響應面法優(yōu)化提取拳參黃酮的工藝研究

劉文宇，趙雨晴，徐 漢，王寶慶

(哈爾濱商業(yè)大學 藥學院 省預防治療老年病藥物研究重點實驗室 財政部中央與地方共建實驗室，哈爾濱 150076)

拳參(PolygonumBistortaL.) 的)是蓼科蓼屬植物拳參的根莖[1].蒙、藏藥別名：嘎都爾、利嘎都爾；中藥別名拳蓼、紫參等.在我國東北、華北、甘肅等地廣泛存活，在日本、蒙古、哈薩克斯坦等地也有栽培.蒙醫(yī)常用藥材，味苦、澀，歸大腸經.具有清熱解毒，消腫散結的功效[2].在外感風熱，咳嗽，痢疾，敗血癥，嘔血(血熱出血)以及發(fā)炎腫痛等方面已被廣泛使用了1000多年[3].近年來，文獻報道拳參在抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、止痛[6]、抗菌[7]、抗炎[8]等方面有良好的應用.

現代研究表明，拳參中含有多種有效物質，包括鞣質、鞣花酸、沒食子酸、兒茶酚、多糖、生物堿、萜類、黃酮等天然藥理活性成分，其中黃酮是拳參的主要成分之一[9].黃酮在植物、水果中廣泛存在，由于人體不能合成，因此只能以食物的方式從植物中攝取.黃酮類化合由于其藥理活性較強，在醫(yī)藥行業(yè)獲得廣泛關注.目前食品行業(yè)對它的認知度普遍提高，目前黃酮類成分作為食品抗氧化劑、抗菌劑被廣泛應用[10].但目前黃酮的提取率普遍不高，提高拳參黃酮化合物的提取率已成為進行黃酮產品開發(fā)需要解決的關鍵問題.因此，本文利用超聲波輔助提取法對拳參黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，對拳參黃酮產業(yè)化開發(fā)以及在醫(yī)療、食品、化妝品等方面的綜合應用提供了數據參考.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與材料

實驗試劑：蘆丁(質量分數HPLC≥99%)曼林試劑氯化鋁、乙醇為分析純

實驗材料：干燥的拳參(根莖)(購自哈爾濱市道外區(qū)三棵樹中藥材專業(yè)市場 經專家鑒定為拳參)

1.2 主要儀器與設備

JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機 寧波新藝超聲設備有限公司；LAMBDA 650紫外可見光分光光度計 珀金埃爾默公司；3K30低溫離心機 SIGMA公司；N-1000旋轉蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；循環(huán)水真空泵SHB-95 鄭州杜甫儀器廠.

1.3 實驗方法

1.3.1 拳參黃酮提取流程及工藝

拳參-粉碎過60目篩-稱量樣品-超聲波輔助提取-離心分離-取上清液-冷凍干燥-黃酮.

準確稱取拳參粉末樣品，放置于超聲波細胞粉碎機中按照實驗預設的4個考察因素(料液比、超聲波功率、提取時間、提取溫度)進行超聲波輔助提取，提取后利用離心機高速離心，分離后備用[11].

1.3.2 測定含拳參黃酮量方法

精確稱取蘆丁標準品10.05 mg，用75%的乙醇溶解后定容至50 mL的容量瓶中待用；稱取蘆丁標準液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL后置于25 mL容量瓶中，各自分別加入1 mL 1%的氯化鋁溶液，用75%的乙醇溶液定容、搖勻，靜置20 min；使用紫外分光光度法測定410 nm作為測量波長的吸光度，繪制蘆丁標準曲線，將橫坐標設為蘆丁質量濃度C(mg / mL)，將縱坐標設定為吸光度A； 標準曲線的回歸方程為：A=15.24C+0.0932.在0.008 04～0.048 24 mg/mL范圍內呈線性關系.取定量的拳參提取液定容后按照上述方法測得吸光度，代入蘆丁標準曲線后得出拳參黃酮質量，得率按以下公式計算[12].

1.3.3 響應面優(yōu)化提取拳參黃酮的工藝

1)單因素實驗

以拳參黃酮提取率為考察目標，對其中四個因素進行優(yōu)化，分別為料液比、超聲功率、提取時間及提取溫度，確定最佳提取工藝條件.

2)響應面優(yōu)化設計

參照上述實驗結果為基礎，并以拳參黃酮提取率為考察指標，進行響應面設計.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對拳參黃酮提取率的影響

精密稱量10.00 g烘干的拳參粉末，提取液用75%乙醇，以預設的料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50(g/mL)，分別于超聲波細胞粉碎機中，設置超聲功率為300 W、提取溫度60 ℃下提取60 min.參照1.3.2的流程及計算公式計算得出拳參黃酮提取率見圖1.

