茶樹LOX基因家族的鑒定及其在白茶萎凋過程的表達(dá)分析

林馨穎，王鵬杰，陳雪津，郭永春，谷夢雅，鄭玉成，葉乃興

茶樹基因家族的鑒定及其在白茶萎凋過程的表達(dá)分析

林馨穎，王鵬杰，陳雪津，郭永春，谷夢雅，鄭玉成，葉乃興*

福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002

脂肪族類化合物是植物芳香物質(zhì)的重要組成部分，對(duì)白茶香氣的形成具有重要作用。利用生物信息學(xué)方法，在染色體級(jí)別的茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中，對(duì)基因家族進(jìn)行鑒定，從中獲得12個(gè)茶樹基因家族成員，命名為～。12個(gè)茶樹基因序列，主要定位于細(xì)胞質(zhì)或葉綠體中，其編碼蛋白具有相同的特征結(jié)構(gòu)域及保守基序。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明基因家族分為和兩個(gè)亞家族，、、、為亞型，其余為亞型；基因結(jié)構(gòu)分析表明含有8個(gè)外顯子，其余均含有9個(gè)外顯子；不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，該家族在茶樹嫩葉、成熟葉部位高表達(dá)；上游啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)大量與植物生長發(fā)育、光響應(yīng)、激素及脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的順式作用元件。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，基因家族在干旱、低溫及茉莉酸甲酯處理下均有不同程度的表達(dá)，在白茶不同萎凋時(shí)間處理下，、、、、、、和的表達(dá)量被誘導(dǎo)上調(diào)，4?h時(shí)表達(dá)量最高（最高上調(diào)27倍）。結(jié)果表明，基因家族成員參與白茶加工萎凋過程脂肪族香氣形成的調(diào)控，為探明白茶加工過程香氣形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

茶樹；基因；白茶萎凋；表達(dá)分析

脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）又稱亞油酸氧化還原酶[1]，是植物脂肪酸代謝途徑（LOX pathway）中的關(guān)鍵限速酶，專一催化含順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸加氧反應(yīng)，生成脂肪酸氫過氧化物（HPOs）[2]。LOX主要催化亞油酸（LA）和亞麻酸（LeA）在C9和C13位點(diǎn)發(fā)生加氧反應(yīng)，分別生成9-HPOs和13-HPOs，根據(jù)氧化位點(diǎn)不同，可以分為9-LOX和13-LOX兩種亞型[3]。LOX在植物中具有多重生理功能，可催化脂質(zhì)降解、調(diào)控營養(yǎng)器官生長及響應(yīng)生物和非生物脅迫反應(yīng)[4]。已研究發(fā)現(xiàn)擬南芥（）中有6個(gè)基因[5]，葡萄（）中有18個(gè)基因（有5個(gè)為假基因）[6]，楊樹（）中有21個(gè)基因[7]。

茶樹[(L.) O. Kuntze]是我國重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物之一[8]。香氣是衡量茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，香氣物質(zhì)主要通過脂肪酸、萜類和氨基酸等代謝途徑合成，在茶葉加工過程中脂肪酸的氧化降解是茶葉香氣形成的重要途徑之一[9]。白茶是一類微發(fā)酵茶類，其加工過程主要包括萎凋和干燥工序。在白茶萎凋過程中，萜類物質(zhì)、脂肪酸、揮發(fā)性香氣物質(zhì)等多種次級(jí)代謝物發(fā)生變化，對(duì)白茶色澤、滋味等品質(zhì)因子產(chǎn)生一定影響[10]。基因不僅參與植物多種生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)，更是脂肪族類芳香物質(zhì)生物合成的限制因子之一[11]。在茶葉加工過程中，脂氧合酶的反應(yīng)底物亞麻酸、亞油酸經(jīng)脂氫過氧化物裂解酶（HPL）、乙醇脫氫酶（ADH）等催化，最終被氧化降解形成小分子的醇、脂等化合物，形成茶葉芳香物質(zhì)的主要組成成分[12]。因此作為該代謝通路的第一個(gè)關(guān)鍵酶，基因與茶葉香氣品質(zhì)形成相關(guān)[12]。

