臭氧后處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究〔1〕

余盛龍，郭惠莊，陳漢威

(1.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400；2.廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400)

在我國(guó)，隨著社會(huì)人口老齡化以及人們生活方式的改變，冠心病并發(fā)缺血性心肌病的發(fā)病率呈增高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來，冠脈的介入治療得到了廣泛開展，但是，術(shù)后可能出現(xiàn)的缺血再灌注損傷也逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)問題，越來越受到關(guān)注和重視。因此，尋找有效防治缺血再灌注損傷的方法具有重大意義。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)臭氧(O3)能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的功能代謝，應(yīng)用臭氧處理可以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕再灌注造成的損傷[1-3]。不僅在骨關(guān)節(jié)病、口腔、腫瘤等領(lǐng)域有較多報(bào)道，而且臭氧治療急性期腦梗死、腎臟缺血再灌注損傷等亦有一定療效。但是，迄今為止，尚無臭氧與急性心肌梗死再灌注損傷的在體基礎(chǔ)研究報(bào)道，即使是離體研究也較少。對(duì)于缺血再灌注損傷的防治，目前大多數(shù)研究都局限于缺血預(yù)處理，然而，缺血預(yù)處理需要在發(fā)生缺血前進(jìn)行，而急性心肌梗死特點(diǎn)是起病的突發(fā)性和嚴(yán)重性，這就使得缺血預(yù)處理因?yàn)槭チ藨?yīng)用的時(shí)機(jī)而價(jià)值大打折扣。針對(duì)上述問題，本研究中制作心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型，從細(xì)胞水平觀察臭氧后處理對(duì)H/R心肌細(xì)胞活性、細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、凋亡的影響，并觀察臭氧處理前后熱休克蛋白(HSP70)表達(dá)的變化以及使用HSP70抑制劑(PES)處理后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，探討臭氧后處理保護(hù)心肌細(xì)胞H/R損傷的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞并建立心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注模型

培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞并建立心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注損傷(SIRI)模型：先后分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，采用免疫熒光法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。參照文獻(xiàn)[4]介紹的實(shí)驗(yàn)方法，模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞接受缺血再灌注損傷的過程，建立心肌細(xì)胞H/R損傷模型。

1.1.1 培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞

SD乳鼠(出生24 h內(nèi))，使用75%的乙醇進(jìn)行消毒，并用5%的異氟醚麻醉；在乳鼠胸骨左緣第3、4肋間處剪開胸腔，雙手配合，打開胸腔，將心臟從胸腔內(nèi)取出，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗后剪除心房和右心室，保留左心室，然后冰凍切片；把心肌切片置于1 mg/mL膠原酶的羥乙基呱嗪乙硫磺酸(HEPES)緩沖液中消化，重復(fù)消化3 次，每次3～5 min；用含10%血清的改良的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)溶液終止消化，將細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞過濾器中，去除較大的組織碎片；將所得細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)瓶，預(yù)置2 h，消除成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；收集不黏附細(xì)胞，接種于96 孔板上，在37 ℃細(xì)胞孵箱培養(yǎng)72 h；采用免疫熒光法對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定；將心肌細(xì)胞接種到適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 建立心肌細(xì)胞SIRI模型

使用細(xì)胞缺氧液置換培養(yǎng)液模擬心肌細(xì)胞SIRI過程，缺氧液配方為：NaCl 137 mmol/L，KCl 12 mmol/L，MgCl20.49，CaCl2·2H2O 0.9 mmol/L，HEPES 4 mmol/L，脫氧葡萄糖10 mmol/L，亞硫酸鈉0.75 mmol/L，乳酸鈉20 mmol/L，pH 6.5。缺氧時(shí)除了使用缺氧液，再給予94%N2，5%CO2和1%O2的混合氣體以2 L/min的流速通氣置換空氣，時(shí)間為4 h。缺氧、缺血孵化后更換新鮮培養(yǎng)基，并置于正常的孵箱環(huán)境(5%CO2和95%O2)，繼續(xù)孵化6 h，制成心肌細(xì)胞SIRI模型。

