右美托咪定預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響

張曉曉，李樹華，楊華，胡越成

(1.天津市公安醫(yī)院麻醉科，天津 300040；2.天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科，天津 300051)

隨著心臟冠狀動脈介入技術(shù)和外科旁路移植技術(shù)的發(fā)展，完全閉塞的冠狀動脈再血運(yùn)重建率不斷提升，但在積極挽救瀕死心肌的同時(shí)，也不可避免地發(fā)生冠狀動脈再通后心肌的缺血再灌注損傷(ischemic-reperfusion injury，IRI)[1]。大量的蛋白和因子通過不同途徑參與IRI的發(fā)生過程，其中以白細(xì)胞介素(interleukin，IL)系列因子和氧化自由基研究最多。但研究多集中于IRI發(fā)生損傷的下游機(jī)制，對其上游機(jī)制研究較少，而且結(jié)論觀點(diǎn)也不一致。近年來研究發(fā)現(xiàn),高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)、天然免疫系統(tǒng)中的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)和細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路在IRI發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)在心、肝、腦和腎等臟器的IRI中發(fā)揮保護(hù)作用[5]。但Dex發(fā)揮抗IRI保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確。本研究主要探討Dex預(yù)處理對大鼠心肌IRI時(shí)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1動物與分組 選取SPF級SD雄性大鼠36只，體重250～300 g，周齡為8～10周，于2018年6月購自天津醫(yī)科大學(xué)動物中心，使用許可證號：SYXK(津)2016-0012。36只SD雄性大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、IRI組和Dex預(yù)處理組，每組12只。所有動物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食禁水。

1.2材料與試劑 動物人工呼吸機(jī)(DHX-150，成都儀器廠)，低溫離心機(jī)(KH20R-Ⅱ，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)，Precisa電子分析天平(LS220ASCS，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(DNR LumiBIS，以色列DNR公司)，蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Trans-Blot Turbo，美國Bio-Rad公司)，PROTEAN等電聚焦系統(tǒng)(i12，美國Bio-Rad公司)。Dex(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：181230BP)，戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn))。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均購自中國南京建成生物功能研究所。IL-6、IL-8、IL-12和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、HMGB1、TLR4和NF-κB試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3模型制備

1.3.1麻醉與分組用藥 所有大鼠按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉并固定，分離股靜脈并置管。Dex預(yù)處理組：靜脈予Dex 5μg/kg負(fù)荷劑量，然后以5 μg/(kg·h)持續(xù)滴注1 h。假手術(shù)組和IRI組按同樣方法給予同體積0.9%氯化鈉溶液。全身麻醉后，直視下行氣管插管，并連接小動物呼吸機(jī)，聯(lián)通供氧系統(tǒng)，調(diào)節(jié)氧濃度為21%，通氣頻率設(shè)為80～100次/min，吸呼比為1∶1，潮氣量為1～2 mL/100 g，術(shù)中維持呼氣末二氧化碳分壓為35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.3.2心肌IRI模型制備 選定大鼠左側(cè)第3～4肋間，于此處開胸，取大鼠開胸器撐開肋骨，暴露心臟，于心臟左心室前壁處，肺動脈圓錐及左心房間，在左冠狀動脈前降支起始部下2 mm處，下方穿絲線，穩(wěn)定2 min，結(jié)扎絲線阻斷前降支血流，心電圖顯示ST段抬高或T波高聳，心肌顏色由淡紅色變?yōu)榍嘧仙?，搏動減弱，心電圖ST段抬高≥0.25 mV，為缺血成功的標(biāo)志。結(jié)扎30 min后，切斷結(jié)扎線，維持灌注 3 h，心電監(jiān)護(hù)顯示抬高ST段回落50%以上，心肌顏色轉(zhuǎn)由青轉(zhuǎn)紅，為再灌注成功的標(biāo)志[2]。IRI組和Dex預(yù)處理組均造模成功，假手術(shù)組僅穿線但不結(jié)扎，其余步驟均相同。

1.4標(biāo)本采集 經(jīng)大鼠股靜脈取血5 mL，處死大鼠后取心臟組織，沿動脈根部剪去大血管，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后吸干多余液體，去除右心室游離壁及心房，僅保留左心室心肌組織，稱重。以左心室前壁為中心，取一半左心室心肌組織，置于含4%甲醛試管中固定，再行石蠟包埋，擬行免疫組織化學(xué)檢測；將另一半左心室心肌組織，置于液氮中凍存，最后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1血清IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α水平測定 按照各試劑盒操作要求，采用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心生物技術(shù)，根據(jù)檢測說明書，通過標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對應(yīng)的OD值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)各樣本的OD結(jié)果，在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣本濃度。

1.4.2心肌組織GSH-Px、SOD、MPO和MDA活性測定 取凍存的心肌組織，準(zhǔn)確稱取組織重量，以相應(yīng)的試劑為勻漿介質(zhì)，制成5%的組織勻漿，分別采用2-硝基苯甲酸直接顯色法測定GSH-Px，黃嘌呤氧化酶法測定SOD，鄰聯(lián)茴香胺比色法測定MPO，硫代巴比妥酸法測定MDA的含量，按各試劑盒說明測得各樣本的OD值，再根據(jù)相關(guān)說明書指導(dǎo)計(jì)算公式計(jì)算結(jié)果。