目前，茶樹基因已有部分研究，Zhu等[9]利用茶樹基因組數(shù)據(jù)庫鑒定發(fā)現(xiàn)11條基因并對(duì)其特征及選擇性剪接圖譜進(jìn)行研究；周子維等[13]對(duì)茶樹基因家族成員的分子進(jìn)化及密碼子偏好性進(jìn)行分析。茶樹基因家族在染色體級(jí)別的茶樹基因組中尚未被鑒定及研究，特別是在白茶萎凋過程中基因的表達(dá)分析未見報(bào)道。本研究以福鼎大白茶為供試材料，從茶樹黃棪基因組中鑒定獲得的12個(gè)基因。通過生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析基因的生物信息學(xué)特征和在白茶萎凋過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，為研究基因?qū)Σ枞~萎凋過程中香氣形成作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為2019年4月在福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)教學(xué)茶園采集的福鼎大白茶（cv. Fuding Dabaicha）一芽二葉春梢。對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行萎凋處理，白茶萎凋工藝參照王鵬杰等[14]的方法：室內(nèi)自然萎凋溫度22～25℃，空氣相對(duì)濕度70%～75%。分別收集0.100?g的鮮葉（萎凋處理0?h）和萎凋處理4、8、16、24、32、40、48?h的葉片。共采集8個(gè)樣品，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用液氮快速冷凍后保存于–80℃冰箱備用。

對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行干旱、低溫及茉莉酸甲酯（MeJA）處理，具體參考郭永春等[15]的方法，收集處理6、12、24、48?h后和對(duì)照（0?h未處理）的第二葉。每個(gè)處理3次重復(fù)，錫箔紙包裹標(biāo)記，液氮速凍后保存于–80℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1家族基因的鑒定及序列分析

下載茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列（https://www.plantkingdomdb.com/tea-tree），再在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org）下載擬南芥6個(gè)LOX蛋白序列，并以此為種子序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和茶樹黃棪基因組數(shù)據(jù)庫（https://bigd.big.ac.cn/gsa/index.jsp）進(jìn)行BLAST-P比對(duì)，并獲得同一性>90%且E值<10-10的所有茶樹CsLOX家族成員的蛋白質(zhì)序列?；虻慕Y(jié)構(gòu)域信息（PF01477和PF00305）下載自Pfam數(shù)據(jù)庫（https://pfam.xfam.org），并使用HMMER軟件進(jìn)行鑒定[16]。此外，為驗(yàn)證所鑒定的茶樹基因家族，在SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）和CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）網(wǎng)站比對(duì)并進(jìn)行確認(rèn)分析。利用ExPASY（https://www.expasy.org）網(wǎng)站分析茶樹LOX蛋白的理化性質(zhì)，包括其基因組序列的編碼序列、開放閱讀框、分子量、等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)疏水性。利用在線工具WOLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。并從茶樹黃棪基因組注釋結(jié)果（GSA: CRA003208，https://bigd.big.ac.cn/gsa/index.jsp）查詢?nèi)旧w位置并利用MapGen2Ch（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）繪制染色體定位圖譜。

1.2.2基因家族結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

為預(yù)測基因家族結(jié)構(gòu)，采用DNAMAN 7.0軟件和WebLogo（https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）在線軟件分析基因家族的保守序列。從TAIR（https://www.arabidopsis.org）網(wǎng)站和Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）網(wǎng)站上下載擬南芥、水稻、葡萄的LOX氨基酸序列，與茶樹基因家族成員進(jìn)行多重序列比較。比對(duì)結(jié)果用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1?000，其他為默認(rèn)值[17]。

1.2.3基因結(jié)構(gòu)分析和保守序列分析

從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中下載茶樹外顯子和內(nèi)含子分布數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)文件，在GSDS2.0網(wǎng)站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）繪制基因結(jié)構(gòu)分布圖[18]。使用MEME工具（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì)茶樹LOX蛋白的保守基序進(jìn)行分析，設(shè)置基序數(shù)量參數(shù)為5個(gè)，其余為默認(rèn)[19]。

