野生和栽培大理茶居群的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)

毛娟，江鴻鍵，楊如兵，李崇興，馬成英，陳亮，馬建強(qiáng)*

野生和栽培大理茶居群的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)

毛娟1,2，江鴻鍵3，楊如兵4，李崇興5，馬成英6，陳亮1，馬建強(qiáng)1*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000；3. 云南省臨滄市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，云南 臨滄 677000；4. 云南省臨滄市臨翔區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，云南 臨滄 677000；5. 云南省臨滄市茶葉科學(xué)研究所，云南 臨滄 677000；6. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東 廣州 510000

大理茶是栽培型茶樹的野生近緣種，了解大理茶居群的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，對(duì)于大理茶資源的有效保護(hù)和開發(fā)利用至關(guān)重要。利用30對(duì)茶樹核心SSR引物，對(duì)3個(gè)代表性的野生和栽培大理茶居群進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果表明，30對(duì)SSR引物在所有大理茶樣本中都能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)為2～14個(gè)，范圍為0.041～0.877，平均0.491。3個(gè)大理茶居群具有中等水平的遺傳多樣性，其中大雪山（DXS）野生居群的遺傳多樣性相對(duì)較低。香竹菁（XZQ）和白鶯山（BYS）栽培居群的近交水平很高，近交系數(shù)（）分別為0.728和0.913。居群配對(duì)分析顯示，居群間遺傳分化指數(shù)（）均小于0.15，基因流（）大于1。分子方差分析表明3個(gè)大理茶居群的遺傳差異主要來(lái)源于居群內(nèi)（94.1%）。聚類分析顯示，野生和栽培大理茶單株的遺傳距離相對(duì)較大?；赑CoA和Structure的群體結(jié)構(gòu)分析顯示，野生居群的遺傳背景單一，栽培居群的遺傳背景較復(fù)雜，其中7個(gè)BYS栽培居群?jiǎn)沃昕赡苁谴罄聿韬桶⑺_姆茶通過(guò)漸滲雜交形成。

大理茶；SSR；遺傳多樣性；群體結(jié)構(gòu)

大理茶[(W.W. Smith) Melchior]屬于山茶屬茶組[Sect.(L.) Dyer]，是栽培型茶樹[(L.) O. Kuntze]的野生近緣種。大理茶是茶組植物中較原始的種，相比栽培型茶樹，其典型形態(tài)學(xué)特征為子房5（7）室、柱頭5（7）淺裂或條、子房被茸毛、嫩枝和頂芽無(wú)茸毛等[1]。大理茶自然種群主要集中分布在怒江和瀾滄江流域，擴(kuò)散至云桂黔交界和中緬邊境地區(qū)，是分布范圍最廣、數(shù)量最多的野生型茶樹[2]。大理茶資源的農(nóng)藝性狀和生化成分存在較豐富的遺傳變異[3]，Ogino等[4]利用低咖啡堿大理茶特異資源，發(fā)掘了咖啡堿合成酶1（TCS1）的優(yōu)異等位基因，開發(fā)了能夠鑒別咖啡堿含量的功能標(biāo)記。此外大理茶還可能參與了阿薩姆茶[var.(Masters) Kitamura]的馴化過(guò)程[5]。由此可見(jiàn)，大理茶具有重要的經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究?jī)r(jià)值。

深入了解種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是有效保護(hù)和利用這些資源的前提。基于分子標(biāo)記的遺傳學(xué)分析，避免了形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)易受環(huán)境和基因顯隱性的影響，能更好地評(píng)估群體遺傳參數(shù)。AFLP、SSR和SNP等分子標(biāo)記已被普遍應(yīng)用于茶樹遺傳學(xué)研究[6]，但針對(duì)大理茶的相關(guān)研究較少。季鵬章等[7]采用AFLP標(biāo)記對(duì)大理茶居群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)居群間的遺傳分化較低，遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。Zhao等[8]利用SSR標(biāo)記對(duì)野生、過(guò)渡型和栽培大理茶居群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大理茶整體上具有中等程度的遺傳多樣性，野生居群的遺傳多樣性相對(duì)較低，過(guò)渡型大理茶是由野生大理茶馴化而來(lái)。李苗苗等[5]利用SSR標(biāo)記對(duì)野生大理茶、混栽的過(guò)渡型大理茶和阿薩姆茶居群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大理茶和阿薩姆茶之間遺傳分化顯著，在混栽居群中過(guò)渡型大理茶向阿薩姆茶有明顯的種間雜交漸滲。

