網(wǎng)絡藥理學探究敗醬草治療潰瘍性結腸炎機制

聶承冬，溫 靜，周婉梅，徐蓓蕾，楊 波，侯兵喬，王淇漩，閻新佳*

(1. 哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，哈爾濱 150076；2. 黑龍江省預防與治療老年病藥物研究重點實驗室，哈爾濱 150076)

敗醬草(PatriniavilloseJuss.，或者Patriniascabiosaefolia Fisch.ex Link)具有排膿消癰和清熱解毒等功效[1-2].現(xiàn)代臨床上，多用于潰瘍性結腸炎、胃炎、直腸炎的治療等，其中尤為潰瘍性結腸炎治療效果顯著[3-4].敗醬草在治療潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，下文簡稱UC)的大量數(shù)據(jù)表明，其在臨床使用、體外實驗和體內實驗等都具有顯著的療效[5-7].

本文以網(wǎng)絡藥理學和分子對接工具為基礎[8]，探討敗醬草療法UC作用機制和藥效物質基礎.由于近幾年網(wǎng)絡學的流行，可使用工具也愈來越復雜，各不相同.算法的不同，來源的差距也很大，故本文對獲得成分靶點的多種工具作了對比，希望研究人員可以針對這些工具來進行反復的研究.

1 材料和方法

1.1 敗醬草成分篩選

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[9]，SymMap(https://www.symmap.org/)[10]，TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)，TCM@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/ index.php)[11]對敗醬草的成分篩選，得到敗醬草的主要成分.

1.2 敗醬草靶點獲取

基于已有數(shù)據(jù)庫文本挖掘成分靶點，利用TCMSP，SymMap，TCM@Taiwan CancerHSP(http://tcmspw.com/CancerHSP.php)和PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫獲取作用靶點；基于常見成分靶點預測工具(PharmMapper，Swiss Target Prediction，TargetNet，SITCH)獲取成分靶點.

PharmMapper[12-14](http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)篩選物種為Homo sapiens，其余默認；Swiss Target Prediction[15](http://www.swiss target prediction.ch/)選擇species為Homo sapiens，Prob > 0.095，其余默認；Target Net[16-17](http://targetnet.scbdd.com /calcnet/index/)選擇species為Homo sapiens，Include models with:AUC >= 7，F(xiàn)ingerprint type:ECFP4 fingerprints，Prob > 0.095，其余默認；SITCH[18](http://stitch.embl.de/)選擇species為Homo sapiens，minimum required interaction score：high confidence (0.700)，其余默認.再通過Uniprot(https://www.uniprot.org)進行信息校正，保留species為“homo sapiens”的靶點，得到敗醬草主要成分靶點.

1.3 疾病成分靶點的篩選

以“ulcerative colitis”為關鍵詞，在DrugBank(https://www.drugbank.ca/)[19]，TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[20]，DisGeNET(https://www.disgenet.org/)[21]，MalaCards(https://www.malacards.org/)[22]，GeneCards(https://www.genecards.org/)[23]，OMIM[24](https://omim.org/)中檢索UC靶點，再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行靶點信息校正和去重.

1.4 主要成分-靶點網(wǎng)絡的構建

將UC靶點和主要成分分別引入Cytoscape (3.7.2)，組建網(wǎng)絡(“成分-作用靶點”).通過“自由度(free degree)”篩選出敗醬草治療UC的主要成分.

1.5 蛋白相互作用構建和富集分析

將敗醬草主要成分靶點基因和治療UC靶點基因通過string平臺[25]得到蛋白相互作用數(shù)據(jù)，導入Cytoscape，構建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI).取二者PPI交集，得到核心基因靶點.DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫[26-27]對敗醬草治療UC核心靶點進行GO和KEGG富集分析.

1.6 分子對接模擬

將處理好的主要活性成分(配體分子)和蛋白(作用靶點)導入PyRx軟件，并對原配體進行分子對接，進行對照，打分系統(tǒng)使用Predicted binding Affinity[28]，并用通過PyMOL2.1.1展現(xiàn)其作用方式.

2 實驗結果

2.1 主要成分的篩選

以OB≥30%，DL≥0.18篩選條件經(jīng)過TCMSP、SymMap、TCMID和TCM@Taiwan數(shù)據(jù)庫檢索后，以及文獻文本挖掘敗醬草所含的抗炎類化合物.經(jīng)過篩選一共得到40個成分，見表1.

