催芽對生姜根莖細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

唐 婧,唐 明，孫媛媛，何馨竹，黃 科

（1. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/貴州省植物生理與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550001；2. 重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院，重慶402160）

生姜（Zingiber officinale）是一種兼作蔬菜和藥用植物的經(jīng)濟(jì)作物。生姜在我國山東、四川、重慶、貴州等地都有規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化種植栽培，是當(dāng)?shù)亟r(nóng)主要收入來源。而生姜在種植上存在嚴(yán)重的土傳姜瘟病，對產(chǎn)量影響十分嚴(yán)重，會造成姜農(nóng)重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此，研究提高生姜長勢、抗性和產(chǎn)量對于生姜產(chǎn)業(yè)具有不可替代的重要作用及意義。催芽是生姜栽培管理技術(shù)中極其重要的一環(huán)，生姜催芽直接影響后續(xù)生姜長勢狀態(tài)，催生壯芽可以提高生姜產(chǎn)量20% 以上[2]。生姜催芽過程，生姜根莖的健康生長，新生芽強(qiáng)壯，是生姜后續(xù)栽培繁育的基礎(chǔ)階段，故需要從多角度提高和完善對生姜催生壯芽的認(rèn)識。

植物微生物組與植物生長發(fā)育健康密切相關(guān)，地下根系微生物組在植物生長發(fā)育過程中更是不可忽視的重要部分[3]，其一般分為根際、根表面和根內(nèi)部3 個生態(tài)位[4]。有時，也將根表面和根內(nèi)部微生物一起稱為植物根內(nèi)微生物。與根際微生物群落相比，根內(nèi)微生物群落同樣受地下生物和非生物因子的調(diào)控[5]，但是根內(nèi)微生物更有利于保護(hù)植物抵抗脅迫[6]，且其組成與根際及外周土壤微生物組的組成及多樣性差別巨大[7-8]。同時，現(xiàn)在研究認(rèn)為，根內(nèi)微生物群落極可能不是由根際微生物偶然入侵定殖形成的，而是由宿主植物自身的不同生理調(diào)節(jié)機(jī)制影響的[9-11]。植物根系微生物組與植物生長發(fā)育密切有關(guān)，可以參與調(diào)控植物生長與開花[12]、抗逆[13]、營養(yǎng)元素利用[14]等。而生姜催芽作為姜栽培繁育的基礎(chǔ)，其根莖內(nèi)部微生物組對于后續(xù)生姜生長發(fā)育具有不可替代的重要作用，但是對于這一部分的研究目前較少。因此，本研究通過高通量測序獲取并分析健康生姜催芽過程中生姜根莖細(xì)菌群落的組成及變化，以期為生姜催生壯芽及后續(xù)生姜病害防治提供較為豐富的微生物群落理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇無病斑、無軟癥狀的健康強(qiáng)壯生姜根莖塊，用無菌蒸餾水清洗干凈，然后用75% 乙醇表面消毒5min，再用無菌蒸餾水漂洗，無菌通風(fēng)櫥風(fēng)干。然后，在25℃和75% 相對濕度的無菌基質(zhì)中催芽培養(yǎng)。在培養(yǎng)0,15，30d時，各時間點(diǎn)分別采集15個樣本，將其隨機(jī)分為3組，每組5株樣本。催芽15d，新發(fā)不定壯芽開始出現(xiàn)；催芽30d，壯芽形成，不定根生長。

1.2 宏基因組的提取

稱取每組5 株生姜根莖各20g 混合，剪碎，用差速離心法收集菌群，再按OMEGA 細(xì)菌DNA 提取試劑盒D3350-01 試劑盒提取DNA。Bio-Tek 微孔板分光光度法測定宏基因組DNA 濃度和質(zhì)量，然后-80°C 冰箱凍存DNA。

1.3 高通量測序及分類注釋

提取宏基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增16S rRNA 基因V3～V4區(qū)序列(341F: CCTAYGGGRBGCASCAG, 806R:GGACTACNNGGGTATCTAAT)[15]在美吉生物公司Illumina PE300測序平臺測序。下機(jī)序列在QIIME 上分析，將相似性≥97% 的序列聚類成OTUs（operational taxonomic units）[16]。用RDP[17]算法基于Greengene 數(shù)據(jù)庫(http://greengenes.secondgenome.com/)對16S rRNA細(xì)菌OTUs進(jìn)行分類注釋。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

