骨痹湯對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶-13及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β₁的影響

李陽(yáng) 張麗曼 張立穎 狄生云 王菲 姜雪原

摘要 目的：探討骨痹湯對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的影響。方法：選擇健康SD大鼠40只，建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，每組20只。對(duì)照組造模術(shù)后不予治療，觀察組自造模成功后，給予骨痹湯熏蒸治療，療程4個(gè)周。治療后，比較每組大鼠痛閾、膝關(guān)節(jié)周徑及膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度情況。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13及TGF-β1表達(dá)變化情況。結(jié)果：治療后，觀察組痛閾、膝關(guān)節(jié)周徑及膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍比對(duì)照組明顯改善（P<0.05）;治療后，觀察組MMP-13表達(dá)水平明顯下降，且明顯低于對(duì)照組（P<0.05）;治療后，觀察組TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，且明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：骨痹湯可改善膝骨關(guān)節(jié)炎的疼痛，減少軟骨中MMP-13的表達(dá)，延緩骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，并明顯上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)軟骨修復(fù)。

關(guān)鍵詞 骨痹湯;熏蒸治療;骨關(guān)節(jié)炎;膝關(guān)節(jié);基質(zhì)金屬蛋白酶-13;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;疾病模型;動(dòng)物

Abstract Objective：To investigate the effect of Gubi Decoction on matrix metalloproteinase-13 and transforming growth factor β1 in knee osteoarthritis rats.Methods：A total of 40 healthy SD rats were selected to establish knee osteoarthritis model，and randomly divided into a control group and a treatment group，with 20 rats in each group.The control group was not treated after the model making operation，and the treatment group was given fumigating and steaming treatment of Gubi Decoction for 4 weeks.After treatment，the pain threshold，the diameter of the knee joint and the activity of the knee joint were compared.The expression of matrix metalloproteinase-13（MMP-13）and transforming growth factor β1（TGF-β1）in articular cartilage of rats in each group was detected by immunohistochemistry.Results：After treatment，the pain threshold，the diameter of knee joint and the range of motion of knee joint in the treatment group were significantly improved，compared with the control group（P<0.05）; the expression level of MMP-13 in the treatment group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）; the expression level of TGF-β1 in the treatment group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）.Conclusion：Gubi Decoction can improve the pain of knee osteoarthritis，reduce the expression of MMP-13 in cartilage，delay the development of osteoarthritis，and obviously up regulate the expression of TGF-β1 to promote cartilage repair.

Keywords Gubi Decoction; Fumigation treatment; Osteoarthritis; Knee joint; Matrix metalloproteinase-13; Transforming growth factor beta 1; Disease model; Animal model

中圖分類號(hào)：R289.5;R684文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.006

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是臨床常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，中老年人是高發(fā)人群，其中以膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是最為常見(jiàn)[1]。隨著我國(guó)人口老齡化的不斷加劇，KOA的發(fā)病率不斷增高，其具有極高的致殘率，給患者的生命質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重影響[2]。KOA的病理基礎(chǔ)是關(guān)節(jié)軟骨呈現(xiàn)退行性的病變，臨床癥狀主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)活動(dòng)受限、疼痛、行走困難，膝關(guān)節(jié)畸形等[3-4]。早中期KOA可采取非手術(shù)治療，晚期則需要進(jìn)行手術(shù)治療[5]。早中期若能有效藥物治療，可促進(jìn)膝關(guān)節(jié)組織軟骨的修復(fù)，有效延遲病變進(jìn)程。西醫(yī)通常采用口服塞來(lái)昔布、布洛芬等非甾體抗炎藥物及關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉的方式來(lái)緩解膝關(guān)節(jié)疼痛，潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，達(dá)到治療的目的，但長(zhǎng)期用藥會(huì)增加各種不良反應(yīng)[6]。中醫(yī)對(duì)KOA的治療方式較多，包括中藥內(nèi)服外用、針灸、推拿、小針刀及中藥熏蒸等，均具有一定的療效[7]。骨痹湯具有補(bǔ)益肝腎及化痰祛瘀的作用，通過(guò)熏蒸的方式使藥物滲透進(jìn)膝關(guān)節(jié)周圍，從而更好發(fā)揮其作用，達(dá)到舒筋通絡(luò)、活血止痛的作用，并無(wú)不良反應(yīng)[8]。本研究通過(guò)對(duì)KOA大鼠給予骨痹湯熏蒸治療，探討其對(duì)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的影響，闡述其治療KOA的可能作用機(jī)制，以期為KOA的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用健康SD大鼠（動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)：SCXK（京）2018-0021）40只，體質(zhì)量16～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室中（室溫20～24 ℃，濕度40%～60%）觀察3 d后，用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 骨痹湯制作：乳香10 g、沒(méi)藥10 g、艾葉20 g、海桐皮20 g、透骨草30 g、蘇木20 g、紅花15 g、防風(fēng)10 g、伸筋草30 g、木瓜15 g、淫羊藿15 g、羌活10 g、獨(dú)活10 g、川牛膝15 g、澤蘭15 g、桂枝20 g。自動(dòng)煎藥機(jī)煎煮成70%濃度的中藥液保存。

