基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芪治療膜性腎病的作用機(jī)制

龐欣欣，彭紫凝，邢玉鳳，石秀杰，張雅歌，韓佳瑞,*，王振濤,*

(1 河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)腎病科，鄭州 450002；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046)

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是導(dǎo)致成人腎病綜合征的主要病因之一[1]。MN約占原發(fā)性腎小球腎炎30%，且呈逐年上升趨勢(shì)[2]。MN多見于40歲以上人群，主要臨床表現(xiàn)為水腫、蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和高血壓，少數(shù)伴有鏡下血尿[3]。MN的病理特征為腎小球基底膜上皮側(cè)免疫復(fù)合物沉積，伴有腎小球基底膜彌漫增厚[4]。目前，MN的發(fā)病機(jī)制尚未明確，主要治療方法以控制血壓、降低尿蛋白、糾正脂代謝紊亂、利尿消腫及免疫抑制治療等為主[5]，但是仍有約30%患者進(jìn)入終末期腎臟疾病，依賴腎透析[6]。

中醫(yī)藥在治療MN上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已逐漸被國內(nèi)外接受[5,7]。黃芪(Astragalus membranaceus)是治療MN的中藥之一，不僅可以大劑量單獨(dú)應(yīng)用，還可作為君藥組方配伍使用治療MN[8-9]。黃芪具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、行水消腫等功效，有“補(bǔ)氣諸藥之最”之稱。西醫(yī)學(xué)研究證實(shí)黃芪能通過抗炎、抗氧化、改善腎小球?yàn)V過、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、改善水鈉代謝等多方面緩解腎臟疾病[10]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘黃芪的有效成分及靶點(diǎn)，利用復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)可視化技術(shù)，引入黃芪作用于MN的靶點(diǎn)，進(jìn)行疾病-藥物-分子-靶點(diǎn)互相作用的可視化分析，以及基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析，為黃芪治療MN的中醫(yī)機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 方法

1.1 黃芪有效成分篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[11]挖掘黃芪的化學(xué)成分，根據(jù)各個(gè)成分的吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)，即ADME參數(shù)篩選有效成分，其中篩選條件為藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug like，DL)≥0.18。

1.2 黃芪的作用靶點(diǎn)和MN的相關(guān)靶點(diǎn)檢索

以“Astragalus membranaceus”為關(guān)鍵詞，篩選TCMSP數(shù)據(jù)庫中黃芪有效成分作用靶點(diǎn)。以“membranous nephropathy”為關(guān)鍵詞，篩選GeneCards、DrugBank、TTD、DisGeNET等數(shù)據(jù)庫中與MN有關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)是數(shù)據(jù)挖掘的重要途徑。STRING數(shù)據(jù)庫可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。依據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建黃芪作用靶點(diǎn)與MN靶點(diǎn)的交集PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選核心靶點(diǎn)。篩選參數(shù)設(shè)置主要有：生物機(jī)體選擇為人類，最低要求交互分?jǐn)?shù)設(shè)置最高置信度為0.4。

1.4 黃芪治療MN網(wǎng)絡(luò)調(diào)控可視化

基于黃芪和MN的PPI靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，篩選得到黃芪可作用于MN的有效成分，采用Cytoscape 3.7.2軟件把這些數(shù)據(jù)制作成可視化網(wǎng)絡(luò)圖，其中“圓形”代表靶蛋白，“三角形”代表分子，以“邊”表示不同成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系，挖掘其相互之間的作用關(guān)系。即得到黃芪治療MN的疾病-藥物-分子-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO和KEGG富集分析