表1 敗醬草中主要成分Table 1 Main compounds in Patrinia

MOL000449Stigmasterol43.82990.765280794MOL000498Isoorientin23.29540.7649852298MOL000511UrsolicAcid16.77490.7549867942MOL000764Magnoflorine26.68760.556451920MOL000794Menisperine26.16680.59161487MOL000875Cedro16.23450.1265575MOL001254(-)-Perillaldehyde39.00410.032724159MOL001675Villosol99.29790.0811074397MOL001676VilmorrianineC33.96330.2220055981MOL001677Asperglaucide58.01630.5213855373MOL001678BolusantholB39.94390.4110594416MOL001680Loganin5.901130.4487691MOL001682Morroniside13.86370.5011228693MOL001689Acacetin34.97360.2425202697MOL001694PerillylAlcohol46.23920.03369312MOL001697Sinoacutine63.38840.53821366MOL001790Linarin39.84370.715317025MOL001965Dauricine23.65000.3745358120MOL002322Isovitexin31.29460.7244257794MOL002343Tetrandrine26.63970.1053399220MOL0045644'-Methylkaempferol73.41000.275281666MOL007979Avicularin2.06000.7049766656MOL012914Dauricinoline2.41510.405316319MOL012917Daurinoline2.41510.405316322MOL012920Sinomenine30.98000.4657339442MOL012921Stepharine31.54790.33830726

2.2 核心成分和核心靶點的篩選

經(jīng)過DrugBank、TTD、DisGeNE、MalaCards、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，核查，去重，最終確認了疾病基因靶點共205個.通過數(shù)據(jù)庫文本挖掘(TCMSP，SymMap，TCM@Taiwan CancerHSP和PubChem)、PharmMapper、SwissTargetPrediction、TargetNet、SITCH，共5種獲取成分靶點工具，得到5份成分靶點核心成分和核心靶點數(shù)據(jù)，見表2(僅列出大于等于degree的成分).

表2 敗醬草的成分和靶點對比表Table 2 Comparison Tablele of the compounds and targets of Patrinia

對每份數(shù)據(jù)進行拓撲學結構分析，篩選出大于degree值的成分列出；通過string平臺得到敗醬草成分靶點和疾病靶點的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)，對這兩個PPI網(wǎng)絡進行交集，得到核心靶點，見圖1.

圖1 敗醬草核心靶點對比Figure 1 Comparison of the core targets of Patrinia

2.3 GO富集分析和KEGG通路分析對比

分別對“2”得到的5組敗醬草治療UC核心靶點數(shù)據(jù)進行了GO和KEGG富集分析，對分析的前10條結果進行可視化，見圖2、3.通過圖2、3，可以明顯看出不同的靶點來源工具得到生物功能和信號通路的排名差異性很大.五種工具在生物功能方面較為相似，只是排名順序不同，在MF中，受體結合和蛋白質結合等的富集排名靠前；在CC中，細胞質部分、細胞膜、質膜部分等富集排名靠前；在BP中，細胞對刺激的反應、代謝、生物調節(jié)等富集排名靠前.值得說的是，在CC中，僅Pharm Mapper和Target Net在排名前10出現(xiàn)了囊泡，其他大致相同.KEGG分析中，五種工具出現(xiàn)與UC相關的，有Inflammatory bowel disease(炎癥性腸病)信號通路等.其中，重點對比Inflammatory bowel disease信號通路[29]和JAK-STAT信號通路[30]兩個通路(與UC的通路相關)，見表3，可以明顯看出數(shù)據(jù)庫文本挖掘得到的有效數(shù)據(jù)最多；其他工具得到的有效數(shù)據(jù)也有，但相對較少.

圖2 敗醬草中治療UC靶點GO富集分析結果圖Figure 2 GO Enrichment Analysis of UC target in Patrinia

圖3 敗醬草主要靶點KEGG富集通路氣泡圖Figure 3 Bubble map of enrichment pathways of the main targets in Patrinia

表3 UC相關通路的對比Table 3 Comparison of UC related pathways

2.4 分子對接模擬

由上文可知，數(shù)據(jù)庫文本挖掘得到的數(shù)據(jù)最接近真實數(shù)據(jù)，故對其進行分子對接模擬，初步驗證其結合活性.選擇網(wǎng)絡節(jié)點度值degree大于等于Median值的15個潛在活性成分和18個潛在活性靶點進行分子對接[31-32].結果只保留打分值最小的.數(shù)據(jù)經(jīng)過熱圖分析，得到圖4.打分值大于等于原配體的活性成分占85.2%，說明敗醬草活性成分與有效靶點具有較好結合活性，其中Oleanolic acid、Ursolic acid、Stigmasterol、Menisperine、Tetrandrine與靶點IL10、IL1B、IL4、NFKB1、TLR2結合活性非常好.