在QIIME2 上基于OTUs 分類注釋結(jié)果，計(jì)算生姜根莖細(xì)菌群落α-多樣性[Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)以及PD_whole_tree（phylogenetic diversity whole tree）]，wilcox 檢驗(yàn)α-多樣性差異?；贐ray-Curtis 距離使用R 的vegan、ggplots 等進(jìn)行PCoA（principal co-ordinates analysis 和置換多元方差分析（PERMANOVA）檢驗(yàn)分析生姜催芽過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異[18]。使用R Deseq2中的LRT（log likelihood ratio）檢驗(yàn)分析生姜催芽過程中細(xì)菌種群OTUs 豐度的差異[19]?；赪GCNA 的Pearson 相關(guān)系數(shù)構(gòu)建細(xì)菌菌群的互作網(wǎng)絡(luò)[20]，然后利用Kendall相關(guān)系數(shù)分析生姜根系細(xì)菌種群與生姜催芽生長階段之間相關(guān)性。根據(jù)細(xì)菌種群兩兩間的Pearson 相關(guān)系數(shù)以及Benjamini and Hochberg false discovery rate(FDR)矯正p值[21]，篩選菌群間極顯著相關(guān)關(guān)系（p＜0.01），借助Cytoscape軟件可視化細(xì)菌共存網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步探究細(xì)菌群落的相互關(guān)系[22]。兩兩之間正相關(guān)代表兩個細(xì)菌種群之間具有互利共增關(guān)系，而負(fù)相關(guān)則代表其之間存在競爭抑制關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

高通量測定催芽0,15，30d 后生姜根莖中細(xì)菌群落16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)序列，平均序列數(shù)（clean reads）是（78711±3791）（Mean±SD），且3 個時期序列數(shù)量無顯著性差異。序列按相似性≥97% 進(jìn)行OTUs 聚類，利用OTUs數(shù)目與測序序列數(shù)量作稀釋曲線，結(jié)果如圖1。本研究對生姜根莖細(xì)菌群落測序深度能較好覆蓋樣品中絕大多數(shù)的微生物物種，滿足后續(xù)研究需要。

圖1 細(xì)菌群落16S rRNA V3～V4區(qū)稀釋曲線Figure 1 Rarefaction curve of 16S rRNA V3-V4

2.2 催芽對生姜根莖細(xì)菌群落的影響

2.2.1 催芽對生姜根莖細(xì)菌群落多樣性的影響 由表1可知，生姜根莖催芽15d和30d時，細(xì)菌群落α-多樣性出現(xiàn)顯著性上升，說明隨著催芽時間的增加，生姜根莖的細(xì)菌群落豐富度和均勻度顯著的升高；同時在30d時，細(xì)菌群落譜系多樣性出現(xiàn)顯著升高。

表1 生姜根莖催芽過程細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)Table 1 The rhizome-bacterial α-diversity of Zingiber officinale in the germination process

進(jìn)一步分析探討催芽對生姜根莖細(xì)菌群落組成的差異，本研究以Bray-Curtis 距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，催芽0,15，30d后，根莖細(xì)菌群落組成存在顯著分離。進(jìn)一步利用PERMANOVA檢驗(yàn)分析，也發(fā)現(xiàn)催芽后根莖細(xì)菌群落組成呈極顯著性差異（R2=0.426,p＜0.01）。

圖2 主坐標(biāo)分析催芽0，15，30d后生姜根莖微生物群落組成差異Figure 2 The PCoA of bacterial community between 0,15,30d group

2.2.2 催芽對生姜根莖細(xì)菌種群的影響 分析高通量測定催芽0,15，30d后生姜根莖中細(xì)菌群落16S V3～V4區(qū)序列，結(jié)果共聚類得出276個OTUs，整個催芽過程生姜根莖中共存有115個OTUs，0d和15d都存有29個單獨(dú)存在的OTUs，而在30d 時有45 個OTUs 單獨(dú)存在（圖3a）。催芽30d 后，生姜根莖內(nèi)單獨(dú)富集的細(xì)菌種群數(shù)量最高，占全部OTUs 的16.3%；且催芽15～30d，生姜根莖內(nèi)新富集31.1% 的OTUs。這一結(jié)果再次表明，在催芽后，生姜根莖內(nèi)細(xì)菌種群數(shù)量增加，出芽后的生姜根莖內(nèi)新富集到三分之一細(xì)菌種群。催芽過程中，持續(xù)存在的115 個OTUs 中，有36 個OTUs 相對多度發(fā)生顯著變化（圖3b）。其中，只有3 個OTUs 的相對多度在催芽后，15d 和30d 都持續(xù)顯著下降；相對的有9 個OTUs 的相對多度持續(xù)顯著上升。催芽0～30d，生姜根莖中大量細(xì)菌種群發(fā)生變化，且超過三分之一的OTUs 屬于厚壁菌門（Firmicutes，43.1%），然后是變形菌門（Proteobacteria，25.9%）和 擬 桿 菌 門（Bacteroidetes，20.3%）。