1.2.4基因家族的順式作用元件分析

從茶樹基因組中提取基因轉(zhuǎn)錄起始位置上游2?000?bp的序列進(jìn)行查找啟動(dòng)子順式作用元件，利用在線網(wǎng)站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）進(jìn)行順式作用元件預(yù)測分析[20]。

1.2.5基因組織特異性表達(dá)分析

基因組織特異性表達(dá)分析從中國核酸數(shù)據(jù)庫（GSA）（https://bigd.big.ac. cn/gsa/index.jsp）下載茶樹不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括芽、成熟葉、根、莖、嫩葉（GSA登錄號(hào)CRA003208）[21]，使用Trim Galore軟件過濾數(shù)據(jù)得到clean reads，將得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用Hisat2軟件進(jìn)行比對(duì)[22]，通過featureCounts軟件[23]計(jì)算基因TPM值表達(dá)水平，最后對(duì)各轉(zhuǎn)錄組基因TPM值進(jìn)行歸一化處理并制作熱圖。

1.2.6 總RNA提取和qRT-PCR

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsLOX基因家族的鑒定與染色體序列分析

經(jīng)過分析和驗(yàn)證，最終獲得12個(gè)家族成員，分別命名～?；蚓幋a序列長度為2?253～2?766?bp，編碼氨基酸數(shù)目為750～921。通過ExPASy軟件包對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，茶樹CsLOX蛋白家族分子量在85.27～102.86?kDa，等電點(diǎn)為5.66～8.40，CsLOX均屬于親水性蛋白，CsLOX1、CsLOX5等電點(diǎn)大于7.0，為堿性蛋白，其余為酸性蛋白。亞細(xì)胞預(yù)測結(jié)果表明，CsLOX1、CsLOX2、CsLOX3、CsLOX4、CsLOX7和CsLOX12等6個(gè)成員定位于細(xì)胞質(zhì)，CsLOX5、CsLOX6、CsLOX8、CsLOX9、CsLOX10和CsLOX11等6個(gè)成員定位于葉綠體（表2）。

由圖1可知，12個(gè)茶樹基因不均等分布于7條染色體（4、5、7、10、11、13、14號(hào)）上。4號(hào)染色體上有1個(gè)基因（），5號(hào)染色體上有3個(gè)基因（、、），7號(hào)染色體上有1個(gè)基因（），10號(hào)染色體上有1個(gè)基因（），11號(hào)染色體上有1個(gè)基因（），13號(hào)染色體上有1個(gè)基因（），14號(hào)染色體上有4個(gè)基因（、、、）。

2.2 CsLOX基因家族蛋白結(jié)構(gòu)域組成及進(jìn)化樹分析

在SMART工具中提取的所有茶樹基因家族成員特征結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行序列比對(duì)及l(fā)ogo分析（圖2）。從圖2可以看出，茶樹家族中的所有基因都含有特征保守結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域由38個(gè)氨基酸殘基組成，包括5個(gè)高度保守的組氨酸殘基His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His，保守性較高。將茶樹與擬南芥、水稻和葡萄的基因家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，茶樹LOX蛋白與葡萄的LOX蛋白遺傳距離較近，與水稻LOX蛋白距離最遠(yuǎn)。茶樹的12個(gè)LOX蛋白與其他3種植物的LOX蛋白分類結(jié)果相似，也可根據(jù)脂氧合酶的氧結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分類，分成9-LOX和13-LOX兩大類，其中CsLOX2、CsLOX3、CsLOX4、CsLOX7屬于9-LOX亞型，其余8個(gè)均屬于13-LOX亞型，茶樹的13-LOX蛋白家族成員數(shù)量較多。茶樹的8個(gè)13-LOX家族成員聚為2個(gè)分支，其中一個(gè)分支由CsLOX1、CsLOX5和CsLOX6組成，與葡萄的VvLOX1、VvLOX8、VvLOX13蛋白、擬南芥的AtLOX1、AtLOX3、AtLOX4蛋白、水稻OsLOX2、OsLOX10蛋白聚成一支。其余蛋白聚為為一支。遺傳距離越近，表明蛋白結(jié)構(gòu)和功能更為相似，茶樹的LOX蛋白功能可能與葡萄、擬南芥和水稻的特定LOX蛋白具有相似的生理作用。

