阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究

孫 濤，張婷婷，王 巖

(1. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū)石河子 832000；2. 八師石河子總醫(yī)院(石河子大學(xué)第三附屬醫(yī)院，石河子市人民醫(yī)院)，新疆維吾爾自治區(qū)石河子 832000；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū)石河子832000；4.石河子大學(xué)畜牧學(xué)博士后流動(dòng)站，新疆維吾爾自治區(qū)石河子 832000)

生物體免疫系統(tǒng)分為固有免疫(又稱先天免疫)和適應(yīng)免疫(又稱獲得性免疫)。而昆蟲(chóng)體內(nèi)缺乏脊椎動(dòng)物所特有的獲得性免疫，沒(méi)有誘導(dǎo)產(chǎn)生高度專一性抗體的淋巴系統(tǒng)，只能依賴固有免疫來(lái)抵御細(xì)菌、真菌、病毒等外源病原物的侵襲(初源等, 2013; Hoffmann, 2013)。昆蟲(chóng)的血液兼有脊椎動(dòng)物血液和淋巴液的特點(diǎn)，因此，稱之為“血淋巴”。昆蟲(chóng)自身的免疫防御反應(yīng)也主要由血淋巴承擔(dān)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫(Hillyer and Strand, 2014)。血細(xì)胞是細(xì)胞免疫應(yīng)答(Cellular immune response)的主要執(zhí)行者，主要包括吞噬(Phagocytosis)、形成結(jié)節(jié)(Nodule)、包裹(Encapsulation)、黑化(Melanization)等，其中漿血胞和粒血胞是參與這類反應(yīng)的主要細(xì)胞，具有快速反應(yīng)和抵御感染的功能，在發(fā)育過(guò)程中參與清除凋亡細(xì)胞，以及吞噬和包裹病原體(吳姍和凌爾軍, 2009)。另外，在昆蟲(chóng)的新陳代謝和變態(tài)發(fā)育過(guò)程中，血液循環(huán)還擔(dān)負(fù)著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、昆蟲(chóng)蛻皮、羽化及處理自身組織降解和凋亡細(xì)胞更迭的重?fù)?dān)(Marmaras and Lampropoulou, 2009; Hillyer, 2016)。

昆蟲(chóng)種類繁多,細(xì)胞形態(tài)多樣，循環(huán)血細(xì)胞的數(shù)量和大小與昆蟲(chóng)的蟲(chóng)態(tài)和齡期密切相關(guān)，不同物種之間的細(xì)胞類型存在差異，即使相同的物種，因所觀察昆蟲(chóng)的發(fā)育階段和處理方式不同，各類細(xì)胞所占比例也有所不同(劉崇樂(lè)和傅貽玲, 1964; Ribeiro and Brehelin, 2006; 王強(qiáng), 2012)。其中，作為昆蟲(chóng)血淋巴細(xì)胞中主要類型的漿血胞和粒血胞，在不同昆蟲(chóng)種類之間的占比也有所區(qū)別。比如直翅目的意大利蝗Calliptamusitalicus(何嵐等, 2017)和黑翅痂蝗Bryodemanigroptera(任彩紅等, 2014a)血細(xì)胞種類以粒血胞為主，分別占細(xì)胞總數(shù)的42.04%和57.3%；而雙翅目的黑水虻Hermetiaillucens幼蟲(chóng)(毛敏等, 2017)和鞘翅目的巨型瓢蟲(chóng)Anisolemniadilatata(Majumderetal., 2017)則是漿血胞占主要優(yōu)勢(shì)，達(dá)到細(xì)胞總數(shù)的50%以上。在鱗翅目昆蟲(chóng)血淋巴中，粒血胞所占比例較大，例如小金蝠蛾Thitarodesxiaojinensis幼蟲(chóng)粒血胞占比高達(dá)62.5%(倪若堯等, 2018)，亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis幼蟲(chóng)中的粒血胞占比56%(梁子才和程振衡, 1991)。目前多數(shù)研究者普遍認(rèn)同將鱗翅目昆蟲(chóng)血細(xì)胞分為原血胞、漿血胞、粒血胞、類絳色細(xì)胞和珠血細(xì)胞5種常見(jiàn)的血細(xì)胞類型(Jones, 1977; 傅貽玲, 1982)。如亞洲玉米螟(梁子才和程振衡, 1991)、舞毒蛾Lymantriadispar(Butt and Shields, 1996)、煙草天蛾Manducasexta(Beetzetal., 2008)、家蠶Bombyxmori(Lingetal., 2003)、金銀花尺蠖Heterolochajinyinhuaphaga(向玉勇等, 2014)和小金蝠蛾(倪若堯等, 2018)等，其中起免疫應(yīng)答的主要是漿血胞和粒血胞(Jiangetal., 2010)。任彩紅(2014b)對(duì)中華稻蝗Oxyachinensis的研究發(fā)現(xiàn)除上述常見(jiàn)血細(xì)胞類型外還包括囊血胞、脂血胞、蠕形細(xì)胞、足形細(xì)胞、巨核血細(xì)胞等較為少見(jiàn)的細(xì)胞類型，這類細(xì)胞多數(shù)由漿血胞發(fā)育而來(lái)，但這些細(xì)胞類型又并不同時(shí)存在于所有昆蟲(chóng)中，而是有的來(lái)源于其它細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，有的則處于細(xì)胞崩解的前期(Gupta and Sutherland, 1966)。

