1株高效降煙堿煙草內(nèi)生菌的篩選、鑒定及其代謝途徑研究

蘇 丹，林智慧，王雪仁，封 磊，宋 萍，韓曉剛，李 航，游 凱，劉 潔，黃 楠

（1.福建農(nóng)林大學(xué)a.資源與環(huán)境學(xué)院，b.林學(xué)院，福州350002；2.福建省煙草公司三明市公司，福建三明365000）

煙堿（Nicotine），又名尼古丁，是一種高毒性且不易降解的環(huán)境污染物[1]，過量攝入能抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使呼吸停止和心臟麻痹[2]。同時，作為煙草中生物堿的主要成分，煙堿又是衡量煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，過高的含量會對其工業(yè)可用性產(chǎn)生不利影響。因此，如何降低并控制煙堿含量對于環(huán)境保護及改善煙草質(zhì)量均具有重要意義。常見的降解煙堿方法主要包括物理法、化學(xué)法及生物法。其中，生物法降解煙堿因具有見效快、專一性強、污染性低等特點，而展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[3]。YUAN等[4]從煙草種植土壤中分離并鑒定出1株高效尼古丁降解菌中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）DN2，在含有0.5～4.0g·L-1的尼古丁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中能降解所有尼古??；RUAN等[5]從煙草廢棄物的土壤中篩選到節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）aRF-1，該菌株降解尼古丁的最佳條件為30℃，pH 7.0，可降解煙堿濃度高達(dá)0.8g·L-1。WANG等[6]從土壤中分離篩選出1株具有尼古丁較高降解能力的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），13h可完全降解0.4g·L-1的尼古丁，其耐受質(zhì)量濃度高達(dá)0.6g·L-1；YAO等[7]從煙草廢棄物中分離出1株具有尼古丁降解能力的節(jié)桿菌株（Arthrobacter sp.），預(yù)測了尼古丁降解質(zhì)粒pAO1的尼古丁分解代謝基因，但未發(fā)現(xiàn)編碼于質(zhì)粒上的代謝功能基因。綜上所述，盡管國內(nèi)外在有關(guān)微生物降解煙堿方面已有較多報道，但其研究對象主要集中在假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、蒼白桿等少數(shù)幾類菌屬[4-7]，且大多來源于土壤或煙草廢棄物[8-10]。而近年來，隨著植物內(nèi)生菌研究領(lǐng)域的不斷擴大，一些生長在煙草體內(nèi)的內(nèi)生菌也引起了研究者的廣泛關(guān)注。張?zhí)鞐澋萚11]從烤煙煙葉中分離出1株內(nèi)生粗糙脈孢霉菌（Neurospora crassa），其發(fā)酵液添加到成品煙葉中，可有效降低33.9%的煙堿含量。趙麗萍等[12]從62個煙葉樣品中篩選出1株內(nèi)生細(xì)菌，該菌在煙堿為1‰的培養(yǎng)基中培養(yǎng)54h，降解率為98.76%。迄今為止，有關(guān)煙草內(nèi)生菌的研究工作尚處于初始階段，特別是有關(guān)內(nèi)生菌降解煙堿方面僅有少量幾篇報道，研究內(nèi)容也多集中在菌株的分離鑒定方面，而不同類型內(nèi)生菌對煙堿降解機制的相關(guān)研究，則尚未見報道。本研究以從福建三明煙區(qū)分離出的1株具有降解煙堿功能內(nèi)生菌為研究對象，測定該菌株的生長及其對煙堿的降解特性，并初步探究該菌株的煙堿降解途徑，其研究成果對于提升煙堿污染治理手段以及豐富微生物煙堿的降解機制具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草植株為福建三明煙區(qū)種植的云煙87，2019年3月采集并用于分離內(nèi)生菌。供試煙堿分析純（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）購自羅恩公司；煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）購自麥卡希；甲醇色譜級（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）購自阿拉丁公司；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀純度均為色譜純，其他試劑均為AR級試劑。

供試培養(yǎng)基為煙堿培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O13.3 g，MgSO4·7H2O 0.2g，微量元素溶液（MnSO4·7H2O 0.4g，Ca-Cl2·2H2O 0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2g使用0.1mol·L-1HCl定容至100 mL）0.5mL，水1000mL，pH值為7.0，于121℃滅菌20min[13]。煙堿滅菌后用0.22μm有機濾膜過濾，根據(jù)需要添加。上述煙堿培養(yǎng)基中加入18g瓊脂即為煙堿固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 煙堿降解內(nèi)生細(xì)菌的篩選與純化 采用組織分離和涂布平板法分離內(nèi)生菌[14]，從三明煙區(qū)選取健康的煙草植株，對其根、莖、葉進行清洗、消毒。以最后一次清洗的無菌水為空白對照，以此檢驗表面消毒效果。將植物組織研磨成勻漿，稀釋涂布在煙堿固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d。挑取不同形態(tài)的單菌落多次劃線純培養(yǎng)，直至得到純菌。