圖4 分子對接分數(shù)的熱圖分析Figure 4 Heat maps of molecular docking scores

Ursolic acid、Oleanolic acid、Stigmasterol是敗醬草中常見的三萜類化學成分，且與各蛋白靶點能很好地結合.IL1B、IL4、IL10是常見的炎癥因子，可能與治療UC有關.其中，Oleanolic acid與IL1B對接打分絕對值(-7.4)較原配體打分絕對值(-3.2)更高，通過圖5得知，Oleanolic acid端基羥基不僅與IL1B以氫鍵穩(wěn)定結合(LYS-56、GLU-64)，端基羥基還被IL1B的疏水loop區(qū)(VAL-3、LEU-62、LEU-67)穩(wěn)定包裹住，但另一端羧基并無與IL1B有結合，說明Oleanolic acid很可能是通過蛋白靶點與含有羥基部分結合，從而產(chǎn)生結合活性；Ursolic acid的結合活性也很好，尤其與IL4打分絕對值(-7.3)相對較高，大于原配體打分絕對值(-3.4).IL4分別與Ursolic acid的兩端羥基以氫鍵(THR-44、ARG-115)連接，Ursolic acid中間碳環(huán)穩(wěn)定嵌入IL4疏水loop區(qū)(ILE-119、ILE32、PHE-33、ALA-35)，通過圖5中surface模式下對比，可以明顯看出與Oleanolic acid相比可能結合更穩(wěn)定；Stigmasterol則與IL10結合活性較好，其對接打分絕對值(-8.9)大于原配體打分絕對值(-3.3)，主要通過IL10疏水loop區(qū)(PHE-30、LEU-26、LEU-94、LEU-98、VAL-33、MET-77、PHE-37、ALA-80、VAL-76)結合產(chǎn)生活性，由于疏水區(qū)殘基數(shù)量超出以上兩者很多，故其結合活性可能高于以上兩者.

圖5 活性蛋白質和活性化合物相互作用分析Figure 5 The analysis of the interaction between active proteins and active compounds

Tetrandrine，Menisperine為敗醬草含有生物堿類化學成分，與各蛋白靶點結合活性較好，生物堿類化學成分本身就可能具有多種抗炎活性.NFKB1和TLR2與機體免疫相關的靶點，可能也與治療UC有關.Tetrandrine與NFKB1結合較好(二者對接打分值：-7.5).Tetrandrine被NFKB1的三個疏水loop區(qū)(ILE-123；ILE-163、GLY-185和GLY-184；PHE-228與GLY-226)穩(wěn)定嵌合，Tetrandrine的兩個苯環(huán)NFKB1形成兩個鹽橋(ARG-164、LYS-95)結合； Menisperine和TLR2結合較好(二者對接打分值：-7.3).Menisperine與TLR2三個疏水loop區(qū)(MET-766和LEU-737；LEU-658；ALA-652)牢牢嵌合，Menisperine通過苯環(huán)與TLR2氨基酸殘基形成一個鹽橋(TRP-654)結合， Menisperine還通過端基羥基與TLR2形成氫鍵(TRP-764、ARG-771)，通過圖5對Menisperine和Tetrandrine進行相比，發(fā)現(xiàn)兩者結合牢固程度相似，打分值相近，說明兩者其實際結合活性可能也相似.

