貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下娃娃菜生長及軟腐病防效的影響

耿 妍，張世昌，郭榮君，張愛香，Govrin Eri Moshe，李世東，沈瑞清，羅 明

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；2.河北北方學(xué)院，張家口 075000；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，銀川 750002；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

白菜是一種對水肥需求比較大的蔬菜，但是過量澆水施肥或者多雨造成地面積水、局部空氣濕度過大、土壤缺氧不利于白菜生長，卻利于軟腐病菌的傳播，加重白菜軟腐病的發(fā)生[1]。該病一旦發(fā)生，輕者減產(chǎn)10%～20%，重者減產(chǎn)50%以上，甚至絕收[2]。在病害流行年份，其發(fā)病率高達(dá)30%～40%，我國大白菜每年因該病害損失近30萬噸[3,4]。由于白菜軟腐病病菌多存在于土壤中，因此控制澆水量是防控該病害發(fā)生的重要前提條件。如何解決其生長過程中對水肥的需求，又能控制軟腐病的發(fā)生是生產(chǎn)中急需解決的問題。目前生產(chǎn)中主要采用 3%中生菌素可濕性粉劑拌種或 46%氫氧化銅水分散粒劑、50%氯溴異氰尿酸可濕性粉劑來防治白菜軟腐病[5]。近年有研究報道一些生防菌劑對白菜軟腐病具有較好的防治效果。如枯草芽胞桿菌菌粉拌種[4]、解淀粉芽胞桿菌B9601-Y2菌懸液淋灌[6]、穴施綠色木霉制劑等[7]，有些菌劑還具有促生效果。Tsuda等[8]從發(fā)酵食品中篩選得到的植物乳酸桿菌BY能顯著降低白菜軟腐病的嚴(yán)重程度。Shin等[9]從黃瓜和大白菜的根際分離出芽胞桿菌 H30-3，不僅可以促進(jìn)白菜生長、緩解高溫干旱脅迫，而且能顯著降低由胡蘿卜假單胞菌亞種引起的白菜軟腐病的發(fā)病率。但目前有關(guān)水肥利用和生防菌施用防治白菜軟腐病的研究尚未見報道。

水肥一體化灌溉技術(shù)改進(jìn)了設(shè)施蔬菜傳統(tǒng)水肥施用管理模式，使水、肥利用效率分別提高40%～60%和30%～50%[10]，有效防止了土壤鹽漬化，降低了農(nóng)田和食品的污染、改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，可節(jié)水節(jié)肥、省工增效[11]。已有學(xué)者開展了水肥與生防菌結(jié)合使用技術(shù)研究。賀超等[12]研究了AM真菌在不同水肥條件下對黃芩生長的影響，發(fā)現(xiàn)在土壤相對含水量50%，N、P、K施用量分別為 0.383 g/Kg土、0.564 g/Kg土、0.251 g/Kg土?xí)r，接種AM真菌的促生效應(yīng)最佳。接種AM真菌不僅能夠提高黃芩的耐旱性，提高其對水分和肥料的吸收利用，起到節(jié)水節(jié)肥的效果，還促進(jìn)了黃芩生長和藥用品質(zhì)的提升。陸萍等[13]的研究表明，減肥10%時施用哈茨木霉和枯草芽胞桿菌復(fù)合生防菌劑效果最優(yōu)，對哈密瓜蔓枯病防效為59.0%。耿妍等[14]研究了不同土壤水勢下芽胞桿菌B006對茄子的促生作用結(jié)果表明，在土壤水勢較低情況下，芽胞桿菌B006菌劑能促進(jìn)茄子的生長和根系發(fā)育。

本研究通過盆栽試驗進(jìn)一步明確了貝萊斯芽胞桿菌B006對娃娃菜的促生防病作用。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用水肥一體化技術(shù)，采用電子張力計監(jiān)測土壤水勢，研究不同土壤水肥供應(yīng)量下，施用B006菌劑對娃娃菜生長發(fā)育、產(chǎn)量的影響，以期對澆水、施肥進(jìn)行科學(xué)管理，在滿足蔬菜優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的前提下，減少不合理的水肥投入，為芽胞桿菌制劑的合理應(yīng)用及科學(xué)澆水施肥提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：貝萊斯芽胞桿菌BacillusvelezensisB006，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所土傳病害防治組保存。

胡蘿卜果膠桿菌Pectobacteriumcarotovorum，北京市農(nóng)林科學(xué)院生物中心提供。

供試菌劑：貝萊斯芽胞桿菌B006菌劑，參考王軍強(qiáng)[15]方法，在500 L發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng)，管式離心機(jī)離心收集菌體，陰干后，得到干菌粉?；罹繛?.5×1011CFU/g。