此外，鱗翅目昆蟲(chóng)已成為評(píng)估病原微生物毒力或抗菌劑效果的普遍選擇，如家蠶(Gongetal., 2014)、煙草天蛾(Deanetal., 2004)和大蠟螟Galleriamellonella(Altuntaetal., 2012; Kryukovetal., 2020)等模式生物被廣泛用來(lái)研究不同種類細(xì)菌、真菌或其他病原體感染對(duì)血細(xì)胞基因表達(dá)、形態(tài)和數(shù)量的影響。當(dāng)異源性物質(zhì)進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)后,細(xì)胞免疫反應(yīng)也會(huì)使血細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)等發(fā)生變化。另外，昆蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物的固有免疫系統(tǒng)有許多相似之處，兩者都有類似的吞噬特性(Hartenstein, 2006; Browneetal., 2013)。例如，昆蟲(chóng)的漿血胞和粒血胞通常被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物固有免疫細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞(Tojoetal., 2000)。Mukherjee等(2013)用大蠟螟幼蟲(chóng)研究李斯特菌感染對(duì)大腦的影響，與在感染該細(xì)菌的哺乳動(dòng)物身上觀察到了相似的病理學(xué)特征。這也許能進(jìn)一步推進(jìn)昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物之間免疫學(xué)的相似性研究，并隨著研究的進(jìn)展將更多的昆蟲(chóng)作為研究與人類相關(guān)疾病的模型。因此，有必要對(duì)更多種類的昆蟲(chóng)血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行研究，在豐富其形態(tài)分類的同時(shí)為揭示其細(xì)胞免疫功能提供依據(jù)。