采用DAVID(the database for annotation，visualization and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫對(duì)有效靶點(diǎn)進(jìn)行注釋，并挖掘黃芪化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，進(jìn)行GO和KEGG富集分析[12]。GO分析是生物學(xué)領(lǐng)域中用于基因產(chǎn)物細(xì)胞功能、分子功能和生物功能分類的系統(tǒng)，可以通過DAVID工具進(jìn)行GO富集分析。同時(shí)，應(yīng)用DAVID工具對(duì)黃芪和MN交集蛋白靶標(biāo)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到黃芪治療MN的主要作用通路。采用校正統(tǒng)計(jì)學(xué)超幾何分布定量(P.adjust值)評(píng)估存在于各GO和KEGG注釋中的蛋白生物學(xué)功能和通路富集情況的顯著性，P.adjust值在圖中顏色越紅，則顯著性越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪有效成分ADME分析

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中黃芪的化學(xué)成分，按照OB≥30%和DL≥0.18條件篩選出20個(gè)黃芪入血活性成分，有良好的口服生物利用度和藥物相似性。見表1。

表1 黃芪有效成分

2.2 黃芪作用靶點(diǎn)和MN相關(guān)靶點(diǎn)檢索結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找到的20個(gè)有效成分中，只有15個(gè)有效成分具有相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。對(duì)這15個(gè)有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)基因注釋，刪去重復(fù)靶點(diǎn)，得到180個(gè)藥物靶點(diǎn)。在GeneCards、DrugBank、TTD、DisGeNET等數(shù)據(jù)庫中篩選MN相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，共得到3191個(gè)與MN相關(guān)的靶點(diǎn)。取黃芪和MN的有效靶點(diǎn)交集，得到121個(gè)共同靶基因。

2.3 黃芪-MN作用靶點(diǎn)PPI關(guān)系分析

采用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)黃芪-MN的121個(gè)相互作用靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，隱藏離散節(jié)點(diǎn)，得到1456條PPI關(guān)系。見圖1。取其中富集節(jié)點(diǎn)數(shù)目最多的前30個(gè)靶點(diǎn)，做柱狀圖，得到前30個(gè)黃芪-MN核心靶點(diǎn)。橫軸為富集節(jié)點(diǎn)數(shù)目，縱軸為靶點(diǎn)基因名稱。核心靶點(diǎn)主要有蛋白激酶、炎癥因子、血管內(nèi)皮生長因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子等。見圖2。

圖2 黃芪治療MN的核心作用靶點(diǎn)

2.4 黃芪治療MN網(wǎng)絡(luò)可視化分析

通過Cytoscape軟件進(jìn)行黃芪治療MN的疾病-藥物-分子-靶點(diǎn)互相作用的可視化分析。納入上述PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的121個(gè)基因和分析篩選得到15個(gè)黃芪可用有效成分，同時(shí)在網(wǎng)絡(luò)中加入疾病和藥物使網(wǎng)絡(luò)圖更加直觀。網(wǎng)絡(luò)可視化圖見圖3。

2.5 黃芪治療MN的機(jī)制分析

通過DAVID工具對(duì)黃芪和MN交集蛋白靶標(biāo)基因進(jìn)行GO分析，得到黃芪可治療MN的作用靶點(diǎn)的生物學(xué)功能128種，綜合分析后取前20種功能特性，得到黃芪有效成分靶點(diǎn)主要通過這些生物學(xué)功能特性治療MN，如細(xì)胞因子受體結(jié)合性、受體配體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ型特異性、細(xì)胞因子活性等。見圖4。再采用DAVID工具進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，探索黃芪治療MN信號(hào)通路28條，綜合分析后取前20條信號(hào)通路。KEGG分析顯示，黃芪治療MN的有效靶點(diǎn)主要作用在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗力(endocrine resistance)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)信號(hào)通路等。見圖5。其中氣泡顏色越紅，則校正P值越高，顯著性越強(qiáng)；氣泡越大，則該生物學(xué)功能或該通路富集的靶點(diǎn)越多。根據(jù)顯著性和富集靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行綜合分析得到MAPK信號(hào)通路為最關(guān)鍵的治療通路，同時(shí)用紅色表示黃芪靶點(diǎn)在該信號(hào)通路上具體作用點(diǎn)。見圖6(所有結(jié)果均符合P.adjust<0.05)。