1.2.2 菌株形態(tài)特征觀察 將分離出的純菌接種到NB平板培養(yǎng)基中，置于恒溫生化培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)2～3d，形成明顯的菌落，觀察平板上菌落的大小。

挑取純化后的菌落接種于裝有NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，將其放于150r·min-1、30℃的振蕩器中培養(yǎng)至穩(wěn)定期。培養(yǎng)液經(jīng)過8000r·min-1離心30min去掉上清液保留菌體，菌體用無菌水反復(fù)洗滌，收集。將收集到的菌體加入2.5%的戊二醛溶液，并置于4℃下保存固定，用PBS緩沖液洗滌菌體3次，然后依次用乙醇和醋酸異戊酯脫水、置換，經(jīng)過冷凍真空干燥后，噴金制樣。利用掃描電子顯微鏡下（Phenom ProX SEM）觀察菌體形態(tài)特征。

1.2.3 菌株16S rDNA序列測定 取菌株在NB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3d，采用FastDNA SPIN Kit試劑盒提取DNA，對該菌株16S rDNA基因序列進行分析。16S rDNA擴增的引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min，95℃30s，56℃30s，72℃90s，25 次循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。DNA 純化和測序工作委托上海美吉生物公司完成。測序結(jié)果在NCBI 上的Blast進行同源性比對，下載同源性較高的已知分類菌種的16S rDNA 堿基序列。系統(tǒng)發(fā)育樹圖采用MEGA6軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建。

1.2.4 菌株生長曲線動力學(xué)研究 取菌株到NB 液體培養(yǎng)基中，在150r·min-1、30℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng)24h后作為種子液。種子液以1%的接種量接至新鮮的液體煙堿培養(yǎng)基中，煙堿濃度為0.5g·L-1，然后繼續(xù)在150r·min-1、30℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，每3h對培養(yǎng)液進行取樣，測量其在600nm 波長下的OD 值。以菌液的培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，600nm波長下的OD值為縱坐標(biāo)，以同時間取出離心后的液體煙堿培養(yǎng)基為空白，繪制菌株的生長曲線。

利用Slogistic模型對菌株進行生長曲線動力學(xué)擬合[15]。通過擬合得到的模型參數(shù)，計算出最大比生長速率μmax和微生物生長的延滯期λ。

式中：t為時間；Nt和N0為在t時和初始時間的微生物數(shù)量；a為最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的差值；XC為達(dá)到最大生長速率的時間；K為在時間點XC的最大生長速率；μmax為最大比生長速率；λ為生物生長的延滯期。

1.2.5 菌株的生長抑制濃度 在煙堿濃度為0.1、0.5、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0g·L-1的液體培養(yǎng)基中，接種1%的種子液，150r·min-1、30℃下恒溫培養(yǎng)至24h后測定其在600nm下的OD值。每個處理3組重復(fù)。

1.2.6 煙堿濃度測定 采用高效液相色譜（賽默飛U3000）測定煙堿濃度[16]。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250mm，5μm），紫外檢測器，檢測波長為254nm。流動相為甲醇：0.02mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.5）=60∶40，流速0.6mL·min-1，進樣量10μL，柱溫35℃。

1.2.7 降解特性 將培養(yǎng)24h的種子液接種到煙堿培養(yǎng)基中，設(shè)置pH值分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0；接種量分別為1%，2%，5%；煙堿濃度分別為0.5、1.5、2.0、3.0g·L-1，測定菌株Y5的生長情況及對煙堿的降解情況。