1.1.3 試劑與儀器 二甲苯（批號(hào)：190712）、枸櫞酸鹽（批號(hào)：191104）、PBS（批號(hào)：190805）、過(guò)氧化氫溶液（批號(hào)：190415）、DBA試劑盒（批號(hào)：190904）、大鼠抗MMP-13（批號(hào)：190813）、TGF-β1（批號(hào)：191005）以上均由北京歐北生物科技有限公司提供。切片機(jī)（Leica，德國(guó)，型號(hào)：RM2245，），顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號(hào)：Olympus IX71），恒溫箱（上海醫(yī)療器械廠有限公司，型號(hào)：ZLHS-80-LS），甩尾測(cè)痛儀（成都泰盟軟件有限公司，型號(hào)：SW-200），自制動(dòng)物熏蒸裝置。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只SD大鼠隨機(jī)分對(duì)照組和觀察組，每組20只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用單側(cè)跟腱切除法，建立KOA模型。

1.2.2 干預(yù)方法 2組大鼠術(shù)后均常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)，對(duì)照組不采取任何干預(yù)措施，觀察組建模成功后第2天，給予骨痹湯熏蒸治療：將大鼠放入自制動(dòng)物熏蒸裝置進(jìn)行全身熏蒸，蒸汽溫度為40 ℃，1次/d，20 min/次，連續(xù)治療4周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 在造模前及治療4周后，采用熱輻射甩尾測(cè)痛儀對(duì)2組大鼠的痛閾進(jìn)行測(cè)量。造模前及治療4周后，將2組大鼠膝關(guān)節(jié)伸展，回縮膝關(guān)節(jié)，采用量角器測(cè)量其伸展至回縮的角度。造模前及治療4周后，采用無(wú)彈性的軟皮尺測(cè)量大鼠膝關(guān)節(jié)的周徑。

治療4周后，處死各組大鼠后，取其后肢膝關(guān)節(jié)股骨端軟骨作為標(biāo)本，放入10%中性甲醛溶液固定，15%EDTA溶液中脫鈣、脫水、透明，石蠟包埋后連續(xù)切片（厚度：5 μm），采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MMP-13及TGF-β1表達(dá)情況：將切片并放入60 ℃恒溫箱烤片過(guò)夜，二甲苯脫蠟，依次放入95%、85%、80%及75%的乙醇中各10 min，蒸餾水浸泡5 min后加入3%過(guò)氧化氫溶液50 μL，20 ℃孵育10 min，PBS沖洗3次，加入50 μL的一抗，4 ℃下過(guò)夜后，加入二抗，20 ℃孵育10 min，DBA試劑盒顯色，放入顯微鏡下觀察，顯色后用蒸餾水洗掉，終止顯色，采取蘇木精復(fù)染2 min，中性樹(shù)膠封片。并以細(xì)胞呈棕黃色染色判斷為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)抽取4個(gè)400×高倍鏡視野，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，并進(jìn)行百分比評(píng)分（PP），標(biāo)準(zhǔn)為[9]：1）0分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞;2）1分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%;3）2分：5%<陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤20%;4）3分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比>20%;對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分（SI）：1）0分：無(wú)染色;2）1分：淡黃色;3）2分：棕黃色;4）3分：棕褐色。免疫反應(yīng)評(píng)分（IRS）=PP×SI。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠的痛閾、膝關(guān)節(jié)周徑及膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度情況

治療后，觀察組痛閾、膝關(guān)節(jié)周徑及膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍比對(duì)照組明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 2組大鼠軟骨組織MMP-13及TGF-β1表達(dá)情況