注：六邊形代表黃芪，菱形代表MN，三角形代表黃芪15個(gè)有效作用成分，圓形代表黃芪作用于MN的121個(gè)靶點(diǎn)。其中A代表(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol；B代表9,10-dimethoxypter ocarpan-3-O-β-D-glucoside；C代表(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol；D代表1,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene圖3 黃芪-MN-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

注：計(jì)數(shù)代表與該生物學(xué)功能相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)量，P.adjust表示顯著性圖4 黃芪治療MN的相關(guān)生物學(xué)功能

注：計(jì)數(shù)代表與該通路相關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)量，P.adjust表示顯著性圖5 黃芪治療MN關(guān)鍵信號(hào)通路

注：紅色表示黃芪在信號(hào)通路上的作用靶點(diǎn)(來源于KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫)圖6 MAPK信號(hào)通路圖

3 討論

MN占原發(fā)性腎病綜合征的20%～35%，是國內(nèi)外常見的引起腎病綜合征的病理類型之一[1]。近年來，MN患病率逐年上升，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床治療困難，雖然大多數(shù)MN患者患病后及時(shí)對(duì)癥治療，能夠緩解部分臨床癥狀，但是仍有近1/3的患者不可避免進(jìn)入終末期腎臟疾病，最終依賴腎透析[6]。因此，仍需要探索新的干預(yù)手段緩解MN進(jìn)展，其中中醫(yī)藥治療方法優(yōu)勢(shì)明顯。

MN在中醫(yī)學(xué)中尚無直接對(duì)應(yīng)的病名，依據(jù)其臨床表現(xiàn)可劃分為“水腫”“虛勞”等范疇[13]。在MN的發(fā)展過程中，多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為MN屬本虛標(biāo)實(shí)證，病機(jī)以腎、脾、肺等臟腑功能失調(diào)為主，以腎虛為根本病位[14]。研究表明[15]，MN不同時(shí)期的病因病機(jī)不同，初期多為正虛邪實(shí)，后期則為脾腎陽虛，腎氣虛，脾失健運(yùn)，水濕泛溢于肌膚，發(fā)為水腫，精微不固則下泄為蛋白尿，故脾腎氣虛為基本病機(jī)，貫穿始終。研究表明[16]，MN病機(jī)之本主要為脾腎氣虛，瘀水互結(jié)。因此，MN的中醫(yī)辨證與脾腎氣虛密切相關(guān)，治療當(dāng)以補(bǔ)氣為主?！吨袊幍洹?020年版記載黃芪性甘，微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效，為補(bǔ)氣之要藥，功效符合MN的中醫(yī)治則[17]。國內(nèi)外研究證實(shí)黃芪為治療MN的核心中藥之一，能夠緩解MN進(jìn)展[8-9]。

目前，黃芪治療MN的作用機(jī)制尚不完全清楚。如項(xiàng)協(xié)隆等[18]認(rèn)為黃芪有效成分可以通過調(diào)控蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，緩解膜性腎炎大鼠的腎損傷。Zheng等[19]發(fā)現(xiàn)黃芪成分能夠改善足細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架受損，抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化，黃芪作用于MN的機(jī)制可能與其有效成分能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白及相關(guān)通路來減輕足細(xì)胞損傷有關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有與中醫(yī)藥學(xué)基本特點(diǎn)一致的整體性和系統(tǒng)性，注重藥物與疾病之間的相互作用，能把傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學(xué)良好銜接，彌補(bǔ)臨床用藥安全性監(jiān)測(cè)的不足，能在理論層面探索藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制[20]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索了黃芪作用于MN的潛在分子機(jī)制。研究分析黃芪治療MN有效入血的活性成分及靶點(diǎn)，得到黃芪主要通過槲皮素(quercetin)、毛蕊異黃酮(calycosin)、山柰酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)等有效成分，作用在MN多個(gè)靶點(diǎn)，如蛋白激酶1(AKT1)、炎癥因子白介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、細(xì)胞凋亡相關(guān)因子CASP3等。有研究表明，AKT可能參與藥物治療MN過程，其作用機(jī)制可能與保持足細(xì)胞骨架及足突完整有關(guān)[21]；VEGF可能在MN的發(fā)病機(jī)制中具有雙重調(diào)節(jié)作用[22]；藥物抑制IL-6表達(dá)能緩解MN炎癥反應(yīng)進(jìn)而保護(hù)腎臟[23]等。通過GO分析得到這些有效作用靶點(diǎn)主要通過細(xì)胞因子受體結(jié)合性、受體配體活性及細(xì)胞因子活性等生物學(xué)功能特性治療MN。