1.2.8 降解動力學(xué)模型 采用一級反應(yīng)動力學(xué)公式（4）對不同煙堿濃度下，菌株降解結(jié)果進行擬合。

式中：C0為體系中煙堿的初始濃度（mg·L-1）；Ct為t時刻體系中煙堿的濃度（mg·L-1）；k為煙堿降解速率常數(shù)（h-1）；t為降解時間（h）。

1.2.9 降解產(chǎn)物分析 利用GC-MS（島津GCMS-TQ8040）對不同時間段煙堿降解產(chǎn)物進行分析。色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（Column, 30m×0.25mm×0.25μm）。程序升溫：60℃保持2min，以10℃·min-1速率升溫至280℃，保持10min。離子源溫度為250℃，掃描范圍28～500m/z，載氣為氦氣，流速為1.0mL·min-1。采集完的數(shù)據(jù)，經(jīng)過GCMS Postrun Analysis定性處理，檢索譜庫為NIST14譜庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙堿降解菌的篩選和鑒定

利用煙堿作為唯一的碳源、氮源，從煙草葉片中分離篩選出1株高效降煙堿內(nèi)生細(xì)菌Y5。菌株Y5為不透明的淡橘色濕潤菌體，菌落呈不規(guī)則桿狀（圖1）。該菌株在掃描電子顯微鏡下的形態(tài)特征顯示菌體為直的短桿菌，菌株大小約為（0.4～0.8）μm×（1.3～2.2）μm。

圖1 菌株Y5的掃描電子顯微鏡圖Figure 1 Scanning electron microscope image of strain Y5

該菌株的16S rDNA 基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中許多假單胞菌屬基因序列同源性為99%。通過MEGA6軟件中Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2 可知，菌株Y5 與假單胞菌屬位于同一分支。推測菌株Y5屬于假單胞菌，命名為Pseudomonassp.Y5。向GenBank數(shù)據(jù)庫提交序列，注冊登錄號為MN515143。

圖2 菌株Y5的系統(tǒng)進化樹Figure 2 Evolutionary tree of strain Y5

2.2 菌株Y5生長曲線的動力學(xué)研究

采用Slogistic 模型對該菌株的生長曲線進行擬合（圖3），發(fā)現(xiàn)該模型的擬合程度較高，R2為0.99385，可以較好地描述Y5的生長情況。菌株Y5在9.1～9.4h達(dá)到最大生長速率，Y5的D600值最高達(dá)0.13841±0.00458，最大比生長率約為0.04，生長延遲期約為7.5h。

圖3 Slogistic模型擬合的菌株Y5生長曲線Figure 3 Growth curve of strain Y5 fitted by Slogistic model

2.3 煙堿對菌株Y5的抑制濃度

由圖4 可知，不同濃度的煙堿對菌株Y5 生長產(chǎn)生不同程度的影響，其光密度隨著煙堿濃度的增大先增加后減少。當(dāng)煙堿濃度為0.5～2.0g·L-1時，菌株生長良好。其中，煙堿濃度為2.0g·L-1時菌株生長最好，其OD600為0.270。當(dāng)煙堿濃度為0.1g·L-1，其光密度僅為0.027，細(xì)胞幾乎不生長。當(dāng)煙堿濃度為3.0、4.0、5.0g·L-1，其OD600分別為0.044、0.047和0.048，細(xì)胞生長受到抑制。

圖4 抑制菌株Y5生長的煙堿濃度Figure 4 Concentration of nicotine that inhibits strain Y5 growth

2.4 菌株Y5的降解特性

2.4.1 pH值對菌株Y5生長及降解能力的影響 由圖5a可知，當(dāng)pH值為7.0～8.0時，菌株Y5對煙堿的降解率分別為98%和88%，其中pH值為7.0時，降解率最高；當(dāng)pH值為5.0～8.0時，煙堿降解率均為65%以上，說明菌株Y5在pH值為5.0～8.0的范圍內(nèi)，降解活性較高。由圖5b可知，在pH為5.0～9.0的范圍內(nèi)，菌株均能生長。當(dāng)pH為5.0、6.0和9.0時，菌株生長較為緩慢，但是30h后也達(dá)到平衡，且平衡時的光密度與pH為7.0時的光密度無明顯差異。由此可知，該菌株對pH的生長適應(yīng)范圍較寬；在pH為5.0～8.0范圍內(nèi)，具有較高的降解活性。因此，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中具有潛力。

圖5 初始pH值對菌株Y5降解煙堿（a）及生長（b）的影響Figure 5 Effect of initial pH on nicotine degradation (a) by strain Y5 and growth (b)