云南被認(rèn)為是茶樹的起源中心[2]，茶樹種質(zhì)資源十分豐富。臨滄市位于云南省西南部，地處瀾滄江與怒江之間，是大理茶的主要分布區(qū)。雙江大雪山大理茶居群是已發(fā)現(xiàn)的海拔最高、密度最大的野生大理茶居群[9]，風(fēng)慶香竹箐和云縣白鶯山大理茶居群是現(xiàn)存最古老的栽培大理茶居群之一。本研究評(píng)估了30對(duì)茶樹核心SSR引物在大理茶中的通用性和多態(tài)性，并對(duì)3個(gè)最具代表性的大理茶居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其遺傳組成和親緣關(guān)系，為保護(hù)和利用這些資源提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)樣品來(lái)源于云南省臨滄市，包括3個(gè)大理茶居群，其中大雪山（DXS）為野生大理茶居群，分布于原始森林中，香竹箐（XZQ）和白鶯山（BYS）為栽培大理茶居群，與阿薩姆茶居群混生。基于樣本包含盡可能多的遺傳變異原則[10]，參考Zhao等[8]研究結(jié)果，并結(jié)合居群的實(shí)地情況，確定每個(gè)居群取樣數(shù)量為20～30株（表1）。采樣時(shí)先根據(jù)居群分布進(jìn)行分區(qū)，在各區(qū)內(nèi)隨機(jī)取樣，單株間距離10?m以上。采集的幼嫩枝條用脫脂棉包裹保濕帶回實(shí)驗(yàn)室，取完整葉片用液氮快速冷凍，放置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 SSR檢測(cè)

DNA提取參照多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）方法進(jìn)行，使用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。檢測(cè)合格的DNA稀釋至20?ng·μL-1，放入–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0對(duì)茶樹核心SSR引物由本實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)[11]，SSR熒光引物委托上海祥音生物科技有限公司合成，PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序參見(jiàn)毛娟等[12]方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物使用3730xl DNA分析儀進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

根據(jù)3730xl DNA分析儀檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增片段大小，使用GenAlEx 6.5[13]將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成不同分析軟件所需格式。遺傳多樣性參數(shù)分析，分別使用PowerMarker 3.25[14]計(jì)算等位基因數(shù)（）、基因型數(shù)（）、多態(tài)信息含量（）；使用PopGene 1.32[15]計(jì)算期望雜合度（）、觀測(cè)雜合度（）、居群配對(duì)Nei’s遺傳相似性（）和遺傳距離（），以及Hardy-Weinberg平衡卡方檢驗(yàn)。根據(jù)等位基因頻率，使用BOTTLENECK 1.2.02[16]檢測(cè)各居群的瓶頸效應(yīng)；使用Arlequin 3.5[17]進(jìn)行分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA），計(jì)算居群內(nèi)近交系數(shù)（）、以及居群配對(duì)遺傳分化系數(shù)（）和基因流（）。

根據(jù)Nei’s遺傳距離，使用PowerMarker 3.25利用鄰接法（Neighbor-joining tree，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。主坐標(biāo)分析（PCoA）在GenAlEx 6.5上完成。使用Structure 2.3.4[18]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，K值設(shè)置為2～7，Length of Burnin Period設(shè)置為10?000，Number of MCMC Reps after Burnin設(shè)置為100?000，Interation設(shè)置為10；使用Structure Harvest[19]計(jì)算ΔK，確定最佳K值；利用CLUMPP[20]對(duì)最佳K值運(yùn)算結(jié)果進(jìn)行重復(fù)抽樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性