為進(jìn)一步探索黃芪治療MN的作用機(jī)制，本研究針對(duì)黃芪-MN之間PPI關(guān)系的所有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG關(guān)鍵通路富集分析，結(jié)果顯示，黃芪治療MN主要通過MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗力、RAS信號(hào)通路等。依據(jù)富集靶點(diǎn)及顯著性分析得到黃芪治療MN關(guān)鍵信號(hào)通路為MAPK信號(hào)通路。本研究中，黃芪主要作用于MAPK信號(hào)通路包含的p38、ERK、JNK三個(gè)亞族，行使不同功能。其中，p38是MAPK信號(hào)通路的主要分支之一，通過調(diào)控p38調(diào)節(jié)活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase,PRAK)等激活低分子量熱休克蛋白27(HSP27)，參與細(xì)胞的炎癥應(yīng)激反應(yīng)，與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)特性密切相關(guān)[24]。JNK介導(dǎo)的通路可被細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、生長因子等多因素激活，ERK可調(diào)控細(xì)胞的多種生理功能，在多種疾病中發(fā)揮重要作用等[25]。與本研究一致，Hong等[26]認(rèn)為抑制MAPK信號(hào)通路中p38、JNK的表達(dá)能保護(hù)足細(xì)胞免受補(bǔ)體復(fù)合物誘導(dǎo)的損傷。研究證實(shí)[19]，黃芪提取物能通過減少補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物誘導(dǎo)的JNK和ERK1/2的磷酸化來影響MAPK信號(hào)通路，恢復(fù)足細(xì)胞形態(tài)避免MN加重。因此，以MAPK信號(hào)通路針對(duì)MN靶向治療有一定的優(yōu)勢(shì)，黃芪治療MN的具體機(jī)制可通過該通路進(jìn)行挖掘研究。

本研究仍存在不足之處：① 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是基于已有的中藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的黃芪有效成分，研究結(jié)果不夠全面。② 研究預(yù)測(cè)的活性成分-靶點(diǎn)之間具有關(guān)聯(lián)性，但是兩者之間的具體調(diào)控關(guān)系及靶點(diǎn)在KEGG分析所得的通路中的調(diào)控作用依舊不明。③ 分析所得的結(jié)果需進(jìn)行體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，缺少黃芪治療MN的多中心大樣本隨機(jī)對(duì)照的臨床研究，本課題組后續(xù)將以此為研究基礎(chǔ)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，也為廣大研究人員提供思路，深入探索黃芪治療MN的具體作用機(jī)制。

綜上所述，本研究通過對(duì)黃芪治療MN的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘，得到黃芪主要通過槲皮素、毛蕊異黃酮、山柰酚等有效成分具體作用在MN的AKT1、IL-6、VEGFA等多靶點(diǎn)，其主要生物學(xué)功能特性為細(xì)胞因子受體結(jié)合性、受體配體活性及細(xì)胞因子活性等，作用的關(guān)鍵通路為MAPK信號(hào)通路。黃芪可能直接或間接參與調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等作用機(jī)制影響MN。本研究為后續(xù)臨床驗(yàn)證及深入基礎(chǔ)研究提供了重要的參考依據(jù)。