2.4.2 接種量對菌株Y5生長及降解能力的影響 由圖6a可知，培養(yǎng)9h菌株Y5對煙堿的降解率分別為50%、72%和89%?？梢?，隨著接種量的增加，菌株降煙堿的速率逐漸增大。經(jīng)過12h培養(yǎng)，菌株Y5對煙堿的降解率基本一致，說明接種量對菌株最終的降解率并無明顯差異。由圖6b可知，在菌株的生長延遲期及對數(shù)增長期，增加接種量明顯影響了菌體數(shù)量的增長，然而在達(dá)到生長穩(wěn)定期，菌體數(shù)量并沒有明顯增加。考慮到接種量的增加對菌株穩(wěn)定期的生長量并無顯著差異，并且在12h煙堿降解率基本一致。因此，在后續(xù)試驗中接種量仍為1%。

圖6 接種量對菌株Y5降解煙堿（a）及生長（b）的影響Figure 6 Effect of inoculum on nicotine degradation (a) by strain Y5 and growth (b)

2.4.3 煙堿濃度對菌株Y5生長及降解能力的影響 由圖7a可知，當(dāng)煙堿濃度為0.5g·L-1時，降解速率最快，在15 h內(nèi)基本完全降解煙堿。當(dāng)煙堿濃度為1.5，2.0，3.0g·L-1，菌株Y5在48 h基本完全降解煙堿，降解率分別為99%、99%和96%。由圖7b可知，當(dāng)煙堿濃度低于2.0g·L-1時，菌株的生長隨煙堿濃度的增加而增加；在煙堿濃度為2.0g·L-1時，達(dá)到最大OD值。當(dāng)煙堿濃度高于2.0g·L-1時，菌株生長受到抑制。結(jié)果表明，該菌株在煙堿濃度為0.5～2.0g·L-1時生長良好，同時對煙堿降解效果明顯。當(dāng)煙堿濃度為3.0g·L-1時，菌株生長受到抑制，但生長菌株適應(yīng)一段時期后，能夠在48h內(nèi)基本完全降解煙堿。

圖7 煙堿濃度對菌株Y5降解煙堿（a）及生長（b）的影響Figure 7 Effect of nicotine concentration on nicotine degradation(a) by strain Y5 and growth(b)

2.4.4 降解動力學(xué)分析 采用一級反應(yīng)動力學(xué)公式對測定結(jié)果進行擬合。由圖8可知，菌株Y5對煙堿濃度為0.5，1.5，2.0，3.0g·L-1的降解速率常數(shù)分別為0.30738，0.1142，0.10759，0.07348h-1。結(jié)果表明，接種量一定時，隨著煙堿濃度增加，菌株降解煙堿的速率減小。

圖8 菌株Y5對不同濃度煙堿的降解動力學(xué)Figure 8 Degradation kinetics of different concentrations of nicotine by strain Y5

2.5 菌株Y5降解煙堿的代謝產(chǎn)物分析

通過GC-MS 對菌株Y5 煙堿降解過程中的代謝產(chǎn)物進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液主要成分除煙堿（RT=12.440min）外，還包括3-丙?；拎ぃ≧T=10.270min）、2,5-Dimethyl-1H-indol-6-amine（RT=13.3min）、脫甲基尼古丁（RT=13.477min）、N-甲基異煙酰胺（RT=13.565min）、尼古提林（RT=14.277min）、2,6-二叔丁基對甲酚（RT=14.571min）、去氫新煙堿（RT=14.836min）、5-pyridin-3-yloxolan-2-one（RT=15.985min）和可鐵寧（RT=17.134 min）等物質(zhì)。其中，N-甲基異煙酰胺與煙堿脫甲基途徑中的N-甲基煙酰胺為異構(gòu)體。6-二叔丁基對甲酚為煙堿添加的抗氧化劑。去氫新煙堿也稱新煙草堿，是煙草中的生物堿成分之一，存在于提取的煙堿中。

研究表明尼古提林（產(chǎn)物I，圖9b）、脫甲基尼古?。óa(chǎn)物II，圖9c）、可鐵寧（產(chǎn)物III，圖9d）為煙堿代謝過程中常見的中間產(chǎn)物，這些物質(zhì)在一些微生物代謝煙堿過程中被檢測到，如Pseudomonassp. HF-1[17]、Pseudomonassp. CS3[18]、Shinellasp. HZN1[19]。3-丙?；拎ぃóa(chǎn)物IV，圖9e）與5-pyridin-3-yloxolan-2-one（產(chǎn)物V，圖9f）為新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物。

圖9 菌株Y5降解煙堿的產(chǎn)物質(zhì)譜圖Figure 9 Mass spectrum of nicotine metabolites of strain Y5