2.3 CsLOX家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

采用GSDS2.0在線工具比較茶樹基因家族的內(nèi)含子和外顯子（圖4），在12個(gè)基因結(jié)構(gòu)中，除了CsLOX1外顯子數(shù)量為8，其余均為9。家族基因組序列最長的是，長度超過25?kbp。為了進(jìn)一步探究茶樹基因家族序列的保守性，利用MEME對(duì)鑒定到的12個(gè)基因家族進(jìn)行保守基序鑒定，如圖5所示，12個(gè)基因均含有基序1～5。由此可見，基因家族保守性高，穩(wěn)定性好。

表2 茶樹CsLOX基因家族的序列特征

圖1 CsLOX家族基因在茶樹染色體上的分布

注：A：縱坐標(biāo)為氨基酸序列堆疊的高度，表示該位置處的序列保守性；橫坐標(biāo)為氨基酸序列排列的順序，表示該位置的每個(gè)氨基酸的相對(duì)頻率；B：利用DNAMAN7.0軟件對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對(duì)齊

注：AtLOX：擬南芥；OsLOX：水稻；VvLOX：葡萄；CsLOX：茶樹

圖4 茶樹CsLOX基因結(jié)構(gòu)分析

注：A：茶樹LOX家族系統(tǒng)進(jìn)化樹；B：茶樹LOX家族保守基序分布；C：基序logo分析

2.4 CsLOX基因順式作用元件分析

為了研究茶樹基因順式作用元件的功能，用其轉(zhuǎn)錄起始位置上游2?000?bp的序列查找各類順式作用元件，共鑒定出28種順式作用元件，包括生長作用順式元件4種、激素響應(yīng)順式元件7種、脅迫響應(yīng)順式元件4種及光響應(yīng)順式元件13種。重點(diǎn)對(duì)基因啟動(dòng)子中的生長作用順式元件、激素響應(yīng)順式元件和脅迫響應(yīng)順式元件進(jìn)行分析（圖6），基因啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件中，光響應(yīng)順式元件最多：MRE、BOX4、GATA-motif、GT1-motif、G-BOX、G-box、TCT-motif、I-box、GA-motif共9種，113個(gè)；響應(yīng)激素的順式元件包括脫落酸響應(yīng)元件（ABRE，22個(gè)）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（CGTCA-motif，6個(gè)；TGACG-motif，6個(gè)）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element，6個(gè)）、生長素響應(yīng)元件（TGA-element，3個(gè)）、赤霉素響應(yīng)元件（P-box，5個(gè)；GARE-motif，5個(gè)）；生長作用元件包括調(diào)控分生表達(dá)組織元件（CAT-box，8個(gè)）、調(diào)控玉米醇溶蛋白代謝元件（O2-site，6個(gè)）、參與晝夜節(jié)律調(diào)控元件（Circadian，1個(gè)）、參與表達(dá)調(diào)控元件（MotifI，1個(gè)）和干旱響應(yīng)元件（MBS，2個(gè)）、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件（ARE，25個(gè)）和防御和應(yīng)激響應(yīng)元件（TC-rich，10個(gè)）、低溫響應(yīng)元件（LTR，1個(gè)）。這些結(jié)果預(yù)示了茶樹基因家族在茶樹生長發(fā)育及響應(yīng)光照、激素和脅迫中存在一定的作用。