供試娃娃菜品種：京春黃3號，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜中心提供。

田間小區(qū)試驗地：北京市海淀區(qū)昌寧農(nóng)莊日光溫室。

水溶肥：N/P/K比例為18/5/13，含量36%，北京啟高生物科技有限公司。

有機(jī)肥：有機(jī)質(zhì)含量≥45%，北京啟高生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 盆栽促生試驗 采用單因素隨機(jī)區(qū)組交互試驗設(shè)計，共8個處理（表1）。設(shè)置盆栽試驗中水溶肥用量為5.09和3.57 g/kg土，分別與田間肥料用量1499.3和1049.5 kg/hm2相當(dāng)；設(shè)置盆栽試驗中土壤含水量為14%和20%，分別與田間土壤水勢為?50和?30 kPa時的土壤含水量相當(dāng)。

表1 盆栽試驗不同處理水肥設(shè)計Table 1 Experimental design of different soil water content and fertilization conditions in pot experiment

從北京市海淀區(qū)昌寧農(nóng)莊日光溫室大棚采集土壤，前茬作物為玉米。稱取1000 g土壤，放入內(nèi)尺寸為215 mm×157 mm×70 mm的塑料盒中。按照表1設(shè)計，將不同用量的水溶肥按1: 500兌水稀釋后與相應(yīng)處理的土壤混和均勻。播種前在每種植溝撒入混有芽胞桿菌B006菌劑的基質(zhì)土5 g（菌劑濃度為1×107CFU/g），再撒入種子，表層覆蓋10 mm自然土。以只施用滅菌基質(zhì)土為對照。每處理種植4盒，每盒播種3行。出苗前各處理含水量為20%，用保鮮膜覆蓋保濕。待娃娃菜全部出苗時揭掉保鮮膜，然后間苗，每行7株苗，間距為25 mm。后期通過土壤稱重并結(jié)合土壤含水量測定，控制土壤含水量分別為 20%和14%。出苗10 d后，調(diào)查娃娃菜的株高（cm）。

1.2.2 盆栽防病試驗 試驗處理同1.2.1。芽胞桿菌菌液和軟腐病菌菌液準(zhǔn)備：將貝萊斯芽胞桿菌B006和軟腐病菌P.carotovorum分別接種到NB培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。鏡檢計數(shù)，將B006菌液稀釋至3×108CFU/mL, 軟腐病菌菌液稀釋至1×108CFU/mL，備用。

娃娃菜出苗20 d后，進(jìn)行防病試驗。在處理P2、P4、P6和P8的娃娃菜植株葉柄基部先接種1 mL B006菌液（3×108CFU/mL），在處理P1、P3、P5和P7娃娃菜葉柄基部針刺接種1 mL無菌水作為對照，6 h后所有處理均接種1 mL軟腐病菌菌液（1×108CFU/mL），每處理3重復(fù)。以僅接種無菌水的娃娃菜作為空白對照。25 ℃培養(yǎng)2 d后觀察發(fā)病情況。

軟腐病病斑分級標(biāo)準(zhǔn)：0級為R＝0；1級為0＜R≤10%；2級為10%＜R≤30%；3級為30%＜R≤50%；4級為 50%＜R≤100%，其中 R＝葉柄基部病斑長度×100%。病情指數(shù)＝∑（各級病株數(shù)×相對級數(shù)）/（總株數(shù)×最高級數(shù)）×100；防效（%）＝（對照平均病情指數(shù)－處理平均病情指數(shù)）/對照平均病情指數(shù)×100%。

1.2.3 日光溫室試驗 采用單因素隨機(jī)區(qū)組交互試驗設(shè)計，共8個處理（表2）。每小區(qū)面積為4.0 m×4.0 m，每處理3重復(fù)，共24個小區(qū)。采用電子張力計監(jiān)測土壤水勢，采用水肥一體化自動灌溉系統(tǒng)進(jìn)行日常灌溉。播種前，施用14992.5 kg/hm2有機(jī)肥作為底肥，翻耕均勻。然后起壟，壟寬30 cm，溝寬20 cm。種植前先鋪設(shè)滴灌管，每壟使用1條滴灌帶，滴頭間距為35 cm。將滅過菌的基質(zhì)土與B006菌劑等比例混和，播種時穴施5 g菌劑（菌劑濃度為1×107CFU/g），以穴施等量的滅菌基質(zhì)土與無菌水混和物作為對照。然后在菌劑上面播3～5粒娃娃菜種子，再覆土。每小區(qū)5壟，每壟16個種植穴，穴距20 cm。

表2 日光溫室不同處理水肥試驗設(shè)計Table 2 Experimental design of different fertigation conditions in the greenhouse