1.2 探索最佳的實(shí)驗(yàn)臭氧濃度

實(shí)驗(yàn)分為5 組：正常對(duì)照(control)組、H/R組、臭氧不同濃度(1 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L)+H/R組。應(yīng)用CCK-8試劑盒(日本Dojindo Lab)檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率，評(píng)估細(xì)胞損傷情況，研究臭氧對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用，確定臭氧最佳濃度。

1.3 臭氧后處理保護(hù)心肌細(xì)胞H/R損傷的作用機(jī)制

實(shí)驗(yàn)分為5組：正常對(duì)照組、臭氧組、H/R組、臭氧+H/R組，臭氧+PES+H/R組。應(yīng)用CCK-8試劑盒(日本Dojindo Lab)檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用全自動(dòng)生化儀、Elisa試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活性。評(píng)估細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激損傷情況。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)HSP70表達(dá)水平，探討臭氧保護(hù)心肌細(xì)胞H/R損傷的作用機(jī)制。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

H/R造模后各濃度臭氧(1 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L)均可減輕心肌細(xì)胞H/R模型誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和存活率下降，其中濃度5 μmol/L效果最好(見圖1和圖2)。

圖1 各組心肌細(xì)胞存活率比較

圖2 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

臭氧后處理可減輕心肌細(xì)胞H/R模型誘導(dǎo)的損傷，與H/R組比較，臭氧+H/R組心肌細(xì)胞存活率上升，凋亡率下降，LDH活性、MDA濃度顯著降低，而SOD活性、HSP70表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；臭氧+PES+H/R組與臭氧+H/R組比較，心肌細(xì)胞存活率、SOD活性、HSP70表達(dá)水平均下降，而心肌細(xì)胞凋亡率、LDH活性、MDA濃度均不同程度上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3～圖8)。