30對(duì)核心SSR引物在所有樣本中都能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物，總共檢測(cè)到176個(gè)等位基因和326個(gè)基因型（表2）。單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因?yàn)?～14個(gè)，平均5.9個(gè)，基因型為2～32個(gè)，平均10.9個(gè)。值范圍為0.041～0.877，平均0.491，其中高多態(tài)性位點(diǎn)有18個(gè)（≥0.5），中度多態(tài)性位點(diǎn)5個(gè)（0.25≤＜0.5），低度多態(tài)性位點(diǎn)7個(gè)（＜0.25）。觀測(cè)雜合度范圍為0.100～0.943，平均0.444，期望雜合度范圍為0.042～0.895，平均0.532。大多數(shù)（27/30）位點(diǎn)的觀察雜合度低于期望雜合度?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示83.3%（25/30）位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（<0.01）。

2.2 遺傳多樣性

在3個(gè)居群中，BYS的多態(tài)性位點(diǎn)為100%，DXS和XZQ為80%（表3）。BYS居群檢測(cè)到的等位基因（144）、基因型（191）和特異等位基因（45）均最多，平均每個(gè)位點(diǎn)4.8個(gè)等位基因和6.4個(gè)基因型；其次為DXS居群，共檢測(cè)到100個(gè)等位基因（平均3.3）、169個(gè)基因型（平均5.6）和14個(gè)特異等位基因；XZQ居群最少，共檢測(cè)到99個(gè)等位基因（平均3.3）、146個(gè)基因型（平均4.9）和8個(gè)特異等位基因。BYS居群的值相對(duì)較高（0.519），其次為XZQ居群（0.391）和DXS居群（0.381）。BYS和XZQ居群的觀測(cè)雜合度低于期望雜合度，而DXS居群的觀測(cè)雜合度略高于期望雜合度。

表1 大理茶居群采樣信息

表2 30個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳參數(shù)

注：*Hardy-Weinberg平衡卡方檢驗(yàn)，<0.01，下同

Note: *<0.01 for Chi-square test of Hardy-Weinberg equilibrium (HWE), the same below

表3 3個(gè)大理茶居群的遺傳多樣性

3個(gè)大理茶居群的瓶頸效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果如表4所示。在IAM模型的假設(shè)下，DXS和XZQ居群都表現(xiàn)出顯著的雜合度過(guò)剩（<0.01），而在SMM模型下，雜合度過(guò)剩位點(diǎn)相對(duì)較多，但未達(dá)到顯著水平。BYS居群在2種模型的假設(shè)下，都未檢測(cè)到顯著的雜合度過(guò)剩。因此推測(cè)DXS和XZQ居群可能在近期內(nèi)經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)的影響。

2.3 遺傳分化

BYS和XZQ居群的近交系數(shù)分別為0.728和0.913，表明居群內(nèi)近交水平很高，而DXS居群僅為0.028（表3）。居群配對(duì)基因流和遺傳分化系數(shù)顯示，各居群之間的基因流水平很高，遺傳分化指數(shù)（）較低（表5）。分子方差分析的結(jié)果表明，遺傳變異主要來(lái)源于居群內(nèi)（94.1%），而居群間的遺傳差異僅為5.9%（表6）。

2.4 聚類分析

居群配對(duì)遺傳相似性和遺傳距離結(jié)果顯示，兩個(gè)栽培大理茶居群XZQ和BYS的遺傳距離最?。?.148），遺傳相似性最高（0.862）；野生居群DXS和兩個(gè)栽培居群的遺傳距離較大，遺傳相似性較低，表明野生和栽培大理茶居群之間的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（表7）?；贜ei’s遺傳距離的聚類分析結(jié)果顯示，野生大理茶聚為一類，栽培大理茶聚為一類，XZQ和BYS居群的單株之間具有較緊密的親緣關(guān)系（圖1）。

表4 大理茶居群瓶頸效應(yīng)檢測(cè)

注：IAM：無(wú)限等位基因模型；SMM：逐步突變模型；He/Hd：雜合子過(guò)剩位點(diǎn)/雜合子不足位點(diǎn)

