分解葡萄糖、蔗糖、木糖、山梨醇;不分解麥芽糖、棉籽糖、蕈糖、七葉苷、水楊苷，VP試驗為陰性，不還原硝酸鹽。觸酶試驗均為陰性。

3.3 16S rRNA基因擴增及測序結(jié)果 將所獲3個菌株的16S rRNA基因序列擴增產(chǎn)物分別通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均在1500 bp左右處出現(xiàn)單一的光亮條帶(圖4-圖6)，與預期擴增產(chǎn)物大小相符。

M:DL2000 DNA Marker；1-2:菌株ASV-1圖4 菌株ASV-1 16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物Fig 4 The PCR amplicon of ASV-1 16S rRNA gene

M:DL2000 DNA Marker；1-3:菌株ASV-2圖5 菌株ASV-2 16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物Fig 5 The PCR amplicon of ASV-2 16S rRNA gene

M:DL2000 DNA Marker；1:菌株ASV-3圖6 菌株ASV-3 16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物Fig 6 The PCR amplicon of ASV-3 16S rRNA gene

3.4 系統(tǒng)進化分析 所獲3個分離菌株16S rRNA基因序列經(jīng)BLAST分析，顯示與GenBank收錄的7株綠色氣球菌參考菌株的同源性均在99%以上，據(jù)此將其判定為綠色氣球菌。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示3個分離菌株高度相似，且與印度分離株MG576151的遺傳距離最近(圖7)。

圖7 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 7 The 16S rRNA gene-based phylogenetic tree

3.5 藥敏試驗結(jié)果 表1結(jié)果顯示：3個菌株均對頭孢曲松、恩諾沙星、青霉素、氟苯尼考、克拉霉素、呋喃唑酮敏感，對卡那霉素、慶大霉素、復方新諾明等藥物不敏感。

表1 藥敏實驗結(jié)果Tab 1 The results of drug susceptibility tests

4 討論與結(jié)論

近些年，綠色氣球菌感染動物機體造成的危害引起人們逐步重視。越來越多的研究表明，綠色氣球菌可以感染多種動物，國外主要從水產(chǎn)動物中分離到綠色氣球菌，如龍蝦、鰲蝦[9]；國內(nèi)報道最多的主要是人和仔豬的感染，從山羊、奶牛及竹鼠中也分離到綠色氣球菌[10-12]，可見此菌感染的宿主范圍很廣。Clark等[9]研究發(fā)現(xiàn)，綠色氣球菌的強毒株莢膜對美洲龍蝦有強致病力；Liu等[11]從患乳房炎的奶牛乳汁中分離到綠色氣球菌，并發(fā)現(xiàn)此菌具有粘附和侵襲乳腺上皮細胞的能力。Sun等[13]也發(fā)現(xiàn)，夏季由綠色氣球菌引起乳腺炎的比率最高，表明此菌是引起奶牛亞臨床乳腺炎的重要病原。當然，綠色氣球菌的致病性差異可能與菌株毒力和宿主種類有關。

本試驗所獲3株綠色氣球菌分別源自云南省不同地區(qū)、不同年份的3個養(yǎng)豬場，證實此菌廣泛存在于養(yǎng)豬環(huán)境，但未見其單獨有強致病力的報道。Pan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從患病仔豬的關節(jié)液、腦脊液和肺臟中分離到豬鏈球菌和綠色氣球菌，兩種病原菌混合感染可引起仔豬和小鼠急性腦膜炎，且兩種病原菌“協(xié)同作用”引起小鼠的死亡率顯著高于單一病原菌引起的死亡率。這3個豬場患病仔豬雖然均表現(xiàn)肢體運動障礙，其他臨床癥狀不盡相同，可能與其原發(fā)性感染疾病不同有關。根據(jù)疾病前期或同期的核酸檢測結(jié)果，可以判定芒市病例發(fā)生的原發(fā)性感染為豬支原體肺炎，祿勸縣病例則由豬瘟病毒(CSFV)引起原發(fā)性感染。富民縣病例未及時做其他病原檢測，但出現(xiàn)天生痙攣癥和“僵豬”樣狀態(tài)，這是CSFV垂直傳播引起先天感染的典型特征。CSFV具有淋巴細胞及上皮細胞嗜性，是引起豬免疫力下降而繼發(fā)感染其他病原菌的主要因素。韓慶安等指出CSFV與其他病原體的混合感染非常普遍，與CSFV發(fā)生混合感染的病原體主要見于仔豬群及流產(chǎn)胎兒但在發(fā)育正常的育肥豬群中未檢測到[15]。此外，所處地理位置、氣候因素及養(yǎng)殖環(huán)境不同的養(yǎng)殖場，引起繼發(fā)感染的機會致病菌種類可能差異，本研究發(fā)現(xiàn)的是綠色氣球菌感染。富民縣發(fā)病仔豬雖采用分離菌株敏感的青霉素治療，但仍死亡，可能因為感染已導致器官功能衰竭。Marein等[16]從不同患病豬關節(jié)液、腦積液及肺臟中分離到58株綠色氣球菌，指出該菌可能是豬的致病菌；但劉潔等分離出的8株綠色氣球菌，并未引起正常小鼠的發(fā)病或死亡[17]，進一步表明該菌為機會致病菌。

目前，綠色氣球菌引起動物發(fā)病的相關機理尚不清楚，但凡能降低動物免疫功能的因素，如營養(yǎng)不良、天氣驟變、免疫抑制病毒感染、應激反應等，都有可能引起綠色氣球菌等機會致病菌的感染[18]。鑒于所調(diào)查病豬普遍預后不良，預防或消除導致免疫力下降的原發(fā)性感染才是避免或控制綠色氣球菌機會感染的根本辦法。

本研究從不同年份、不同地區(qū)的3個豬場病料中均只分離到綠色氣球菌，提示其存在重要的致病性，并有必要深入調(diào)查其毒力因子、感染途徑以及造成繼發(fā)感染的前置或協(xié)同因素，以設法減少該菌感染引起的經(jīng)濟損失。