2.5 CsLOX基因在不同組織中的表達(dá)模式

為了研究基因家族在茶樹生長發(fā)育過程中的表達(dá)模式，從網(wǎng)上下載茶樹5個(gè)組織（芽、成熟葉、根、莖、嫩葉）的轉(zhuǎn)錄組，分析12個(gè)基因在茶樹這5個(gè)組織中的表達(dá)模式（圖7）。結(jié)果表明，在茶樹芽、成熟葉、根、莖、嫩葉中表達(dá)量均較低，其他成員在各個(gè)組織均有不同程度的特異性表達(dá)。嫩葉與成熟葉作為茶樹重要的部位，具有重要作用，而、、在嫩葉中具有較高表達(dá)，、、、、在成熟葉中有較高表達(dá)，基因家族在茶樹組織中具有重要作用?？傮w來看，茶樹基因家族在茶樹莖中幾乎不表達(dá)；在根中除了、有較高表達(dá)量，其余茶樹基因表達(dá)量較少。

2.6 不同脅迫處理對(duì)CsLOX基因表達(dá)的影響

為研究基因家族在逆境下的作用，對(duì)12個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR，對(duì)其在MeJA激素（圖8）、低溫（圖9）和干旱（圖10）處理?xiàng)l件下的表達(dá)量進(jìn)行分析。

基因家族在MeJA激素處理?xiàng)l件下，以0?h處理下的基因表達(dá)量為對(duì)照，、、、在所有時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中在24?h表達(dá)量上調(diào)達(dá)到最高22倍，在24?h表達(dá)量上調(diào)達(dá)13倍。、、在所有時(shí)間點(diǎn)上表達(dá)量均顯著下調(diào)。在12?h和48?h表達(dá)量顯著上調(diào)，在48?h顯著下調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)，在6?h和24?h表達(dá)量顯著上調(diào)。在24?h表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)4倍。

注：顏色刻度表示log2轉(zhuǎn)換后的值，紅色代表高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)

注：不同小寫字母表示同一基因在不同組織中的表達(dá)差異（P<0.05）。下同

圖9 低溫脅迫下茶樹CsLOX基因家族表達(dá)分析

基因家族在低溫脅迫下，以0?h處理下的基因表達(dá)量為對(duì)照，在24?h表達(dá)量顯著上調(diào)，在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均下調(diào)，在12?h時(shí)顯著下調(diào)，在12、48?h時(shí)顯著下調(diào)。、、、和在6、12、24?h及48?h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均上調(diào)，其中在24?h時(shí)上調(diào)近20倍。在6?h和24?h表達(dá)量顯著上調(diào)；在12?h時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)，其余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)；在6?h顯著上調(diào)，其后的時(shí)間點(diǎn)呈逐步降低的趨勢，并在48?h時(shí)顯著下調(diào)；在6?h和24?h表達(dá)量顯著上調(diào)。

基因家族在干旱處理下，以0?h處理下的基因表達(dá)量為對(duì)照，在24?h和48?h表達(dá)量顯著下調(diào)；在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中在48?h時(shí)表達(dá)量上調(diào)近20倍。在48?h表達(dá)量顯著下調(diào)，在24?h表達(dá)量顯著下調(diào)，在6?h表達(dá)量顯著下調(diào)，后逐步增加，48?h時(shí)達(dá)顯著上調(diào)。、、和在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均顯著下調(diào)。在6?h時(shí)顯著下調(diào)后逐步上調(diào)，但為達(dá)到顯著水平。在6?h時(shí)表達(dá)量上調(diào)2倍。

2.7 白茶萎凋過程中CsLOX基因表達(dá)的變化規(guī)律

通過qRT-PCR對(duì)基因在白茶萎凋處理0、4、8、16、24、32、40、48?h后的表達(dá)水平進(jìn)行分析，其中以0?h的處理為對(duì)照（圖11）。研究發(fā)現(xiàn)，在白茶不同萎凋時(shí)間點(diǎn)，12個(gè)茶樹的基因均被誘導(dǎo)表達(dá)，但有不同時(shí)間點(diǎn)存在一定的差異。、、等3個(gè)基因表達(dá)均呈下調(diào)趨勢，、、、、、、、等8個(gè)基因在4?h表達(dá)均呈上調(diào)趨勢，其中，在4?h時(shí)表達(dá)量最高，高達(dá)對(duì)照表達(dá)量的27倍，其次為、、。