圖3 催芽0,15,30d后生姜根莖細(xì)菌OTUs變化Figure 3 The composition difference of bacterial community between 0,15,30d groups

生姜催芽生長過程中，生姜根莖內(nèi)有一部分細(xì)菌門的相對多度發(fā)生顯著變化。生姜根莖內(nèi)細(xì)菌菌群分布于10 種門，其中4 種門平均相對多度＞1%，且它們的相對多度在催芽生長過程中變化顯著（圖4）。在催芽開始時，生姜根莖內(nèi)優(yōu)勢菌群是Firmicutes（77.20±0.07）%, 藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria（14.63±0.01）%和Proteobacteria（8.01±0.06）%。而當(dāng)生長到15d 時，Proteobacteria（92.98±0.08）%相對多度出現(xiàn)強(qiáng)烈升高，而Firmicutes（5.68±0.08）%和Cyanobacteria（0.83±0.002）%相對多度卻發(fā)生顯著性降低。催芽30d 后，F(xiàn)irmicutes（44.73±0.11）%和Cyanobacteria（1.63±0.01）%的相對多度又發(fā)生顯著性升高，而Proteobacteria（43.21±0.08）%相對多度卻顯著下降；同時，擬桿菌門（Bacteroidetes）相對多度出現(xiàn)顯著升高至（9.91±0.04）%。

圖4 催芽生長過程生姜根莖內(nèi)10個細(xì)菌門相對多度Figure 4 The relative abundance of 10 phyla in the rhizome of Ginger affected by accelerating germination

2.3 催芽影響的根莖細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)

通過對高通量測序數(shù)據(jù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在催芽生姜根莖中共含有10種門112種屬的細(xì)菌種群。為進(jìn)一步分析這些細(xì)菌屬與生姜催芽生長之間的關(guān)系，利用Kendall相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生姜根莖的112種細(xì)菌屬中有39 種屬與生姜催芽生長密切相關(guān)（r＞0.6,p＜0.05）（圖5）。39 種細(xì)菌屬分別屬于Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes，Bacteroidetes 和放線菌門（Actinobacteria）4個門?；趦蓛杉?xì)菌屬間的Pearson 相關(guān)系數(shù)，進(jìn)一步分析與生姜根莖催芽生長密切相關(guān)的39種細(xì)菌屬之間的互作網(wǎng)絡(luò)。由圖5可知，與生姜催芽密切相關(guān)的39種細(xì)菌屬構(gòu)成兩個互作網(wǎng)絡(luò)：一個是28個節(jié)點(diǎn)353條互作邊的高度緊密網(wǎng)絡(luò)，且28個節(jié)點(diǎn)細(xì)菌豐度隨著生姜催芽生長增高；另外一個是11個節(jié)點(diǎn)18條互作邊的網(wǎng)絡(luò)，且其中Ruminococcaceae，Christensenellaceae，假單胞菌屬（Pseudomonas）和Ruminiclostridium豐度隨著催芽生長下降。整個互作網(wǎng)絡(luò)中，只有Ruminococcaceae與Mycobacterium（分枝桿菌屬）、Pseudomonas與Coprococcus、Ruminococcaceae與Devosia（德沃斯氏菌屬）3條負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖5 催芽相關(guān)的生姜根莖細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)Figure 5 Correlation network analysis of rhizome bacteria by after accelerating germination

通過網(wǎng)絡(luò)互作分析發(fā)現(xiàn)，有兩個細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)與生姜催芽生長密切相關(guān)。其中，一個是另枝菌屬（Alistipes），擬桿菌屬（Bacteroides），檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）等28 個細(xì)菌屬構(gòu)成一個高密度的穩(wěn)定細(xì)菌互利共生網(wǎng)絡(luò)，它們相互共生逐步富集于生姜催芽生長的根莖內(nèi)；另一個共生競爭的互作網(wǎng)絡(luò)中，Ruminococcaceae、Christensenellaceae、Pseudomonas和Ruminiclostridium極可能會受Devosia、Coprococcus和Mycobacterium等細(xì)菌種群所抑制，在生姜催芽生長的過程中，它們在生姜根莖內(nèi)豐度逐步降低。