3 結 語

本文通過網(wǎng)絡藥理學探究敗醬草治療UC的復雜機制[33].首先，從敗醬草中篩選出40個敗醬草主要成分及其靶點與UC靶點.本研究對獲取成分靶點來源進行了對比，使用了5種常用獲取成分靶點網(wǎng)絡藥理學工具.數(shù)據(jù)庫文本挖掘，是常用的成分靶點收集方法，通過本方法得到的敗醬草治療UC的數(shù)據(jù)最多，其中黃酮類得到的靶點最多，可能是由于黃酮類的研究較多，其實際作用有待商榷，但通過數(shù)據(jù)文本挖掘得到的數(shù)據(jù)更接近真實數(shù)值，如果可以進行體內外實驗驗證，建議使用本方法獲取靶點；Pharm Mapper，是將化合物的藥效團與藥效團模型數(shù)據(jù)庫進行匹配來執(zhí)行預測.本文中是很接近接近數(shù)據(jù)庫文本挖掘數(shù)據(jù)的，數(shù)據(jù)較為準確，對于組方成分較少，數(shù)據(jù)庫挖掘不到成分相關靶點，以及組方中僅有單個成分，建議使用本方法，而且此工具可能會挖掘出其他工具挖掘不出的藥物潛在機制；Swiss Target Prediction，是基于2D和3D相似性測量與已知化合物的配對來預測化合物目標的網(wǎng)絡服務器，本文中是最接近數(shù)據(jù)庫文本挖掘數(shù)據(jù)的，數(shù)據(jù)比較接近真實數(shù)值，且預測時間很短，是獲取成分靶點較好的工具；Target Net，是基于QSAR(定量結構活性關系)模型預測化合物的目標，預測使用了一種名為樸素貝葉斯分類器的機器學習方法.預測的數(shù)據(jù)比較準確，其擁有多種分子指紋構建預測模型(FP2、Daylight-Like、MACCS、Estate、ECFP2、ECPF4和ECFP6等)，在本工具預測時，其參數(shù)設置較為考究.如果中藥組方成分較多，建議使用本工具，還預測出中藥組方存在的潛在作用機制；SITCH(相互作用化學品的搜索工具)是一個化學物質和蛋白質之間通過相互作用來預測靶點的數(shù)據(jù)庫，這些相互作用來自高通量實驗、其他初級數(shù)據(jù)庫、文本挖掘和計算預測等.本實驗中得到數(shù)據(jù)較少，無法對其評價，但其得到的數(shù)據(jù)是比較準確的，如果中藥組方成分非常多，建議使用本工具.

數(shù)據(jù)文本挖掘得到的數(shù)據(jù)最接近真實數(shù)值，故只對數(shù)據(jù)文本挖掘進行討論.首先從敗醬草中篩選出主要成分與UC的靶點，確認Quercetin、Apigenin、Kaempferol、Luteolin、Ursolic acid等共15個核心成分，確定STAT3、TNF、IL6、IL1B和IL10等共18個核心靶點，最后發(fā)現(xiàn)Inflammatory bowel disease與JAK-STAT signaling pathway信號通路與敗醬草治療UC作用密切相關，分子對接中，其結合活性良好.

IL10、IL1B、IL4是常見的炎癥因子，UC大鼠模型和人類UC患者中發(fā)現(xiàn)三者會發(fā)生明顯的上調，而且這三者還都參與了Inflammatory bowel disease信號通路，引發(fā)多種腸道炎癥[34-37]；NFKB1主要參與免疫缺陷等過程，TLR2通過調控信號轉導來刺激炎癥介質(比如IL10、IL1B、IL4等)的釋放，并且它們都參與了Inflammatory bowel disease信號通路，在人類UC患者中都有明顯的上調浮動[38].Oleanolic acid[39]和Ursolic acid[40]為天然三萜類中具有抗炎和抗癌作用的化合物，以Oleanolic acid和Ursolic acid能作為IL1B抑制劑[41]，抑制炎癥發(fā)生.Oleanolic acid和Ursolic acid可能通過與IL1B等炎癥因子結合，從而抑制其表達，從而達到治療UC的作用.同為三萜類成分的Stigmasterol不僅能抑制IL1B[42]還能抑制TLR2[43]的表達，從而對UC產(chǎn)生療效.生物堿類成分Menisperine和Tetrandrine[44]都具有良好的抗炎活性，Tetrandrine 作用于炎癥因子IL1B、IL4[45]和Toll樣受體TLR2[46]產(chǎn)生抗炎作用，從而達到治療UC目的，Menisperine具體抗炎靶點未知，但很可能與Tetrandrine作用機制類似.

綜上所述，敗醬草的黃酮類成分，三萜類成分(Oleanolic acid、Ursolic acid、Stigmasterol等)、和生物堿類成分(Menisperine、Tetrandrine等)可能是其主要治療UC有效成分，他們通過與靶點IL10、IL1B、IL4、NFKB1、TLR2等關鍵靶點通過氫鍵作用，疏水作用，鹽橋作用等形式結合，作用于炎癥性腸病信號通路等信號通路發(fā)揮療效.本研究為敗醬草治療潰瘍性結腸炎機制研究提供了理論依據(jù)，其預測結果還待進一步的實驗驗證.