娃娃菜播種后，于每處理25 cm深處土層埋設(shè)電子張力計（北京市森雷科技有限公司），與娃娃菜植株水平距離為10 cm。根據(jù)電子張力計讀數(shù)指示灌溉，當(dāng)土壤水勢達(dá)到-30、-50 kPa時開始澆水施肥。分別在幼苗期、蓮座期和結(jié)球期追施水溶肥，T1、T2、T5和T6處理在全生長期內(nèi)追肥量分別為1499.3 kg/hm2，其中各處理苗期追肥量為520.8 kg/hm2，蓮座期和結(jié)球期追肥量為978.4 kg/hm2；T3、T4、T7和T8處理在全生長期內(nèi)追肥量為1049.5 kg/hm2，其中各處理苗期追肥量為312.4 kg/hm2，蓮座期和結(jié)球期追肥量為737.0 kg/hm2。T1～T4處理的實際灌水量為213.4 m3/hm2，T5～T8處理的實際灌水量為320 m3/hm2。

待第二片真葉全部長出后，從每小區(qū)選取五個點，每點選取3株，共15株娃娃菜，測定各處理娃娃菜的生長情況。采用便攜式葉面積儀(型號：YMJ-B，浙江托普儀器有限公司)測量植株的第二片真葉面積（mm2）和葉寬（mm）。具體測量方法：將便攜式葉面積儀的掃描區(qū)域?qū)?zhǔn)葉片從上到下掃描，儀器自動生成葉面積和葉寬數(shù)據(jù)。收獲時測定不同小區(qū)每行娃娃菜的重量（kg），計算每個處理的平均產(chǎn)量和單株重，并計算每公頃產(chǎn)量（kg/hm2）。收獲后，采用五點取樣法，從每個小區(qū)挖取30株娃娃菜植株的完整根系，測量其根長（cm）和根鮮重（g）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件作圖，采用IBM SPSS Statistics 20對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下盆栽娃娃菜的促生效果

對盆栽娃娃菜株高的調(diào)查結(jié)果（表3）表明：所有處理中，施用B006菌劑的處理P2、P4、P8與其相應(yīng)的對照P1、P3、P7處理相比，娃娃菜株高明顯增加（P＜0.05），但在土壤含水量為20%時，施用和未施用B006菌劑的P6和P5處理之間株高差異不顯著。上述結(jié)果說明在較低水肥條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006能促進(jìn)娃娃菜生長。

2.2 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下盆栽娃娃菜軟腐病的防病效果

不同水肥條件下，B006菌劑對娃娃菜軟腐病的防效不同（表3）。土壤含水量為14%時（處理P1～P4），施用B006菌劑顯著降低了娃娃菜植株的發(fā)病率和病情指數(shù)（P＜0.05），與未施用B006菌劑的對照相比，防效分別為68.3%和77.4%。土壤含水量和施肥量增加明顯使娃娃菜軟腐病的發(fā)病率增加，其中P5處理發(fā)病最重。在土壤含水量為 20%時（處理 P5～P8），B006菌劑的防病效果大幅度下降，僅達(dá)到27.1%～38.1%。

表3 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下盆栽娃娃菜生長和軟腐病的防治效果Table 3 Plant growth and soft rot disease control of Chinese cabbage by B.velezensis B006 under different fertigation conditions

2.3 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下日光溫室娃娃菜生長和產(chǎn)量的影響

播種25 d后，不同處理娃娃菜的長勢不同。T1、T5處理植株長勢較弱，T4處理（施用B006菌劑×土壤水勢?50 kPa×施肥量1049.5 kg/hm2）的植株長勢最好（圖1）。T4處理與未施用菌劑且施肥量較高的T1和T5處理相比，葉面積分別增加了124.0%和72.0%，葉寬分別增加了40.0%和35.0%，差異顯著（P＜0.05）（表4）。

圖1 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下娃娃菜生長的影響Fig.1 Effect of B.velezensis B006 on the growth of Chinese cabbage under different fertigation conditions

表4 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下娃娃菜生長的影響Table 4 Effects of B.velezensis B006 on the growth of cabbage under different fertigation conditions

對收獲后娃娃菜根系測量結(jié)果（表 4）表明：在相同水肥條件下，施用 B006菌劑的處理根系生長顯著優(yōu)于對照。在土壤水勢為-50 kPa時，施用B006菌劑的T2和T4處理的根鮮重明顯高于未施用菌劑的T1和T3處理（P＜0.05）；4個處理中僅T3與T4處理根長差異顯著（P＜0.05）。土壤水勢為-30 kPa時，各處理的葉面積和根鮮重差異不顯著，T8處理根長與其他處理之間差異顯著（P＜0.05）。上述結(jié)果說明低水肥條件下貝萊斯芽胞桿菌 B006能夠促進(jìn)娃娃菜的生長；而在高水肥條件下，貝萊斯芽胞桿菌 B006只對娃娃菜根系生長具有促生作用。