Note: IAM: Infinite Allele Model. SMM: Stepwise Mutation Model. He/Hd: Loci with heterozygosity excess/deficiency

表5 居群配對(duì)基因流和遺傳分化系數(shù)

注：矩陣上方為基因流，下方為遺傳分化指數(shù)；#<0.001

Note: Pairwise gene flow values were showed in upper triangular, and fixation index were in lower triangular. #<0.001

表6 大理茶居群的遺傳多樣性分子方差分析

表7 居群配對(duì)遺傳相似性和遺傳距離

注：矩陣上方為成對(duì)遺傳相似性，下方為遺傳距離

Note: Pairwise genetic identity values were showed in upper triangular, genetic distances were in lower triangular

注：DXS01—DXS30：大雪山居群?jiǎn)沃辏籜ZQ01—XZQ20：香竹菁居群?jiǎn)沃?；BYS01—BYS20：白鶯山居群?jiǎn)沃?/p>

2.5 群體結(jié)構(gòu)

利用PCoA分析構(gòu)建70個(gè)大理茶樣本的空間排序圖，結(jié)果表明，野生DXS居群與兩個(gè)栽培居群可以完全區(qū)分，而栽培居群中，7個(gè)BYS單株與其他單株可以完全區(qū)分，其余單株之間則區(qū)分度不明顯（圖2-A）。利用Structure進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明K=3時(shí)，ΔK獲得最大值（圖2-B），即試驗(yàn)樣本的最適亞群數(shù)為3。當(dāng)K=3時(shí)，DXS居群的全部單株屬于同一亞群，BYS居群的7個(gè)單株屬于1個(gè)亞群，其他單株與XZQ居群屬于1個(gè)亞群（圖2-C）。基于PCoA和Structure的群體結(jié)構(gòu)聚類分析結(jié)果具有較好的一致性。

3 討論

SSR標(biāo)記被廣泛用于茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。本研究選用的30對(duì)茶樹SSR引物[11]，在大理茶樣本檢測(cè)到較高的多態(tài)性，表明這些標(biāo)記具有很好的通用性，可以作為核心引物進(jìn)行茶組植物遺傳多樣性的比較分析。30個(gè)SSR位點(diǎn)在所有大理茶樣本中共檢測(cè)到176個(gè)等位基因，平均為0.491，低于利用同一套SSR標(biāo)記對(duì)茶樹育成品種（=0.510）[11]和地方品種（=0.565）[12]進(jìn)行分析獲得的結(jié)果，說(shuō)明本研究中大理茶群體的遺傳多樣性整體上呈中等水平，但相比其他茶樹種質(zhì)資源較低。

3個(gè)大理茶居群中，BYS居群的遺傳多樣性相對(duì)較高，而DXS和XZQ居群可能在近期內(nèi)經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)的影響，導(dǎo)致遺傳多樣性相對(duì)較低。XZQ和BYS居群的近交系數(shù)很高，出現(xiàn)觀測(cè)雜合度低于期望雜合度的現(xiàn)象（表3），其原因可能是兩個(gè)居群均為栽培大理茶，居群內(nèi)個(gè)體呈零星分布，由于生境片段化導(dǎo)致花粉傳播受限，隨機(jī)交配系統(tǒng)被打破，造成居群內(nèi)極高的近交程度。遺傳分化指數(shù)表明，居群間出現(xiàn)了一定程度的遺傳分化，但基因流水平很高（>1），說(shuō)明居群間存在較頻繁的基因交流，能抑制由遺傳漂變引起的遺傳分化，AMOVA結(jié)果也表明遺傳變異主要存在于居群內(nèi)個(gè)體間（94.1%），這與李苗苗等[5]、季鵬章等[7]和Zhao等[8]的研究結(jié)果類似，也符合多年生異交物種的遺傳變異規(guī)律。