阿爾泰蝠蛾HepialusaltaicolaWang隸屬于鱗翅目Lepidoptera蝙蝠蛾科Hepialidae蝠蛾屬Hepialus，是新疆蟲(chóng)草菌Ophiocordycepsgracilis的寄主昆蟲(chóng)，僅分布于海拔在1 000 m以上的阿爾泰山。二者形成的蟲(chóng)菌復(fù)合體即新疆蟲(chóng)草，其成分和主要功效與冬蟲(chóng)夏草Ophiocordycepssinensis近似，在經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值上具有重要地位(索菲婭等, 2008)。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)阿爾泰蝠蛾的研究主要集中在生物學(xué)特性方面，包括生殖規(guī)律的觀察(趙恒等, 1998a)、幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)(趙恒等, 1998b)及活蛹的無(wú)損鑒別(王巖等, 2018)等，對(duì)其血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用Wright-Giemsa染色法，對(duì)阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察和分類計(jì)數(shù)，試圖明確其細(xì)胞類型，以期為研究阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞分類和功能提供試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為其細(xì)胞免疫的研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)采自新疆阿勒泰地區(qū)布爾津縣林場(chǎng)的芍藥叢下(海拔1 260 m)。發(fā)掘幼蟲(chóng)的同時(shí)收集棲身的土壤作為飼養(yǎng)土，一并帶回實(shí)驗(yàn)室。幼蟲(chóng)飼養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中(MGC-250P型，上海一恒)，飼養(yǎng)溫度為12±1℃，相對(duì)濕度50%～60%，光周期16 L∶8 D。選取健康且頭寬、體寬、體長(zhǎng)及體重近似的5齡幼蟲(chóng)供試。

1.2 試劑和儀器

Wright-Giemsa染色液(珠海貝索生物科技有限公司)、人造香柏油、無(wú)水甲醇、二甲苯、鑷子、載玻片、推片、解剖針、微量毛細(xì)管、光學(xué)顯微鏡(蔡司Zeiss AX-10，日本)。

1.3 阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞涂片制作與觀察

取阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)5頭，無(wú)菌水清洗后吸水紙巾擦干，用解剖針將其腹部刺破，一次性微量毛細(xì)管各取少量血淋巴(2～3 μL)，滴在潔凈的載玻片上，每頭幼蟲(chóng)制備3張血片。參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第四版)(尚紅等, 2015)的血涂片制備的方法，用推片器涂成血膜，血涂片外觀頭、體、尾分明，分布均勻且薄厚適宜。先用無(wú)水甲醇固定，待自然干燥后用Wright-Giemsa染液A液將血膜面充分覆蓋，稍等片刻(約30 s)再等比例滴加緩沖液B液，洗耳球輕輕吹勻鋪平，至膜面上染色液混合并形成表面張力，染色10～15 min后自來(lái)水緩緩沖洗，晾干封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。采用圖像采集分析軟件(Image view)進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)、測(cè)量。再利用圖像處理軟件Image J(National institutes of health, USA)，根據(jù)標(biāo)尺上單位長(zhǎng)度的圖像像素?cái)?shù)量和測(cè)量體征長(zhǎng)度所對(duì)應(yīng)的像素?cái)?shù)量進(jìn)行等比換算，求出所測(cè)體征長(zhǎng)度。

1.4 阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)各類血細(xì)胞所占比例統(tǒng)計(jì)

將制備好的血涂片置于顯微鏡下，選取血涂片體尾交界處細(xì)胞展開(kāi)良好、分散均勻的部位進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。參照醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法》(WS/T 246-2005)和美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)頒發(fā)的有關(guān)血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法(H20-A)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，按一定方向有規(guī)律的移動(dòng)視野，采用“城垛式”進(jìn)行觀察(圖1)，以避免重復(fù)或遺漏，同時(shí)避免主觀選擇視野。在油鏡下根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征，每張血涂片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，然后分類求得各類細(xì)胞的比值(百分率)。

圖1 外周血涂片制備及“城垛式”觀察Fig.1 Preparation of peripheral blood smears and observation of “battlements”注：參照《白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法》。Note: Refer to “Reference Leukocyte Differential Count Method”.