對娃娃菜產(chǎn)量的調(diào)查表明：不同處理對娃娃菜產(chǎn)量有一定影響（圖2）。在所有處理中，未施用B006菌劑且高水平施肥（追肥量1499.3 kg/hm2）處理T5和T1（土壤水勢分別為-30和-50 kPa）的產(chǎn)量較低，而低水、低肥并施用B006菌劑處理T4（土壤水勢 -50 kPa×追肥量1049.5 kg/hm2）和高水、高肥并施用B006菌劑處理T6（土壤水勢 -30 kPa×追肥量1499.3 kg/hm2）的產(chǎn)量顯著高于T1和T5處理（P＜0.05）。與處理T5和T1相比，T4處理的產(chǎn)量分別提高了8.6%和11.2%。上述結(jié)果表明：在土壤水勢為-50 kPa、追肥量1049.5 kg/hm2的低水、低肥條件下，施用芽胞桿菌B006菌劑仍能促進(jìn)植株生長并提高產(chǎn)量，而單純增加施肥量并不一定能促進(jìn)植株生長和娃娃菜的產(chǎn)量，在實際生產(chǎn)當(dāng)中需要合理施肥。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌B006對不同水肥條件下娃娃菜產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of B.velezensis B006 on the yield of Chinese cabbage under different fertigation conditions

3 討論

娃娃菜是一種袖珍型小株白菜，在營養(yǎng)生長期間土壤水分和肥料施用對其生長有很大程度的影響，土壤水分匱缺會導(dǎo)致其生長不良，組織硬化，品質(zhì)差；土壤水分過量則影響根系吸收營養(yǎng)和水分，也會造成生長不良，并加重病害的發(fā)生[16]。白菜軟腐病是一種細(xì)菌性病害，土壤含水量是影響病害發(fā)生、發(fā)展的重要因素，澆水施肥量不當(dāng)會加重白菜軟腐病的發(fā)生[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)土壤水分含量和施肥量均影響白菜軟腐病的發(fā)生，特別是在土壤含水量為20%時、較高施肥量明顯促進(jìn)了軟腐病的發(fā)生（T5 vs T7），發(fā)病率和病情指數(shù)明顯增加，發(fā)病加重。因此在防治軟腐病時，非常有必要將生物菌劑應(yīng)用與田間澆水施肥相結(jié)合，以充分發(fā)揮生防菌劑的防病效果。

有關(guān)水肥用量與有益生物菌劑結(jié)合使用的研究已經(jīng)有報道。賀超等[12]研究發(fā)現(xiàn)一定量的水肥與AM真菌配合使用可更好的發(fā)揮AM真菌的促生作用；較少化肥用量可促進(jìn)木霉和芽胞菌復(fù)合菌劑的防病促生效果[13]；在同一施肥水平下，土壤水勢較低時，芽胞桿菌B006菌劑更能促進(jìn)茄子的生長和根系發(fā)育[14]。目前生產(chǎn)中主要以加強(qiáng)田間管理和使用化學(xué)農(nóng)藥防治白菜軟腐病。本研究考查了不同施肥水平和不同水勢條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006對娃娃菜生長和產(chǎn)量以及防病作用的影響，發(fā)現(xiàn)無論較高土壤水勢還是較低土壤水勢情況下，高水平施肥都不利于植株生長并影響娃娃菜產(chǎn)量，這可能與施肥過高影響了土壤EC值和pH值，從而影響植株根系養(yǎng)分的吸收有關(guān)。在較低土壤水勢且低水平施肥條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006可以促進(jìn)植株生長、有效減少白菜軟腐病的發(fā)病程度，在田間還能夠促進(jìn)白菜增產(chǎn)，這與我們在茄子上試驗結(jié)果類似[14]，將該試驗結(jié)果應(yīng)用于實際生產(chǎn)中可減水、減肥達(dá)11%左右。上述結(jié)果為改進(jìn)芽胞桿菌菌劑的田間應(yīng)用技術(shù)，更有效的提高芽胞桿菌的防病、促生和增產(chǎn)效果提供了依據(jù)，值得借鑒。

芽胞桿菌可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，不僅可促進(jìn)植物生長，對多種病害具有良好的防治作用[18,19]，有關(guān)其在少水低肥條件下的促生、防病機(jī)理有待于深入研究。

4 結(jié)論

（1）生產(chǎn)中應(yīng)合理澆水施肥，在土壤水勢為-50 kPa、追肥量為1049.5 kg/hm2條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006可以促進(jìn)娃娃菜的生長并提高產(chǎn)量。

（2）娃娃菜軟腐病的發(fā)病程度受土壤水分和施肥量的影響，在土壤含水量14%、施肥量為 3.57 g/kg土條件下，貝萊斯芽胞桿菌B006可顯著降低娃娃菜軟腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)，提高芽胞桿菌的防病效果。