貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下娃娃菜生長及軟腐病防效的影響

耿 妍，張世昌，郭榮君，張愛香，Govrin Eri Moshe，李世東，沈瑞清，羅 明

（1.中國農業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193；2.河北北方學院，張家口 075000；3.寧夏農林科學院植物保護研究所，銀川 750002；4.新疆農業(yè)大學農學院，烏魯木齊 830052）

白菜是一種對水肥需求比較大的蔬菜，但是過量澆水施肥或者多雨造成地面積水、局部空氣濕度過大、土壤缺氧不利于白菜生長，卻利于軟腐病菌的傳播，加重白菜軟腐病的發(fā)生[1]。該病一旦發(fā)生，輕者減產10%～20%，重者減產50%以上，甚至絕收[2]。在病害流行年份，其發(fā)病率高達30%～40%，我國大白菜每年因該病害損失近30萬噸[3,4]。由于白菜軟腐病病菌多存在于土壤中，因此控制澆水量是防控該病害發(fā)生的重要前提條件。如何解決其生長過程中對水肥的需求，又能控制軟腐病的發(fā)生是生產中急需解決的問題。目前生產中主要采用 3%中生菌素可濕性粉劑拌種或 46%氫氧化銅水分散粒劑、50%氯溴異氰尿酸可濕性粉劑來防治白菜軟腐病[5]。近年有研究報道一些生防菌劑對白菜軟腐病具有較好的防治效果。如枯草芽胞桿菌菌粉拌種[4]、解淀粉芽胞桿菌B9601-Y2菌懸液淋灌[6]、穴施綠色木霉制劑等[7]，有些菌劑還具有促生效果。Tsuda等[8]從發(fā)酵食品中篩選得到的植物乳酸桿菌BY能顯著降低白菜軟腐病的嚴重程度。Shin等[9]從黃瓜和大白菜的根際分離出芽胞桿菌 H30-3，不僅可以促進白菜生長、緩解高溫干旱脅迫，而且能顯著降低由胡蘿卜假單胞菌亞種引起的白菜軟腐病的發(fā)病率。但目前有關水肥利用和生防菌施用防治白菜軟腐病的研究尚未見報道。

水肥一體化灌溉技術改進了設施蔬菜傳統(tǒng)水肥施用管理模式，使水、肥利用效率分別提高40%～60%和30%～50%[10]，有效防止了土壤鹽漬化，降低了農田和食品的污染、改善農田生態(tài)環(huán)境，可節(jié)水節(jié)肥、省工增效[11]。已有學者開展了水肥與生防菌結合使用技術研究。賀超等[12]研究了AM真菌在不同水肥條件下對黃芩生長的影響，發(fā)現在土壤相對含水量50%，N、P、K施用量分別為 0.383 g/Kg土、0.564 g/Kg土、0.251 g/Kg土時，接種AM真菌的促生效應最佳。接種AM真菌不僅能夠提高黃芩的耐旱性，提高其對水分和肥料的吸收利用，起到節(jié)水節(jié)肥的效果，還促進了黃芩生長和藥用品質的提升。陸萍等[13]的研究表明，減肥10%時施用哈茨木霉和枯草芽胞桿菌復合生防菌劑效果最優(yōu)，對哈密瓜蔓枯病防效為59.0%。耿妍等[14]研究了不同土壤水勢下芽胞桿菌B006對茄子的促生作用結果表明，在土壤水勢較低情況下，芽胞桿菌B006菌劑能促進茄子的生長和根系發(fā)育。

本研究通過盆栽試驗進一步明確了貝萊斯芽胞桿菌B006對娃娃菜的促生防病作用。在此基礎上應用水肥一體化技術，采用電子張力計監(jiān)測土壤水勢，研究不同土壤水肥供應量下，施用B006菌劑對娃娃菜生長發(fā)育、產量的影響，以期對澆水、施肥進行科學管理，在滿足蔬菜優(yōu)質高產的前提下，減少不合理的水肥投入，為芽胞桿菌制劑的合理應用及科學澆水施肥提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：貝萊斯芽胞桿菌BacillusvelezensisB006，中國農業(yè)科學院植物保護研究所土傳病害防治組保存。

胡蘿卜果膠桿菌Pectobacteriumcarotovorum，北京市農林科學院生物中心提供。

供試菌劑：貝萊斯芽胞桿菌B006菌劑，參考王軍強[15]方法，在500 L發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng)，管式離心機離心收集菌體，陰干后，得到干菌粉?；罹繛?.5×1011CFU/g。