2 結(jié)果與分析

2.1 阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞形態(tài)

通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞類型在形態(tài)學(xué)上可分為原血胞(Prohemocyte, PR)、粒血胞(Granulocyte, GR)、漿血胞(Plasmatocyte, PL)、類絳色細(xì)胞(Oenocytoid, OE)、珠血細(xì)胞(Spherulocyte, SP)和囊血胞(Cystocyte, CY)；與其它鱗翅目幼蟲(chóng)相一致，只是不同個(gè)體間形態(tài)與數(shù)量略有變化。各類型血細(xì)胞大小見(jiàn)表1。

表1 阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞大小及比例(平均值±SD)

2.1.1原血胞

數(shù)量較少的小型細(xì)胞，直徑約4.5～5.5 μm；胞核大，多呈圓形或卵圓形，均質(zhì)細(xì)膩，經(jīng)Wright’s-Giemsa染色后呈紫紅色，幾乎填滿了整個(gè)細(xì)胞；細(xì)胞質(zhì)僅有很薄的一層，有的原血胞細(xì)胞質(zhì)幾乎看不到，無(wú)明顯顆粒；細(xì)胞輪廓清晰，邊緣完整(圖2-A)。

2.1.2漿血胞

多為中型細(xì)胞，胞體大小不一，直徑8～10 μm，多為圓形或橢圓形。細(xì)胞核圓形，呈深紫色，約占胞體的1/2～2/3，常偏位，核染色質(zhì)成粗顆粒狀。細(xì)胞質(zhì)豐富，經(jīng)Wright’s-Giemsa染色后，呈油墨藍(lán)色(嗜堿性)，不透明，部分可見(jiàn)空泡，偶有少量大小均勻紫紅色顆粒(圖2-B)。漿血胞貫穿于鱗翅目昆蟲(chóng)的各發(fā)育階段，也是常見(jiàn)有絲分裂的類型。有時(shí)可見(jiàn)雙核，細(xì)胞核被拉向兩級(jí)，赤道板處細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷，核染色質(zhì)呈塊狀，副染色質(zhì)較明顯(圖2-G)。這類細(xì)胞常聚集成堆(圖2-H)。

2.1.3粒血胞

粒血胞是阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血淋巴中普遍存在的一種優(yōu)勢(shì)血細(xì)胞，形態(tài)多樣，有圓形、卵圓形、紡錘形和不規(guī)則形等，細(xì)胞大小約為9～13 μm。與漿血胞的明顯區(qū)別是，粒血胞內(nèi)含數(shù)量不等、大小不一、分布不一的紫紅色異質(zhì)性溶酶體顆粒。其顆粒分布不均勻，近核一側(cè)較多，有的將核質(zhì)覆蓋不易區(qū)分。四周襯以藍(lán)色或淡藍(lán)色的薄膜樣胞質(zhì)。細(xì)胞易破碎,釋放出內(nèi)含的顆粒物質(zhì)，如在開(kāi)始形成結(jié)節(jié)或者包囊時(shí)(圖2-C)。

2.1.4類絳色細(xì)胞

類絳色細(xì)胞是一類較大型的血細(xì)胞，單核，核較小，為圓形或卵圓形，有時(shí)也有不規(guī)則形狀，數(shù)量較少，直徑約為15～20 μm。Wright’s-Giemsa染色為嗜酸性，核呈深紫紅色，質(zhì)呈淺灰藍(lán)色，胞核染色質(zhì)成濃縮狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)濃厚混沌而均一，其間有淺紋(圖2-D)。

2.1.5珠血細(xì)胞

此細(xì)胞多為中、大型細(xì)胞，形態(tài)特征顯著，易于辨認(rèn)，直徑約18～22 μm。細(xì)胞邊緣充滿大小不等、突出的珠形內(nèi)含物，形似花瓣?duì)睿患?xì)胞中央混沌一團(tuán), 隱約可見(jiàn)其中的珠形內(nèi)含物，細(xì)胞核不易觀察(圖2-E)。

2.1.6囊血胞

囊血胞多為中型細(xì)胞，直徑約8～10 μm，細(xì)胞邊緣光滑圓整，呈近圓形。細(xì)胞質(zhì)逐漸或有時(shí)驟然透明化。核、質(zhì)內(nèi)有大小不一的帶有折光性的顆?；驂K狀物，被染成紫紅色；細(xì)胞核外有一圈類似雙層膜的透明環(huán)帶環(huán)繞(圖2-F)。