1.4.3心肌組織HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測心肌組織HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)。稱取5 mg心肌組織，剪碎后配成勻漿，提取蛋白，采用經(jīng)典二辛可酸法測定蛋白濃度，制膠后灌膠點(diǎn)樣，電流槽內(nèi)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待不同蛋白條帶分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，封閉，洗膜。按照對應(yīng)分子量切割后，分別置于1∶1 000、1∶300及1∶300 稀釋的兔抗大鼠蛋白HMGB1、TLR4和NF-κB的一抗溶液中，置于4 ℃，雜交過夜，用洗膜液漂洗后加入1∶3 000稀釋的二抗，雜交1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果，以蛋白灰度比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠體重和左心室質(zhì)量比較 三組大鼠體重和左心室質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組大鼠體重和左心室質(zhì)量的比較

2.2三組大鼠血清炎癥因子水平比較 各組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與假手術(shù)組比較，IRI組和Dex預(yù)處理組血清IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)；與IRI組比較，Dex預(yù)處理組血清IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠血清炎癥因子水平比較

2.3三組大鼠心肌GSH-Px、SOD、MPO及MDA含量比較 各組大鼠心肌GSH-Px、SOD、MPO及MDA含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與假手術(shù)組比較，IRI組和Dex預(yù)處理組心肌GSH-Px和SOD含量顯著下降(P<0.01)，MPO和MDA含量升高(P<0.01)；與IRI組比較，Dex預(yù)處理組心肌GSH-Px和SOD含量升高(P<0.05)，MPO和MDA含量下降(P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠心肌GSH-Px、SOD、MPO及MDA含量比較

2.4三組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 各組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與假手術(shù)組比較，IRI組和Dex預(yù)處理組心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與IRI組比較，Dex預(yù)處理組心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見表4。

表4 三組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

心肌IRI指缺血的心肌恢復(fù)血運(yùn)再灌注后損傷反而加重的現(xiàn)象，在急性心肌缺血后恢復(fù)血流時(shí)更容易發(fā)生。心肌IRI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，盡管有不同的上游機(jī)制，但最直接的下游機(jī)制是炎癥介質(zhì)和氧自由基過表達(dá)，同時(shí)存在抗氧化酶系的分泌不足，共同作用導(dǎo)致過度的心肌炎癥損傷反應(yīng)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與假手術(shù)組相比，IRI組大鼠的血清炎癥因子(如IL和TNF-α)水平明顯升高，代表心肌氧自由基水平的MPO和MDA含量顯著升高，而發(fā)揮抗氧化功能的GSH-Px和SOD水平顯著降低。但這僅是IRI發(fā)生的表觀現(xiàn)象，發(fā)生心肌再灌注損傷的上游機(jī)制尚不明確。

目前對于IRI發(fā)生的上游機(jī)制研究主要集中在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬和某些相關(guān)信號通路的激活開放方面。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在IRI過程中發(fā)揮重要作用，其活化后可促進(jìn)心肌損傷，而HMGB1為TLR4內(nèi)源性配體，該途徑一旦被激活，配體信號即可通過髓樣分化因子88依賴和髓樣分化因子88非依賴途徑發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步活化NF-κB[8]，促進(jìn)缺血缺氧區(qū)域的炎癥反應(yīng)，激活下游細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6等)表達(dá)發(fā)揮損傷效應(yīng)[9-10]，同時(shí)促進(jìn)氧自由基高表達(dá)，最終導(dǎo)致心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、心功能受損以及心肌梗死面積增大等不良影響[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，IRI組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高，這也反映了發(fā)生IRI時(shí)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路被迅速激活，進(jìn)而激活下游炎癥因子和氧自由基的釋放。目前對自身免疫性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，該信號通路是調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子和免疫分子的重要通路[12]。本研究在心臟IRI方面同時(shí)發(fā)現(xiàn)該通路活化后可以激活炎癥和免疫反應(yīng)，推測該通路是IRI產(chǎn)生和加重的上游機(jī)制之一。

Dex作為新型的高選擇α2受體激動藥，在心、腦、肝及腎等臟器的IRI中均具有保護(hù)作用。研究顯示，Dex可降低心肌細(xì)胞損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)[13-16]，并減少心肌缺血無復(fù)流的面積[17]，但具有作用機(jī)制并未完全闡明。Riquelme等[18]認(rèn)為Dex通過對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，尤其是內(nèi)皮型一氧化氮合酶/一氧化氮途徑，發(fā)揮抗心肌細(xì)胞炎癥和氧化功能。而He等[19]認(rèn)為Dex不依賴內(nèi)皮途徑發(fā)揮對IRI的保護(hù)作用。另有研究認(rèn)為，Dex通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和糖原合成酶激酶3β信號通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用，并認(rèn)為該通路可能是其上游通路之一[20-21]。本研究結(jié)果顯示，與IRI組相比，Dex預(yù)處理組血清炎癥因子(IL、TNF-α)顯著降低，這與Chen等[22]在外科旁路移植術(shù)中的研究結(jié)果一致，表明Dex能夠減少IRI后炎癥反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。同時(shí)本研究證實(shí)，IRI組大鼠心肌細(xì)胞生物膜缺血再灌注后易受氧自由基(如MPO及MDA)的攻擊，而Dex能增加抗氧自由基物質(zhì)，提高機(jī)體清除自由基能力，降低組織炎癥損傷水平，證明了Dex對心肌的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與IRI組相比，Dex預(yù)處理組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低，反映了該藥能抑制IRI時(shí)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的激活，從上游調(diào)控發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，心肌IRI時(shí)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路被激活，Dex通過抑制該信號通路，進(jìn)一步影響下游靶分子的表達(dá)和免疫分子、炎癥因子水平，降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮心肌IRI保護(hù)作用。但本研究僅局限于對該信號通路影響的探討，IRI的上游機(jī)制是多方面的，仍需要深入研究心肌缺血再灌注的機(jī)制及Dex在其中發(fā)揮的作用。