3 討論

本研究通過茶樹黃棪基因組數(shù)據(jù)分析得到12個(gè)基因，其中13-LOX亞型家族成員8個(gè)，9-LOX亞型家族成員4個(gè)。通過對(duì)基因家族蛋白信息和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)地分析發(fā)現(xiàn)，茶樹CsLOX蛋白序列均含有一段由38個(gè)保守氨基酸構(gòu)成的序列His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是脂氧合酶潛在的與非血紅素鐵結(jié)合的位點(diǎn)，在維持脂肪酸氧合酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性上起著至關(guān)重要的作用[25]。在杜仲基因家族的研究中發(fā)現(xiàn)，13-LOX亞型易以基因簇形式分布，表明基因進(jìn)化過程中發(fā)生了復(fù)制，形成串聯(lián)重復(fù)，基因復(fù)制具有重要作用，可產(chǎn)生新基因并發(fā)生亞功能化或新功能化[26]，在茶樹基因家族染色體序列及基因結(jié)構(gòu)分析中也有同樣發(fā)現(xiàn)。對(duì)外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行研究，有助于了解基因在結(jié)構(gòu)和功能上的差異，茶樹基因家族內(nèi)含子、外顯子數(shù)量幾乎一致，說明是一種高度保守的基因，這與在擬南芥、葡萄基因中的研究結(jié)果一致[5-6]。

圖10 PEG脅迫下茶樹CsLOX基因家族表達(dá)分析

圖11 CsLOX基因在不同萎凋時(shí)間處理下的表達(dá)分析

許多研究表明，基因可在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。通過對(duì)茶樹不同組織轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析表明，基因家族在茶樹葉片（成熟葉、嫩葉）表達(dá)量較高，在芽、根中部分基因表達(dá)，在莖中幾乎不表達(dá)，該結(jié)果與Zhu等[9]在茶樹基因中的研究一致。此外，在茶樹基因啟動(dòng)子區(qū)域的分析中發(fā)現(xiàn)CAT-box、O2-site等與分生組織表達(dá)調(diào)控相關(guān)的響應(yīng)元件，說明了基因家族在茶樹生長發(fā)育中有重要作用?；蛟谥参锲鞴伲òǜ⑶o、芽、葉、花、果實(shí)等）和細(xì)胞器（包括液泡、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、脂球體和胞漿等）中具有廣泛分布的特點(diǎn)，其存在部位的不同可能意味著功能差異[27]。定位于細(xì)胞質(zhì)的調(diào)控了馬鈴薯塊莖發(fā)育[27]和擬南芥?zhèn)雀纬蒣28]。此外，定位于葉綠體的在番茄果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中，對(duì)脂肪族類香氣物質(zhì)的形成以及逆境條件下葉片組織中JA生物合成過程都具有作用[29]?；虻膩喖?xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，主要存在于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)中，這暗示了基因與茶樹脂肪族類香氣物質(zhì)形成有關(guān)。

迄今為止，白茶萎凋過程中萜類合成酶等與香氣形成相關(guān)基因研究較多，如、和等在萎凋過程0～4?h和16～24?h表達(dá)量呈上升趨勢，單萜類化合物得到快速積累[30]，而對(duì)于脂肪族類香氣物質(zhì)形成的分子機(jī)理研究較少。已有研究表明，是脂肪族類香氣物質(zhì)合成的主要限制因子之一，屬于多基因編碼的一類酶，但并非所有的基因家族成員都參與芳香物質(zhì)的形成[11]。目前，通過對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)與基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，獼猴桃中的和與己醛、己烯醛的合成相關(guān)[31]；在桃果實(shí)芳香物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，和與內(nèi)脂含量相關(guān)，而和與C6醛的合成相關(guān)，參與合成芳香性揮發(fā)物質(zhì)[32]。前人研究發(fā)現(xiàn)，茶葉加工過程中作為脂肪酸氧化降解過程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，基因與茶葉香氣品質(zhì)形成相關(guān)[12]。Fu等[33]以金萱品種春梢的一芽三葉為材料，探究發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)處理下，鮮葉萎凋后基因表達(dá)發(fā)生不同變化。王陽明等[34]對(duì)茶樹酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)基因通過對(duì)酶類的催化生成一系列脂肪族類香氣物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，在白茶萎凋過程中基因家族表達(dá)也類似表達(dá)，、、、、、、、這8個(gè)基因在萎凋歷時(shí)4?h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高點(diǎn)（最高上調(diào)27倍），而其他基因表達(dá)并非如此。由此表明，茶樹基因家族并非所有成員參與白茶脂肪族類香氣的形成，而是部分基因在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)白茶萎凋過程香氣物質(zhì)形成。