圖2 阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞光學(xué)顯微鏡圖像Fig.2 Optical microscope’s image of the hemocyte of larvae of Hepialus altaicola注：A，原血胞；B，漿血胞；C，粒血胞；D，類絳色細(xì)胞；E，珠血細(xì)胞；F，囊血胞；G，漿血胞的分裂；H，漿血胞的聚集；放大倍數(shù)，×1 000；標(biāo)尺=5 μm。Note: A, Prohemocyte; B, Plasmatocyte; C, Granulocyte; D, Oenocytoid; E, Spherulocyte; F, Cystocyte; G, Mitosis of plasmatocyte; H, Aggregation of plasmatocytes; Magnification, ×1 000; Scale bar=5 μm.

該觀察結(jié)果基本符合Lavine和Strand對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)血細(xì)胞的分類和描述(Lavine and Strand, 2002)。

2.2 阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)各類血細(xì)胞所占比例

阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)各類血細(xì)胞所占比例見(jiàn)表1，分別為原血胞3.7%，漿血胞29.9%，粒血胞55.4%，珠血細(xì)胞5.8%，類絳色細(xì)胞2.3%，囊血胞2.9%。其中，粒血胞所占比例最高，其次為漿血胞，兩者所占比例之和高達(dá)85.3%，表明這兩種血細(xì)胞可能在阿爾泰蝠蛾血淋巴的細(xì)胞免疫功能中發(fā)揮主要作用。

3 結(jié)論與討論

本研究在血涂片制備過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)少部分血片在觀察時(shí)有細(xì)胞堆積的現(xiàn)象，可看到不同類型細(xì)胞相互之間有部分重疊。分析可能是由于血膜制備的厚度不一，也可能是觀察部位選取的不恰當(dāng)。一般推片與載玻片約成45°，但由于幼蟲(chóng)個(gè)體之間的差異，所采集的血淋巴的量不完全一致，在操作過(guò)程中適當(dāng)調(diào)整推片角度，如血淋巴量較少時(shí)可稍增大推片角度；而當(dāng)血淋巴量較多或相對(duì)粘稠時(shí)，適當(dāng)減小推片角度，以達(dá)到血膜薄厚適宜，頭、體、尾明顯，分布均勻，減少細(xì)胞重疊和變形的發(fā)生。另外，在選擇觀察部位時(shí)，由于各類血細(xì)胞體積和密度不同，在涂片中分布不均勻。體積較小、密度較大的細(xì)胞分布在體部較多；而體積較大、密度較小的細(xì)胞在尾部和兩側(cè)較多。因此，一般選擇涂片體尾交界處或片頭至片尾的3/4區(qū)域進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，此區(qū)域細(xì)胞分布相對(duì)均勻，染色效果較好。

血涂片染色的質(zhì)量直接影響細(xì)胞形態(tài)的識(shí)別，選擇一種合適的染色方法處理血細(xì)胞來(lái)觀察其形態(tài)特征，是研究昆蟲(chóng)血細(xì)胞的關(guān)鍵。目前昆蟲(chóng)血細(xì)胞研究常用的染色方法包括Wright’s、Giemsa及Wright’s- Giemsa染色等。王強(qiáng)等(2011)分別用這3種染色方法對(duì)中華稻蝗血細(xì)胞進(jìn)行了染色比較，發(fā)現(xiàn)Wright’s-Giemsa染色具備了另外2種染液的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了單一成分染色的不足；向玉勇等(2014)也運(yùn)用Wright’s-Giemsa染色法對(duì)鱗翅目金銀花尺蠖幼蟲(chóng)血細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察，效果較好。參照此前文獻(xiàn)中對(duì)各類昆蟲(chóng)血細(xì)胞的染色方法，選用Wright’s-Giemsa復(fù)合染色法對(duì)阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞進(jìn)行染色觀察。血細(xì)胞的胞質(zhì)、顆粒、胞核等均獲得了較滿意的染色結(jié)果，能夠比較清晰的辨別各種類型的血細(xì)胞。