圖1 料液比對提取率的影響Figure 1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield

從圖1可見，拳參黃酮的提取率隨著提取液的不斷增加呈現先增加后下降的趨勢，當料液比為1∶40 g/mL時拳參黃酮提取率最高.可能與溶劑的劑量有關，隨著溶劑劑量的逐漸增加，黃酮逐漸溶解，直至溶解平衡.同時由于溶劑劑量的增加，拳參粉末與溶劑的接觸面積也增加，更方便黃酮的溶出.但是溶劑劑量過高，一方面在料液比1∶40 g/mL時黃酮達到溶解平衡，另一方面可能雜質成分隨之析出干擾黃酮溶出，并且溶劑質量過多不僅會影響提取效果也會造成資源的浪費.因此最佳單因素是1∶40 g/mL[13].

2.1.2 超聲功率對拳參黃酮提取率的影響

精密稱量10.00 g烘干的拳參粉末，提取液用75%乙醇于超聲波細胞粉碎機中提取，設置超聲功率分別為100、200、300、400、500 W，提取溫度60 ℃，在料液比1∶30(g/mL)的條件下提取60 min.參照1.3.2的流程及計算公式計算得出拳參黃酮提取率見圖2.

從圖2可以看出，當超聲波功率不斷增大，拳參黃酮的提取率呈現先增大后減小的趨勢，在400 W處達到最大值.超聲波作用于提取有效成分，利用超聲波的空話作用將細胞粉碎，以及其強烈的震蕩作用使細胞的內容物加速流出，功率越大，產生的效果越明顯.但是由于功率過大，空化泡的增長過大，降低了空化作用同時也影響了超聲波的傳播，減少了能量的傳遞，不利于提取的進行.因此選用超聲波功率為400 W[14].

圖2 超聲功率對提取率的影響Figure 2 Influence of ultrasonic power on extraction yield

2.1.3 提取時間對拳參黃酮提取率的影響

準確稱取10.00 g烘干的拳參粉末，提取液用75%的乙醇于超聲波細胞粉碎機中按照料液比1∶30 (g/mL)，設置超聲功率為300 W，提取溫度為60 ℃的條件，分別提取20、40、60、80、100 min.參照1.3.2的流程及計算公式計算得出拳參黃酮提取率見圖3.

圖3 提取時間對提取率的影響Figure 3 Influence of extraction time on extraction yield

從圖3不難看出，提取時間對拳參黃酮得率的影響具有相同的趨勢.提取時間在20～60 min之間，隨時間的延長，提取率有所提高，但不明顯，原因是提取時間短，提取不完全.提取時間在60 min時，提取率達到最大值.提取時間超過60 min后，黃酮的提取率略有下降，可能由于時間的延長，黃酮類中熱敏性物質易被分解破壞；另一方面，隨著時間的增加，溶劑的揮發(fā)增多，也會造成黃酮溶出減少.因此選用60 min作為提取時間[15].

2.1.4 提取溫度對拳參黃酮提取率的影響

準確稱取10.00 g烘干的拳參粉末，提取液用75%的乙醇于超聲波細胞粉碎機中按照料液比1∶30 (g/mL)，設置超聲功率為300 W，設置提取溫度分別為20、40、60、80、100 ℃，提取60 min.參照1.3.2的流程及計算公式計算得出拳參黃酮提取率見圖4.

圖4 提取溫度對提取率的影響Figure 4 Influence of extraction temperature on extraction yield

由圖4可知，提取溫度對拳參黃酮得率的影響具有相同的趨勢.在提取溫度在20～40 ℃之間，隨溫度的升高，提取率有所提高，有可能是隨著溫度的升高，分子運動加快，細胞內黃酮物質析出加快.40～100 ℃之間黃酮的提取率逐漸下降，原因可能是溫度過高黃酮中的酚羥基氧化分解為雜質[16].

2.2 響應面結果與分析

以單因素實驗取得的結果,制定響應面優(yōu)化四因素三水平表(見表1).

表1 實驗因素與水平表Table 1 Experimental factors and levels

進行Box-Behnken 試驗設計方案，設置試驗，試驗結果見表2.

表2 響應面實驗設計結果Table 2 Response surface experimental design results

表2所得實驗數據采用Design Expert10.0.7統(tǒng)計軟件進行分析，回歸模型方差分析見表3.