供試娃娃菜品種：京春黃3號，北京市農林科學院蔬菜中心提供。

田間小區(qū)試驗地：北京市海淀區(qū)昌寧農莊日光溫室。

水溶肥：N/P/K比例為18/5/13，含量36%，北京啟高生物科技有限公司。

有機肥：有機質含量≥45%，北京啟高生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 盆栽促生試驗 采用單因素隨機區(qū)組交互試驗設計，共8個處理（表1）。設置盆栽試驗中水溶肥用量為5.09和3.57 g/kg土，分別與田間肥料用量1499.3和1049.5 kg/hm2相當；設置盆栽試驗中土壤含水量為14%和20%，分別與田間土壤水勢為?50和?30 kPa時的土壤含水量相當。

表1 盆栽試驗不同處理水肥設計Table 1 Experimental design of different soil water content and fertilization conditions in pot experiment

從北京市海淀區(qū)昌寧農莊日光溫室大棚采集土壤，前茬作物為玉米。稱取1000 g土壤，放入內尺寸為215 mm×157 mm×70 mm的塑料盒中。按照表1設計，將不同用量的水溶肥按1: 500兌水稀釋后與相應處理的土壤混和均勻。播種前在每種植溝撒入混有芽胞桿菌B006菌劑的基質土5 g（菌劑濃度為1×107CFU/g），再撒入種子，表層覆蓋10 mm自然土。以只施用滅菌基質土為對照。每處理種植4盒，每盒播種3行。出苗前各處理含水量為20%，用保鮮膜覆蓋保濕。待娃娃菜全部出苗時揭掉保鮮膜，然后間苗，每行7株苗，間距為25 mm。后期通過土壤稱重并結合土壤含水量測定，控制土壤含水量分別為 20%和14%。出苗10 d后，調查娃娃菜的株高（cm）。

1.2.2 盆栽防病試驗 試驗處理同1.2.1。芽胞桿菌菌液和軟腐病菌菌液準備：將貝萊斯芽胞桿菌B006和軟腐病菌P.carotovorum分別接種到NB培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。鏡檢計數，將B006菌液稀釋至3×108CFU/mL, 軟腐病菌菌液稀釋至1×108CFU/mL，備用。

娃娃菜出苗20 d后，進行防病試驗。在處理P2、P4、P6和P8的娃娃菜植株葉柄基部先接種1 mL B006菌液（3×108CFU/mL），在處理P1、P3、P5和P7娃娃菜葉柄基部針刺接種1 mL無菌水作為對照，6 h后所有處理均接種1 mL軟腐病菌菌液（1×108CFU/mL），每處理3重復。以僅接種無菌水的娃娃菜作為空白對照。25 ℃培養(yǎng)2 d后觀察發(fā)病情況。

軟腐病病斑分級標準：0級為R＝0；1級為0＜R≤10%；2級為10%＜R≤30%；3級為30%＜R≤50%；4級為 50%＜R≤100%，其中 R＝葉柄基部病斑長度×100%。病情指數＝∑（各級病株數×相對級數）/（總株數×最高級數）×100；防效（%）＝（對照平均病情指數－處理平均病情指數）/對照平均病情指數×100%。

1.2.3 日光溫室試驗 采用單因素隨機區(qū)組交互試驗設計，共8個處理（表2）。每小區(qū)面積為4.0 m×4.0 m，每處理3重復，共24個小區(qū)。采用電子張力計監(jiān)測土壤水勢，采用水肥一體化自動灌溉系統(tǒng)進行日常灌溉。播種前，施用14992.5 kg/hm2有機肥作為底肥，翻耕均勻。然后起壟，壟寬30 cm，溝寬20 cm。種植前先鋪設滴灌管，每壟使用1條滴灌帶，滴頭間距為35 cm。將滅過菌的基質土與B006菌劑等比例混和，播種時穴施5 g菌劑（菌劑濃度為1×107CFU/g），以穴施等量的滅菌基質土與無菌水混和物作為對照。然后在菌劑上面播3～5粒娃娃菜種子，再覆土。每小區(qū)5壟，每壟16個種植穴，穴距20 cm。

表2 日光溫室不同處理水肥試驗設計Table 2 Experimental design of different fertigation conditions in the greenhouse