運(yùn)用Wright’s-Giemsa染色法，在阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血涂片中觀察到原血胞、漿血胞、粒血胞、類絳色細(xì)胞、珠血胞和囊血胞6種血細(xì)胞類型。除原血胞外，其它各類型細(xì)胞均能看到比較明顯的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。從細(xì)胞直徑大小來(lái)看，阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)漿血胞與亞洲玉米螟相似(7.5～10 μm)，而相比小金蝠蛾(10～12 μm)、家蠶(8 μm × 22 μm)和粘蟲(chóng)Pseudaletiaseparata(11.9～16.66 μm)的漿血胞偏?。辉谟^察中偶然可見(jiàn)漿血胞的分裂現(xiàn)象(圖2-G)，有研究也將其劃分為漿血胞中的雙核細(xì)胞(毛敏等, 2017)，對(duì)其分裂特征的研究還需結(jié)合不同分裂相染色體核型的觀察進(jìn)一步闡釋。另外，觀察到漿血胞常有聚集現(xiàn)象(圖2-H)，且細(xì)胞外環(huán)繞著一圈未被著色的空白區(qū)域，區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)被染成紫紅色的顆粒物，但由于固定染色方法學(xué)的限制，未能動(dòng)態(tài)觀察離體血細(xì)胞的變化反應(yīng)，這一現(xiàn)象是否為漿血胞發(fā)生的包囊和吞噬作用還有待進(jìn)一步確認(rèn)。粒血胞的大小比玉米螟(7.5 μm)和舞毒蛾(7～9 μm)稍大，而與小金蝠蛾(10～12 μm)大小近似，卻小于粘蟲(chóng)(9.52～23.8 μm)；粒血胞中存在數(shù)量不等且染色較深的嗜酸性顆粒物質(zhì)，大部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有空泡，有的粒血胞的細(xì)胞質(zhì)發(fā)生破裂，其細(xì)胞形態(tài)介于漿細(xì)胞和粒細(xì)胞之間。這種現(xiàn)象可能是由于機(jī)體的免疫防衛(wèi)發(fā)生吞噬作用而對(duì)細(xì)胞造成的損傷(Kwonetal., 2014)，也可能是漿細(xì)胞向粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)生細(xì)胞質(zhì)碎裂的過(guò)渡時(shí)期(Gupta and Sutherland, 1966)。與多數(shù)鱗翅目及其他種類昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)有所不同的是，通過(guò)染色固定的方法，本研究所觀察到的漿血胞多為近圓形或橢圓形，細(xì)胞直徑也比其他昆蟲(chóng)的漿血胞要小，并且未觀察到紡錘形或梭型等不規(guī)則形態(tài)的漿血胞，也未發(fā)現(xiàn)其有延伸出偽足的現(xiàn)象。而這一現(xiàn)象在利用光學(xué)相差顯微鏡觀察小金蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞時(shí)有所發(fā)現(xiàn)(倪若堯等, 2018)，這可能是由于觀察方法和受貼壁時(shí)間的限制，不能動(dòng)態(tài)的觀察到漿血胞貼壁一段時(shí)間后偽足的延伸和細(xì)胞質(zhì)的變形。阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)的類絳色細(xì)胞直徑(15～20 μm)小于小金蝠蛾幼蟲(chóng)(20～30 μm)，而珠血細(xì)胞的直徑大小與其相似。此外，還觀察到了原血胞和囊血胞，在小金蝠蛾幼蟲(chóng)中未見(jiàn)報(bào)道。阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞中粒血胞占細(xì)胞總數(shù)的55.4%，粒血胞和漿血胞所占比例高達(dá)85.3%，與小金蝠蛾(89.0%)、玉米螟(92.0%)和舞毒蛾(74.6%)等鱗翅目昆蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)血細(xì)胞類型相同，預(yù)示這兩種細(xì)胞在阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血淋巴的免疫防衛(wèi)中發(fā)揮主要作用。另外，由于蝠蛾屬是鱗翅目昆蟲(chóng)進(jìn)化中最原始的種系(Nielsenetal., 2000)，故而推測(cè)粒血胞可能是鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫系統(tǒng)中出現(xiàn)最早的，并且是對(duì)外源物具有防御和清除作用的主要血細(xì)胞類型之一。在光學(xué)顯微鏡下還觀察到一類輪廓分明，并極易崩解破裂的血細(xì)胞，該細(xì)胞表面光滑圓整，呈車輪狀；細(xì)胞核外圍有一圈透明環(huán)帶，細(xì)胞質(zhì)逐漸透明化，期間分散著大小不一的顆粒物，這些顆粒物在核、質(zhì)內(nèi)具有折光性，與傅貽玲(1982)所描述的囊血胞形態(tài)特征一致，故判斷此類血細(xì)胞為囊血胞。嚢血胞直徑和細(xì)胞形態(tài)與漿血胞類似，但嚢血胞的細(xì)胞質(zhì)較為透明化，細(xì)胞核位于包體正中；而漿血胞的細(xì)胞質(zhì)為不透明的油墨藍(lán)色，細(xì)胞核常偏位；并且嚢血胞內(nèi)富含較多的帶有折光性的顆粒物，漿血胞中幾乎不含顆粒，偶可見(jiàn)極少的顆粒，與其細(xì)胞的發(fā)育階段相關(guān)。類絳色細(xì)胞和珠血胞較其他細(xì)胞類型的體積大，形態(tài)特征明顯，易于辨認(rèn)，兩者均無(wú)吞噬功能，主要參與貯存、物質(zhì)代謝和分泌作用。此外，類絳色細(xì)胞還能分泌一種酚氧化酶，可參與昆蟲(chóng)血淋巴的黑化反應(yīng)(談娟等, 2011)。阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)類絳色細(xì)胞平均細(xì)胞直徑要稍小于珠血細(xì)胞，這一點(diǎn)與多數(shù)其它昆蟲(chóng)類型所觀察的現(xiàn)象略有差異。