聚類分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，野生和栽培居群具有不同的遺傳背景。DXS野生大理茶居群的遺傳背景較一致，聚為一個(gè)亞群，且與兩個(gè)栽培居群的遺傳距離較大。XZQ和BYS栽培大理茶居群的遺傳背景較復(fù)雜，可能由3個(gè)祖先亞群雜交而來(lái)，其中BYS居群的7個(gè)單株聚為1個(gè)亞群（圖2）。栽培大理茶通常來(lái)自大理茶的野生群體，通過(guò)移栽或采集開放授粉種子進(jìn)行繁殖和馴化而成，其遺傳背景與同域分布的茶樹居群密切相關(guān)[7-8]。本研究中采集的BYS居群樣本與阿薩姆茶混生，因此推測(cè)上述7個(gè)單株組成的亞群是由大理茶和阿薩姆茶通過(guò)漸滲雜交形成，在表型上接近大理茶，但遺傳上與阿薩姆茶更近。

注：A：70個(gè)大理茶單株的主坐標(biāo)分析；B：ΔK隨亞群數(shù)K變化的關(guān)系圖；C：3個(gè)大理茶居群K=2, K=3和K=4時(shí)的群體結(jié)構(gòu)；DXS：大雪山居群；XZQ：香竹菁居群；BYS：白鶯山居群

大理茶是研究茶樹起源和栽培馴化的重要材料，也是茶樹品種遺傳改良的重要基因資源。近年來(lái)因野生茶和古樹茶的市場(chǎng)炒作，對(duì)大理茶的非法采伐和過(guò)渡采摘時(shí)有發(fā)生，其遺傳多樣性受到嚴(yán)重威脅。本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)臨滄市代表性大理茶居群表現(xiàn)出中等水平的遺傳多樣性，低于茶樹育成品種和地方品種[11-12]，因此應(yīng)及時(shí)加強(qiáng)這些資源的保護(hù)；同時(shí)在制定保護(hù)策略時(shí)，因遺傳變異主要存在于居群內(nèi)，應(yīng)首先考慮原地保護(hù)，并結(jié)合遷地保護(hù)對(duì)具有突出性狀的優(yōu)異資源進(jìn)行擴(kuò)繁，保證這些珍稀資源能夠合理利用和有效保護(hù)。

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Genetic Diversity and Population Structure of Wild and CultivatedPopulations

MAO Juan1,2, JIANG Hongjian3, YANG Rubing4, LI Chongxing5, MA Chengying6, CHEN Liang1, MA Jianqiang1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850000, China; 3. Lincang Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Lincang 677000, China; 4. Linxiang District Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Lincang 677000, China; 5. Tea Research Institute of Lincang, Lincang 677000, China; 6. Tea Research Institute, Guandong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510000, China

is a wild relative of tea plants (). Understanding of the genetic diversity and population structure ofis important and helpful for protecting and utilizing these germplasm resources. In this study, a set of 30 core SSR markers derived from tea plants were used for genetic analysis of three representative wild and cultivatedpopulations. The results show that all SSR markers successfully yielded specific amplification, with a range of polymorphic alleles from 2 to 14. Thevalue was between 0.041 and 0.877, with an average of 0.491. The threepopulations showed moderate levels of genetic diversity, and it was relatively lower for the Daxueshan (DXS) wild population. The inbreeding coefficient () of Xiangzhuqing (XZQ) and Baiyingshan (BYS) cultivated populations were 0.728 and 0.913 respectively, which meant high levels of inbreeding. Pairwise comparisons of the genetic differentiation index of three populations were low (<0.15), while the rates of gene flow were high (>1). The results of AMOVA exhibite that 94.1% of the genetic variation was within population. The genetic distances of wild and cultivatedindividuals were relatively higher. The genetic background of wild population was similar, while it was complex for cultivated populations. Seven individuals of BYS population were possibly originated from hybridization and introgression betweenandvar..

, SSR, genetic diversity, population structure

S571.1；Q949

A

1000-369X(2021)04-454-09

2020-12-28

2021-02-04

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2017-TRICAAS）、財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02053）、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)專項(xiàng)（201838）

毛娟，女，碩士研究生，主要從事茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究。*通信作者：majianqiang@tricaas.com

（責(zé)任編輯：趙鋒）