娃娃菜播種后，于每處理25 cm深處土層埋設電子張力計（北京市森雷科技有限公司），與娃娃菜植株水平距離為10 cm。根據電子張力計讀數指示灌溉，當土壤水勢達到-30、-50 kPa時開始澆水施肥。分別在幼苗期、蓮座期和結球期追施水溶肥，T1、T2、T5和T6處理在全生長期內追肥量分別為1499.3 kg/hm2，其中各處理苗期追肥量為520.8 kg/hm2，蓮座期和結球期追肥量為978.4 kg/hm2；T3、T4、T7和T8處理在全生長期內追肥量為1049.5 kg/hm2，其中各處理苗期追肥量為312.4 kg/hm2，蓮座期和結球期追肥量為737.0 kg/hm2。T1～T4處理的實際灌水量為213.4 m3/hm2，T5～T8處理的實際灌水量為320 m3/hm2。

待第二片真葉全部長出后，從每小區(qū)選取五個點，每點選取3株，共15株娃娃菜，測定各處理娃娃菜的生長情況。采用便攜式葉面積儀(型號：YMJ-B，浙江托普儀器有限公司)測量植株的第二片真葉面積（mm2）和葉寬（mm）。具體測量方法：將便攜式葉面積儀的掃描區(qū)域對準葉片從上到下掃描，儀器自動生成葉面積和葉寬數據。收獲時測定不同小區(qū)每行娃娃菜的重量（kg），計算每個處理的平均產量和單株重，并計算每公頃產量（kg/hm2）。收獲后，采用五點取樣法，從每個小區(qū)挖取30株娃娃菜植株的完整根系，測量其根長（cm）和根鮮重（g）。

1.3 數據統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件作圖，采用IBM SPSS Statistics 20對試驗數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下盆栽娃娃菜的促生效果

對盆栽娃娃菜株高的調查結果（表3）表明：所有處理中，施用B006菌劑的處理P2、P4、P8與其相應的對照P1、P3、P7處理相比，娃娃菜株高明顯增加（P＜0.05），但在土壤含水量為20%時，施用和未施用B006菌劑的P6和P5處理之間株高差異不顯著。上述結果說明在較低水肥條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006能促進娃娃菜生長。

2.2 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下盆栽娃娃菜軟腐病的防病效果

不同水肥條件下，B006菌劑對娃娃菜軟腐病的防效不同（表3）。土壤含水量為14%時（處理P1～P4），施用B006菌劑顯著降低了娃娃菜植株的發(fā)病率和病情指數（P＜0.05），與未施用B006菌劑的對照相比，防效分別為68.3%和77.4%。土壤含水量和施肥量增加明顯使娃娃菜軟腐病的發(fā)病率增加，其中P5處理發(fā)病最重。在土壤含水量為 20%時（處理 P5～P8），B006菌劑的防病效果大幅度下降，僅達到27.1%～38.1%。

表3 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下盆栽娃娃菜生長和軟腐病的防治效果Table 3 Plant growth and soft rot disease control of Chinese cabbage by B.velezensis B006 under different fertigation conditions

2.3 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下日光溫室娃娃菜生長和產量的影響

播種25 d后，不同處理娃娃菜的長勢不同。T1、T5處理植株長勢較弱，T4處理（施用B006菌劑×土壤水勢?50 kPa×施肥量1049.5 kg/hm2）的植株長勢最好（圖1）。T4處理與未施用菌劑且施肥量較高的T1和T5處理相比，葉面積分別增加了124.0%和72.0%，葉寬分別增加了40.0%和35.0%，差異顯著（P＜0.05）（表4）。

圖1 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下娃娃菜生長的影響Fig.1 Effect of B.velezensis B006 on the growth of Chinese cabbage under different fertigation conditions

表4 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下娃娃菜生長的影響Table 4 Effects of B.velezensis B006 on the growth of cabbage under different fertigation conditions

對收獲后娃娃菜根系測量結果（表 4）表明：在相同水肥條件下，施用 B006菌劑的處理根系生長顯著優(yōu)于對照。在土壤水勢為-50 kPa時，施用B006菌劑的T2和T4處理的根鮮重明顯高于未施用菌劑的T1和T3處理（P＜0.05）；4個處理中僅T3與T4處理根長差異顯著（P＜0.05）。土壤水勢為-30 kPa時，各處理的葉面積和根鮮重差異不顯著，T8處理根長與其他處理之間差異顯著（P＜0.05）。上述結果說明低水肥條件下貝萊斯芽胞桿菌 B006能夠促進娃娃菜的生長；而在高水肥條件下，貝萊斯芽胞桿菌 B006只對娃娃菜根系生長具有促生作用。