圖3 各組心肌細(xì)胞存活率比較

圖4 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

圖5 各組心肌細(xì)胞LDH活性比較

圖6 各組心肌細(xì)胞MDA濃度比較

圖7 各組心肌細(xì)胞SOD活性比較

圖8 各組心肌細(xì)胞HSP70表達(dá)水平比較

3 討 論

缺血再灌注損傷(IRI)是指缺血期處于可逆損傷的組織細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)血液再灌注后，損傷加重或轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷[5]?！皶r(shí)間就是心肌，時(shí)間就是生命”，對(duì)于急性心肌梗死患者，既往的治療關(guān)注于盡快恢復(fù)缺血冠狀動(dòng)脈的血流、盡可能縮小心肌的梗死面積。然而，再灌注治療的過程也易加重氧化應(yīng)激損傷，不僅未能使組織細(xì)胞缺血性損害得到減輕或恢復(fù)，反而進(jìn)一步加劇心肌細(xì)胞的損傷[6]。自從提出缺血再灌注損傷的概念以后，人們對(duì)缺血再灌注損傷的研究一直沒停止過，學(xué)者們先后提出了氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、自由基增多、鈣超載、炎癥反應(yīng)、酸中毒等多種損傷機(jī)制學(xué)說[1，7]。其中，在眾多發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，生理情況下機(jī)體產(chǎn)生的活性氧(ROS)很少，而且體內(nèi)存在抗自由基氧化的防御系統(tǒng)，ROS的產(chǎn)生和清除存在動(dòng)態(tài)平衡。但在某些病理情況下，機(jī)體這一平衡遭到破壞，ROS產(chǎn)生的速率大于被清除的速率，造成ROS蓄積。ROS有十分活潑的反應(yīng)性，能與各種細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。因此抗氧化劑的應(yīng)用在防治缺血再灌注損傷中顯得尤為重要。臭氧是氧氣的同素異形體，擁有特殊臭味，常溫、常態(tài)及常壓下，低濃度時(shí)為無色氣體，當(dāng)濃度達(dá)15%以上時(shí)為藍(lán)色氣體。臭氧分子不是一個(gè)自由基分子，但它的活性要比氧活躍很多，氧化能力極強(qiáng)。利用外軌道帶有的成對(duì)電子，在細(xì)胞內(nèi)外通過生物化學(xué)反應(yīng)，生成類似ROS的物質(zhì)。近年來，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)臭氧除了具有強(qiáng)大的抗氧化活性和自由基清除能力外，還有抗排斥反應(yīng)、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能、提高認(rèn)知功能等功效，并廣泛應(yīng)用于大腦、骨骼肌、肝臟、腎臟等器官相關(guān)疾病救治中[8]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，狗心臟多次短暫的缺血可以減輕隨后較長(zhǎng)時(shí)間的缺血再灌注帶來的心肌損傷，由此提出缺血預(yù)處理的概念。缺血預(yù)處理是在嚴(yán)重心肌缺血發(fā)生前，通過誘導(dǎo)反復(fù)多次短時(shí)間的非致死性缺血再灌注，以激活機(jī)體內(nèi)在的保護(hù)機(jī)制，提高心肌細(xì)胞自身抗損傷的耐受性或適應(yīng)性，已被許多實(shí)驗(yàn)研究[9-10]證實(shí)是縮小心肌梗死面積、保護(hù)心肌細(xì)胞的有效方法。然而，缺血預(yù)處理需要在發(fā)生缺血前進(jìn)行，而在實(shí)際臨床工作中，急性心肌梗死特點(diǎn)是急、危、重，疾病的發(fā)生往往是突發(fā)的，不可預(yù)知的，這就使缺血預(yù)處理的應(yīng)用價(jià)值明顯受限。

近年來，學(xué)者們[11-12]提出了缺血后處理的概念，為缺血再灌注損傷的防治提供了一個(gè)新的思路及方向。根據(jù)缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，后處理的作用機(jī)制涉及ROS、內(nèi)源性自身激活物、線粒體ATP敏感性鉀通道、一氧化氮、再灌注損傷補(bǔ)救激酶途徑、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔等多方面作用。已有學(xué)者[13]將其應(yīng)用于臨床，并取得了一定的心肌保護(hù)效果。但目前文獻(xiàn)報(bào)道用于模擬后處理的藥物并不多，主要有腺苷、阿片類物質(zhì)、揮發(fā)性麻醉藥物等，且由于藥物本身的不良反應(yīng)(如阿片類物質(zhì))或藥物本身的特點(diǎn)(如揮發(fā)性麻醉藥物)，使其臨床應(yīng)用受到了較大限制；而腺苷只是從改善心肌細(xì)胞能量代謝方面發(fā)揮一定的作用，途徑較單一。HSP70是一種非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白，是HSP家族中最重要的一員，具有多種生物學(xué)功能。近年來隨著對(duì)熱休克蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，其在缺血再灌注損傷中的作用也逐漸受到重視。研究[14-15]表明，HSP70在減輕心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用。本項(xiàng)目制作心肌細(xì)胞H/R模型，從細(xì)胞水平觀察臭氧后處理對(duì)H/R心肌細(xì)胞活性、細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、凋亡的影響；觀察臭氧處理前后HSP70蛋白表達(dá)的變化，探討臭氧后處理保護(hù)心肌H/R損傷的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧可造成心肌細(xì)胞損傷，表明心肌H/R損傷模型構(gòu)建成功；采用臭氧后處理干預(yù)H/R心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)臭氧具有保護(hù)心肌細(xì)胞損傷、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)臭氧的干預(yù)處理后，增強(qiáng)了HSP70的表達(dá)，而HSP70抑制劑PES可增加細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激損傷和凋亡，減少HSP70的表達(dá)，阻斷了臭氧對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。因此，通過上調(diào)HSP70的表達(dá)可能是臭氧減輕心肌細(xì)胞H/R損傷的作用機(jī)制之一。