治療后，觀察組MMP-13表達(dá)水平明顯下降，且明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），觀察組TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，且明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2，圖1～2。

3 討論

KOA是臨床最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)性疾病，其病理特點(diǎn)主要表現(xiàn)為軟骨下骨硬化、肌肉萎縮無(wú)力、滑膜增生、關(guān)節(jié)囊攣縮、關(guān)節(jié)軟骨不同程度的破壞等[10]。KOA的發(fā)病機(jī)制主要有自身免疫反應(yīng)學(xué)說(shuō)、軟骨細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、軟骨酶降解學(xué)說(shuō)和軟骨機(jī)制內(nèi)的穩(wěn)態(tài)失衡學(xué)說(shuō)等[11]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA屬于“膝痹”“骨痹”“筋痹”等范疇，認(rèn)為外邪（風(fēng)、寒、濕等）入侵肌腠、經(jīng)絡(luò)及筋骨關(guān)節(jié)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷，從而引發(fā)KOA，多數(shù)KOA屬于痰濕內(nèi)阻、肝腎虧虛、氣虛血瘀等，多屬本虛標(biāo)實(shí)，因此臨床治療多以祛濕化痰，祛瘀化痰及補(bǔ)益肝腎為宗旨[12]。

中藥熏蒸是中醫(yī)的一種治療方法，具有悠久的歷史，其操作簡(jiǎn)單，適用較廣，并有明顯的療效[13]。本研究中的骨痹湯藥方中的伸筋草、透骨草、蘇木及海桐皮具有舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)濕的功效;乳香、紅花及沒(méi)藥具有止痹痛，理氣活血的效果;艾葉具有通痹舒筋，溫經(jīng)散寒的功效;羌活、防風(fēng)及獨(dú)活可起到勝濕止痛，祛風(fēng)解表的功效;淫羊藿具有止痹痛，補(bǔ)肝腎之功效;木瓜可起到緩解筋脈拘攣、風(fēng)濕痹痛的作用;川牛膝可強(qiáng)筋骨，益肝腎，活血化瘀，通利血脈，利關(guān)節(jié)，桂枝具有溫通經(jīng)脈，發(fā)汗解肌的功效;諸藥共用，可起到祛痰濕、補(bǔ)肝腎、通經(jīng)脈、緩拘攣及止痹痛之效[14-15]。KOA大鼠經(jīng)過(guò)骨痹湯熏蒸治療后，其痛閾、膝關(guān)節(jié)周徑及膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍均明顯改善，這可使藥效經(jīng)過(guò)熱力，快速滲入皮膚，作用于肌體，從而使關(guān)節(jié)腔內(nèi)的積液得到消除，減少關(guān)節(jié)腫脹程度，擴(kuò)大膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍;局部高溫可使膝關(guān)節(jié)部位氣血更加流暢，加快血液循環(huán)，緩解關(guān)節(jié)疼痛，達(dá)到“通則不痛”的效果。

KOA的發(fā)生與多種信號(hào)通路有密切關(guān)系，相關(guān)研究證實(shí)，金屬蛋白類可抑制軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)形成的主要通路，在KOA的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[16]。MMP-13可參與組織愈合、形態(tài)生成及損傷修復(fù)等多種正常生理病理過(guò)程，其在心血管疾病、癌癥及KOA等病變過(guò)程中起到促進(jìn)作用[17]。骨痹湯熏蒸治療后，KOA大鼠的MMP-13水平明顯下降，且比其他大鼠明顯，這與相關(guān)研究結(jié)果相一致[18]，這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)骨痹湯熏蒸治療后，通過(guò)熱力和藥力共同作用下，膝骨關(guān)節(jié)軟骨組織中的MMP-13表達(dá)水平下調(diào)，使異常激活的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)降解等生物學(xué)功能得到有效改善，從而促進(jìn)病情迅速恢復(fù)。

TGF-β1是一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，在軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)形成、軟骨修復(fù)重建起到重要的調(diào)節(jié)作用[19-20]。骨痹湯熏蒸治療后，KOA大鼠TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，這是因?yàn)檠糁委熆赏ㄟ^(guò)局部良性刺激，可有效調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，進(jìn)而刺激TGF-β1的大量合成與分泌，使其在軟骨組織中廣泛表達(dá)，促進(jìn)軟骨修復(fù)。

綜上所述，骨痹湯熏蒸治療，可對(duì)KOA大鼠起到活血止痛，過(guò)下調(diào)MMP-13表達(dá)，提高TGF-β1表達(dá)水平，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，對(duì)KOA具有一定預(yù)防和治療作用。

參考文獻(xiàn)

[1]向珊，張繼榮.溫針灸陽(yáng)陵泉聯(lián)合等速肌力訓(xùn)練治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，38（6）：655-657.