對娃娃菜產量的調查表明：不同處理對娃娃菜產量有一定影響（圖2）。在所有處理中，未施用B006菌劑且高水平施肥（追肥量1499.3 kg/hm2）處理T5和T1（土壤水勢分別為-30和-50 kPa）的產量較低，而低水、低肥并施用B006菌劑處理T4（土壤水勢 -50 kPa×追肥量1049.5 kg/hm2）和高水、高肥并施用B006菌劑處理T6（土壤水勢 -30 kPa×追肥量1499.3 kg/hm2）的產量顯著高于T1和T5處理（P＜0.05）。與處理T5和T1相比，T4處理的產量分別提高了8.6%和11.2%。上述結果表明：在土壤水勢為-50 kPa、追肥量1049.5 kg/hm2的低水、低肥條件下，施用芽胞桿菌B006菌劑仍能促進植株生長并提高產量，而單純增加施肥量并不一定能促進植株生長和娃娃菜的產量，在實際生產當中需要合理施肥。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下娃娃菜產量的影響Fig.2 Effect of B.velezensis B006 on the yield of Chinese cabbage under different fertigation conditions

3 討論

娃娃菜是一種袖珍型小株白菜，在營養(yǎng)生長期間土壤水分和肥料施用對其生長有很大程度的影響，土壤水分匱缺會導致其生長不良，組織硬化，品質差；土壤水分過量則影響根系吸收營養(yǎng)和水分，也會造成生長不良，并加重病害的發(fā)生[16]。白菜軟腐病是一種細菌性病害，土壤含水量是影響病害發(fā)生、發(fā)展的重要因素，澆水施肥量不當會加重白菜軟腐病的發(fā)生[17]。本研究也發(fā)現土壤水分含量和施肥量均影響白菜軟腐病的發(fā)生，特別是在土壤含水量為20%時、較高施肥量明顯促進了軟腐病的發(fā)生（T5 vs T7），發(fā)病率和病情指數明顯增加，發(fā)病加重。因此在防治軟腐病時，非常有必要將生物菌劑應用與田間澆水施肥相結合，以充分發(fā)揮生防菌劑的防病效果。

有關水肥用量與有益生物菌劑結合使用的研究已經有報道。賀超等[12]研究發(fā)現一定量的水肥與AM真菌配合使用可更好的發(fā)揮AM真菌的促生作用；較少化肥用量可促進木霉和芽胞菌復合菌劑的防病促生效果[13]；在同一施肥水平下，土壤水勢較低時，芽胞桿菌B006菌劑更能促進茄子的生長和根系發(fā)育[14]。目前生產中主要以加強田間管理和使用化學農藥防治白菜軟腐病。本研究考查了不同施肥水平和不同水勢條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006對娃娃菜生長和產量以及防病作用的影響，發(fā)現無論較高土壤水勢還是較低土壤水勢情況下，高水平施肥都不利于植株生長并影響娃娃菜產量，這可能與施肥過高影響了土壤EC值和pH值，從而影響植株根系養(yǎng)分的吸收有關。在較低土壤水勢且低水平施肥條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006可以促進植株生長、有效減少白菜軟腐病的發(fā)病程度，在田間還能夠促進白菜增產，這與我們在茄子上試驗結果類似[14]，將該試驗結果應用于實際生產中可減水、減肥達11%左右。上述結果為改進芽胞桿菌菌劑的田間應用技術，更有效的提高芽胞桿菌的防病、促生和增產效果提供了依據，值得借鑒。

芽胞桿菌可產生多種次級代謝產物，不僅可促進植物生長，對多種病害具有良好的防治作用[18,19]，有關其在少水低肥條件下的促生、防病機理有待于深入研究。

4 結論

（1）生產中應合理澆水施肥，在土壤水勢為-50 kPa、追肥量為1049.5 kg/hm2條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006可以促進娃娃菜的生長并提高產量。

（2）娃娃菜軟腐病的發(fā)病程度受土壤水分和施肥量的影響，在土壤含水量14%、施肥量為 3.57 g/kg土條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006可顯著降低娃娃菜軟腐病的發(fā)病率和病情指數，提高芽胞桿菌的防病效果。