前人在茶樹組轉(zhuǎn)錄組中鑒定到11個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)成員在病蟲害脅迫下表達(dá)水平上調(diào)，3個(gè)成員在低溫脅迫下表達(dá)水平升高，3個(gè)成員在MeJA處理后表達(dá)水平上升，表達(dá)上調(diào)高達(dá)117倍[9]。本研究通過對(duì)基因家族在干旱、低溫及MeJA處理，發(fā)現(xiàn)基因有不同程度的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，干旱脅迫下最高上調(diào)20倍，低溫脅迫下最高上調(diào)20倍，MeJA激素處理下最高上調(diào)22倍。并通過對(duì)茶樹基因啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)大量與激素及脅迫響應(yīng)調(diào)控相關(guān)的順式元件，尤其是乙烯、赤霉素、脫落酸等激素響應(yīng)元件和低溫、干旱等非生物脅迫元件，這預(yù)示基因家族可能通過各種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與脅迫響應(yīng)過程。

本研究在染色體級(jí)別的茶樹基因組數(shù)據(jù)中鑒定出12個(gè)基因，對(duì)基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)分析、啟動(dòng)子順式元件分析及qRT-PCR分析白茶萎凋不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，推測在白茶萎凋過程中基因家族成員參與脂肪族類香氣形成，為闡明白茶加工過程中脂肪族香氣形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Identification ofGene Family inand Expression Analysis in the Process of White Tea Withering

LIN Xinying, WANG Pengjie, CHEN Xuejin, GUO Yongchun, GU Mengya,ZHENG Yucheng, YE Naixing*

College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian,Fuzhou 350002, China

Aliphatic compounds are an important part of plant aromatic substances and play an important role in the composition of white tea aroma. This study used bioinformatics methods to identify thegene family in the chromosome-level tea plant genome database, and obtained 12 tea plantgene family members, named-. The 12 tea plantare mainly located in the cytoplasm or chloroplast. The encoded proteins have the same characteristic domains and conserved motifs. Phylogenetic tree analysis shows that thegene family is divided into two subfamilies: 9-LOX and 13-LOX.,,, andbelong to 9-LOX subtypes, and the rest belong to 13-LOX subtypes. Gene structure analysis shows thatcontains 8 exons, the rest contain 9 exons. The transcriptome data analysis of different tissues shows that the family genes are highly expressed in the tender and mature leaves of tea plants. The upstream promoter region analysis finds a large number of-acting elements closely related to plant development, light response, hormone and stress response. Fluorescence quantitative PCR detection reveals that thegenes were expressed to varying degrees under drought, low temperature and MeJA hormone treatment. Under the treatment of different withering time of white tea, the expression levels of,,,,,,andwere induced, with the peaks at 4?h (up to 27-fold increase). The results of this study show that members of thegene family participate in the regulation of the formation of aliphatic aromas during the process of white tea withering, laying a foundation for understanding the molecular mechanism of aroma formation during tea processing.

,gene, white tea withering, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2021)04-482-15

2020-11-17

2021-01-09

福建農(nóng)林大學(xué)茶產(chǎn)業(yè)鏈科技創(chuàng)新與服務(wù)體系建設(shè)項(xiàng)目（2020-01）、福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金（CXZX2017181）、福建張?zhí)旄２枞~發(fā)展基金會(huì)科技創(chuàng)新基金（FJZTF01）

林馨穎，女，碩士研究生，主要從事茶樹栽培育種與生物技術(shù)研究，12565769@qq.com。*通信作者：ynxtea@126.com

（責(zé)任編輯：趙鋒）