此次研究阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)共觀察到6種血細(xì)胞類型。其中原血胞是所觀察血淋巴中最小的血細(xì)胞類型，普遍認(rèn)為原血胞是昆蟲(chóng)造血系統(tǒng)中的“祖細(xì)胞”或“干細(xì)胞”，由造血器官或造血組織生成，通過(guò)分裂來(lái)補(bǔ)充昆蟲(chóng)體內(nèi)的血細(xì)胞，并能分化為漿血胞、粒血胞和珠血細(xì)胞(楊麗群等, 2015; Majumderetal., 2017)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為全變態(tài)昆蟲(chóng)如鱗翅目血細(xì)胞的轉(zhuǎn)化隨著昆蟲(chóng)的演化而表現(xiàn)為多種途徑。Gupta等(1966)通過(guò)對(duì)美洲大蠊Periplanetaamericana、黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor和大蠟螟的研究觀察，認(rèn)為漿血胞是昆蟲(chóng)血細(xì)胞的基本形態(tài)，粒血胞、類絳色細(xì)胞和珠血胞是由漿血胞胞質(zhì)碎裂轉(zhuǎn)化而來(lái)，囊血胞也可由形態(tài)為圓形的漿血胞或粒血胞轉(zhuǎn)化形成。傅貽玲(1982)認(rèn)為原血胞是所有其他血細(xì)胞的原始類型，各類血細(xì)胞多由此衍生而來(lái)；漿血胞貫穿于昆蟲(chóng)的各個(gè)發(fā)育階段，并且可以觀察到與其他多數(shù)類型血細(xì)胞之間的過(guò)渡型，被視為主干細(xì)胞；囊血胞由類絳色細(xì)胞離體后轉(zhuǎn)化而來(lái)，易爆破，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)脫核現(xiàn)象，并推測(cè)這類血細(xì)胞可能與昆蟲(chóng)血淋巴的凝集有關(guān)。