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Regression model and variance analysis

運用響應面Design Expert 10.0.7軟件做擬合方程，其中提取率(Y)和料液比(A)、超聲功率(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)回歸模型為：提取率Y=1.16+0.013A-(6.250E-0.03)B-(7.250E-0.03)C+0.014D-(6.250E-0.03)AB-0.036AC+0.010AD-0.033BC+(3.750E-0.03)BD+0.014CD-0.099A2-0.086B2-0.13C2-0.15D2

從上述表3得出的數據可以看出，該回歸模型差異極顯著(P<0.0001)，且失擬項不顯著(P=0.915 2>0.05)，其回歸模型決定系數為R2=0.968 4，由此證明該模型對拳參黃酮提取率的預測準確可靠.其中的方差分析一項中不難看出，A2、B2、C2、D2具有極顯著差異，AC、BC具有較顯著差異，A，D具有顯著差異.將不顯著因素排除，優(yōu)化得出新的二次回歸方程為：Y=1.16+0.013A+0.014D-0.036AC-0.033BC-0.099A2-0.086B2-0.13C2-0.15D2.

由回歸方程得出響應面分析圖，見圖5～10(R1為拳參黃酮提取率).

圖5 料液比與超聲功率交互作用影響拳參黃酮提取率的曲面線圖Figure 5 Curved surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power on the extraction yield of flavonoids from Polygonum Bistorta L.

圖6 料液比與提取時間交互作用影響拳參黃酮提取率的曲面線圖Figure 6 Curved curve of the interaction of solid-liquid ratio and extraction time on the extraction yield of flavonoids from Polygonum Bistorta L.

圖7 料液比與提取溫度交互作用影響拳參黃酮提取率的曲面線圖Figure 7 Curved surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction yield of flavonoids from Polygonum Bistorta L.

圖8 超聲功率與提取時間交互作用影響拳參黃酮提取率的曲面線圖Figure 8 Curved surface diagram of the interaction between ultrasonic power and extraction time on the extraction yield of flavonoids from Polygonum Bistorta L.

圖9 超聲功率與提取溫度交互作用影響拳參黃酮提取率的曲面線圖Figure 9 Curved surface diagram of the interaction between ultrasonic power and extraction temperature on the extraction yield of flavonoids from Polygonum Bistorta L.

圖10 提取時間與提取溫度交互作用影響拳參黃酮提取率的曲面線圖Figure 10 Curved surface diagram of the interaction between extraction time and extraction temperature on the extraction yield of flavonoids from Polygonum Bistorta L.

從圖5～10反映出不同因素交互作用對拳參黃酮提取率的干擾.曲線陡峭，表示該組影響因素響應面值變化程度大，則表明其交互作用對于乙醇提取拳參黃酮的提取率影響程度大[17].通過6組圖的對比發(fā)現，料液比(A)與提取時間(C)、超聲功率(B)與提取時間(C)間關系對拳參黃酮提取率的結果影響較大，超聲功率(B)與提取溫度(D)間關系干擾很小.圖所反映的結果和方差中二次項結果一致[18].

根據響應面分析顯示的結果發(fā)現，拳參黃酮最佳提取方法是：料液比1∶40.74(g/mL)，超聲功率396.9 W，提取時間 59.38 min，提取溫度40.96 ℃.這時理論上拳參黃酮提取率最大值為1.162%，因實際操作需求，將最佳提取方法修正為料液比1∶41(g/mL)、超聲功率397 W，提取時間59 min，提取溫度41 ℃.以此條件進行3次驗證試驗并取其平均值，得到實際拳參黃酮提取率為1.198%與理論值1.162%接近，表明該方法準確可靠.

3 結 語

本實驗以干燥的拳參根莖粉末作為原材料，采用超聲波輔助提取法對拳參中的黃酮進行提取，通過料液比、超聲功率、提取時間及提取溫度4個因素進行單因素實驗，用響應面進行優(yōu)化，得最優(yōu)條件.結果表明：采用超聲波法對拳參中黃酮提取的最優(yōu)條件為料液∶1∶41(g/mL)、超聲功率397 W、提取時間59 min、提取溫度41 ℃，此時拳參黃酮得率最大為1.198%與預測值1.162%接近.

經過實驗發(fā)現，采用超聲波法輔助提取拳參黃酮并利用響應面分析法優(yōu)化提取條件，具有提取效率高，簡單易操作，提取結果穩(wěn)定效果好的特點，能夠為將來拳參的綜合利用以及后續(xù)藥品、食品、化妝品等產業(yè)化開發(fā)提供基礎的理論支持.