3 討論與結(jié)論

植物根系微生物組參與植物生長的眾多過程，與植物生長發(fā)育密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)根內(nèi)微生物參與促進(jìn)植物生長發(fā)育、促進(jìn)植物激素產(chǎn)生提高植物免疫力，促進(jìn)植物氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素的獲取[23-25]。在擬南芥根內(nèi)微生物組形成中，有40% 的根內(nèi)微生物是根系周邊土壤微生物進(jìn)入，剩余60% 則是宿主植物自身選擇[26]。還有研究發(fā)現(xiàn)，多年生黃花亭薺根內(nèi)細(xì)菌15% 的群落變異性由外周土壤決定，而外界環(huán)境和植物本身解釋11% 的群落變異[27]。本研究通過高通量測序分析了生姜催芽后，根莖出芽生長0，15，30d 后根莖細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，在不接觸土壤環(huán)境下，生姜根莖微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性與生姜催芽生長密切相關(guān)。隨著生姜催芽生長，根內(nèi)微生物多樣性表現(xiàn)出顯著性的升高。本研究進(jìn)一步支持了植物根內(nèi)微生物組群落與植物生長發(fā)育本身也具有密切關(guān)系，除土壤這一主要因素外，環(huán)境及植物生長本身也是根內(nèi)微生物群落變化的另一重要因素。且在生姜根莖催芽生長的過程中，根莖微生物群落α-多樣性顯著升高，表明生姜根莖催芽生長過程中，有微生物定植于生姜根莖內(nèi)，導(dǎo)致根莖微生物的種群豐富度和均一度增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，在生姜根莖內(nèi)優(yōu)勢細(xì)菌門為：Proteobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria和Bacteroidetes。Proteobacteria 和Firmicutes 是植物根內(nèi)主要優(yōu)勢菌群[28]，但是不同植物根內(nèi)微生物組成結(jié)構(gòu)組成不同都有一定不同。植物根系代謝物與植物根系微生物的組成及功能密切相關(guān)[29]，而生姜根莖內(nèi)具有大量不同于馬鈴薯和擬蘭芥的代謝產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，在生姜催芽生長過程中，催芽開始生長到15d時，F(xiàn)irmicutes 和Cyanobacteria 的相對多度顯著性降低。而當(dāng)催芽30d后，F(xiàn)irmicutes 和Cyanobacteria 的相對多度又發(fā)生顯著性上升。推測認(rèn)為這與Firmicutes 和Cyanobacteria具有還原硝酸鹽和固碳的生物功能具有密切關(guān)系，它們對于生姜催芽生長時期的碳氮固定具有十分重要的意義[30-31]，且現(xiàn)有研究也表明，植物根系分泌物也為根系微生物的生長提供豐富的碳源及營養(yǎng)[32]。同時宏基因組分析研究也表明植物生長發(fā)育根系微生物參與碳水化合物代謝和運(yùn)輸?shù)幕蜃兓@著[28]。

大量研究表明，植物根系的生長發(fā)育與植物根系微生物組密切相關(guān)。例如，水稻根系微生物組與水稻根系發(fā)育生長時間密切相關(guān)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，德沃斯氏菌屬（Devosia）、纖維單孢菌屬(Cellulomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、單胞菌屬（Stenotrophomonas）、香味菌屬(Myroides)、Leucobacter、根瘤菌屬(Rhizobium)、瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)、Tyzzerella、Ruminiclostridium_9、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Ruminococcaceae、Alistipes等39種屬細(xì)菌與生姜根莖催芽生長密切相關(guān)。Ruminococcaceae、Ruminiclostridium[33]和Cellulomonas[34]都能夠產(chǎn)生多種纖維素酶，參與纖維素降解。Devosia屬的物種有能力與植物共生以固定氮[35]。Sphingobacterium屬中菌群分離于玉米根系，對于玉米生長具有明顯促進(jìn)作用[36]。Stenotrophomonas與植物生長和健康密切相關(guān)，且有利于植物[37]。植物生長過程中可以通過調(diào)節(jié)根系代謝物的成分選擇或者激活某些根內(nèi)有益菌的生長富集[38]。在生姜根莖催芽生長的過程中，Sphingobacterium屬等植物根系有益菌也出明顯富集現(xiàn)象，同時，細(xì)菌種群豐富與均勻度發(fā)生顯著增加。生姜根莖內(nèi)細(xì)菌表現(xiàn)出一種“復(fù)蘇”和“增殖”的狀態(tài)，積極響應(yīng)生姜的生長。但是具體相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍舊不清楚，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，生姜根莖細(xì)菌群落與生姜催芽生長密切相關(guān)，對于生姜的健康生長也具有密不可分的作用；因此，需要詳細(xì)研究根莖細(xì)菌群落與生姜發(fā)育生長代謝之間的關(guān)系，挖掘獲取其中參與調(diào)控生姜生長發(fā)育的關(guān)鍵有益細(xì)菌種群，這為后續(xù)提高生姜綠色健康栽培生產(chǎn)提供理論依據(jù)。