由于血細(xì)胞的發(fā)育是連續(xù)的，在不同發(fā)育階段細(xì)胞間包含增殖、分化、成熟、釋放以及衰老和凋亡等多種生理變化過(guò)程，有一些細(xì)胞類型可能是發(fā)育過(guò)程的中間和過(guò)渡狀態(tài)。通過(guò)對(duì)阿爾泰蝠蛾血細(xì)胞的形態(tài)觀察，原血胞染色質(zhì)均勻細(xì)膩，胞核大，幾乎看不到細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)中無(wú)顆?；蛴猩僭S細(xì)小顆粒，符合原始細(xì)胞的形態(tài)特征，可能是血淋巴中最原始的血細(xì)胞(圖2-A)。推測(cè)隨著原血胞的發(fā)育和分化，細(xì)胞表面擴(kuò)大，細(xì)胞質(zhì)逐漸豐富，進(jìn)而環(huán)繞胞核逐漸形成具有嗜堿性的油墨藍(lán)色，胞核呈圓形或橢圓形，常偏于一側(cè)，分裂、分化為輪廓清晰的漿血胞(圖2-B)。漿血胞在分化和演變過(guò)程中，形態(tài)和功能逐漸變化：一部分漿血胞細(xì)胞質(zhì)碎裂，胞質(zhì)中出現(xiàn)數(shù)量不等、大小不一的紫紅色(嗜酸性)顆粒，演變?yōu)榱Ｑ?圖2-C)；另一部分漿血胞細(xì)胞質(zhì)繼續(xù)擴(kuò)大，逐漸變得濃厚混沌，細(xì)胞核固縮變小，轉(zhuǎn)化為類絳色細(xì)胞(圖2-D)；還有一部分漿血胞核染色質(zhì)逐漸聚集呈紫黑色塊狀(碳核)，細(xì)胞內(nèi)被突出形似花瓣樣的珠形內(nèi)含物環(huán)繞而形成珠血細(xì)胞(圖2-E)；嚢血胞則由圓形的漿血胞直接演變而來(lái)，或由粒血胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化而來(lái)，顆粒由靠近核的地方向胞質(zhì)分散，胞質(zhì)逐漸透明，胞體變得圓整光滑，形成“車輪狀”(圖2-F)。故推測(cè)阿爾泰蝠蛾血細(xì)胞中的原血胞是造血“干細(xì)胞”，經(jīng)過(guò)發(fā)育、增殖分化逐漸演變成6種細(xì)胞類型：原血胞、漿血胞、粒血胞、類絳色細(xì)胞、珠血細(xì)胞和嚢血胞，其演化關(guān)系推測(cè)如下(圖3)：

圖3 阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)血細(xì)胞之間的演化關(guān)系Fig.3 Evolutionary relations between hemocytes of Hepialus altaicola larvae

本文初步明確了阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)的血細(xì)胞形態(tài)和類型。然而，昆蟲(chóng)血細(xì)胞種類和形態(tài)多樣，其過(guò)渡類型貫穿于昆蟲(chóng)的整個(gè)發(fā)育階段。許多種類血細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中都有形態(tài)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，需要連續(xù)性的觀察才能發(fā)現(xiàn)一瞬間的轉(zhuǎn)化過(guò)程，而血涂片固定染色法只能觀察到血細(xì)胞離體后某一特定時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)。因此，還需進(jìn)一步對(duì)不同齡期阿爾泰蝠蛾幼蟲(chóng)的血細(xì)胞進(jìn)行觀察和研究，從而更加準(zhǔn)確地鑒定其血細(xì)胞的類型，摸清其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)演變規(guī)律和免疫應(yīng)答機(jī)制，為后續(xù)研究阿爾泰蝠蛾與新疆蟲(chóng)草菌的免疫互作提供理論依據(jù)。