[2]侯來(lái)永，徐瑞澤，唐學(xué)章，等.推拿結(jié)合等速肌力訓(xùn)練治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臨床療效研究[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2019，34（5）：551-555，572.

[3]Briani RV，F(xiàn)erreira AS，Pazzinatto MF，et al.Infographic.What interventions can improve quality of life or psychosocial factors of individuals with knee osteoarthritis？A systematic review with meta-analysis of primary outcomes from randomised controlled trials[J].Br J Sports Med，2019，53（14）：901-902.

[4]Nielen J，Boonen A，Dagnelie PC，et al.Disease burden of knee osteoarthritis patients with a joint replacement compared to matched controls：a population-based analysis of a Dutch medical claims database[J].Osteoarthritis Cartilage，2018，26（2）：202-210.

[5]成國(guó)華，蔡華安，王星娜，等.青藤堿電致孔透皮給藥治療老年膝骨性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作療效及對(duì)滑膜液中炎性因子的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，27（1）：9-12.

[6]崔衛(wèi)國(guó)，邱宗雨，楊靜會(huì)，等.玻璃酸鈉注射與灌洗分別聯(lián)合關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效及安全性對(duì)比分析[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2018，36（6）：742-745.

[7]岳建興，洪文軍，陳莉秋，等.關(guān)刺配合手法治療對(duì)老年膝骨性關(guān)節(jié)炎疼痛程度和運(yùn)動(dòng)功能的影響[J].安徽醫(yī)藥，2018，22（4）：695-698.

[8]陳達(dá)，彭力平，余闐，等.“六味骨痹湯”治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效及安全性的臨床研究[J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2017，25（5）：26-29.

[9]楊斐，余雯文，劉榮華，等.腹腔注射丹參注射液和血栓通注射液對(duì)大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].解剖學(xué)雜志，2017，40（4）：390-393.

[10]Tian K，Cheng H，Zhang J，et al.Intra-articular injection of methylprednisolone for reducing pain in knee osteoarthritis：A systematic review and meta-analysis[J].Medicine（Baltimore），2018，97（15）：e0240.

[11]張璐，李園，王蓉.一線鎮(zhèn)痛藥物雙氯芬酸鈉緩釋片治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者的臨床效果[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2020，15（9）：97-100.

[12]胡蕖，曾珍，胡光云，等.雷火灸聯(lián)合雙柏散外敷治療輕中度膝骨關(guān)節(jié)炎療效觀察[J].中國(guó)針灸，2019，39（8）：804-808.

[13]張?jiān)绿m，張紅梅，袁舉，等.中藥熏蒸聯(lián)合超短波治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的療效觀察[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2019，41（3）：216-218.

[14]高歡歡，薛志鵬，李泰賢，等.治療膝骨關(guān)節(jié)炎的中成藥的組方規(guī)律分析[J].中國(guó)藥房，2019，30（15）：2096-2100.

[15]李曉曦，劉仁慧.淫羊藿、女貞子及其相關(guān)方劑治療骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2019，48（4）：148-152.

[16]楊林，汪曉平，李紅艷，等.瘦素人類含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶4與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞相關(guān)性研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2018，22（6）：401-404.

[17]郭建利.金天格膠囊對(duì)老年絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清OPN、MMP-3、IL-1β及TGF-β1水平的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2018，38（3）：635-637.

[18]劉冰川，任輝輝，祝騰蛟，等.可注射生物活性玻璃支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損[J].中華骨科雜志，2019，39（10）：613-621.

[19]黃冬娥，秦茵，林木南，等.不同波型電針治療膝骨關(guān)節(jié)炎及對(duì)關(guān)節(jié)液轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的影響[J].中國(guó)針灸，2020，40（4）：370-374.

[20]Cometti B，Dubey RK，Imthurn B，et al.Natural and environmental oestrogens induce TGFB1 synthesis in oviduct cells[J].Reproduction，2018，155（3）：233-244.

（2020-04-08收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）