2.6 菌株Y5煙堿代謝的可能途徑

在本研究中，菌株Y5 代謝煙堿檢測到脫甲基尼古丁、3-丙?；拎?、可鐵寧和尼古提林等物質(zhì)。如圖10所示，菌株Y5 降解煙堿由于作用在吡咯環(huán)上的反應(yīng)不同，可分別生成尼古提林、脫甲基尼古丁和可鐵寧。與Pseudomonassp.HF-1類似，脫甲基尼古丁可轉(zhuǎn)化為麥斯明[17]，進而生成3-丙?；拎ぃ砻鳠焿A結(jié)構(gòu)上的吡咯環(huán)已經(jīng)打開。此外，可鐵寧可轉(zhuǎn)化為5-pyridin-3-yloxolan-2-one，然后吡咯環(huán)開環(huán)生成3-琥珀酰吡啶、6-羥基-3-琥珀酰吡啶。以上均是通過攻擊煙堿的吡咯環(huán)，然后逐漸開環(huán)，這個規(guī)律與其他假單胞菌屬類似。已有的研究表明，吡咯途徑是假單胞菌屬降解煙堿的主要途徑，但是該類微生物具有代謝多樣性[8]。本研究觀察到菌株Y5中對吡咯烷的初始反應(yīng)與P. putidaS16中的最初反應(yīng)具有較大的區(qū)別[20]。菌株Y5 的初始反應(yīng)是對吡咯環(huán)的多方面攻擊生成尼古提林、脫甲基尼古丁、可鐵寧，而P. putidaS16中的第一步是通過煙堿的吡咯烷環(huán)上的脫氫生成N-甲基麥斯明。此外，在已報道的P. putidaS16中并未檢測到尼古提林、脫甲基尼古丁和可鐵寧等物質(zhì)。故推測菌株Y5 以一條新的吡咯烷代謝途徑降解煙堿（圖10）。

圖10 菌株Y5降解煙堿的代謝途徑Figure 10 Metabolic pathway of nicotine degradation by strain Y5

3 討論與結(jié)論

在本研究中，根據(jù)16S rDNA 序列和菌株形態(tài)分析，將具有高效降解煙堿能力的煙草內(nèi)生細(xì)菌Y5 鑒定為假單胞菌（Pseudomonassp.）。煙堿可作為降煙堿微生物的碳源、氮源，為微生物的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時也具有高毒性，過高的煙堿濃度會抑制微生物的生長。本研究中Y5 菌株能夠以煙堿為唯一的碳源、氮源，可耐受煙堿為3.0 g·L-1，明顯高于Pseudomonassp. HF-1[21]。該菌株在pH 為5.0～8.0 的范圍內(nèi)，生長良好且具有較高的降解活性。與已有報道相比，Pseudomonassp.HF-1 降解煙堿的最適條件為30℃，pH 值僅為6.5～7.5[21]。而Pseudomonas plecoglossicidaTND35在pH為5.5～7.0具有較高的降解活性[22]。此外，隨著接種量的增加，Y5菌株對煙堿的降解速率明顯增加，但并沒有提升對煙堿的最終降解率。尹彪[23]發(fā)現(xiàn)Pseudomonassp.CS3 培養(yǎng)24 h，在5%～10% 的接種量下，對煙堿降解率的差異不明顯，而1%的接種量對尼古丁降解率顯著降低，說明接種量影響菌株CS3對煙堿的降解率。

盡管許多研究表明，降煙堿微生物容易適應(yīng)被污染的環(huán)境，從受煙堿污染的環(huán)境中篩選得到大量的細(xì)菌、真菌[24]，該類微生物能夠降解高濃度的煙堿，但是局限于從環(huán)境中篩選。最近幾年，舒明[9]從煙草提取液中篩選得到的降煙堿假單胞菌JY-Q，最高能降解煙堿濃度為5.0g·L-1。鄧娜娜等[25]從煙田土壤中篩選到Arthrobactersp. AH14，最高能在120 h 內(nèi)將6.0g·L-1的煙堿完全降解，該菌株為目前國內(nèi)分離得到的降煙堿能力最強的菌株。本研究中Y5 菌株在煙堿濃度為3.0g·L-1時，能夠在48h 內(nèi)對煙堿降解率為96%。而趙麗萍從煙葉樣品中篩選出1株內(nèi)生細(xì)菌，達(dá)到類似的降解率需要54h[12]。

微生物降解煙堿的途徑已被廣泛研究，多數(shù)集中在細(xì)菌和一些真菌。目前，闡述比較完整的代謝途徑主要有4種：以真菌為主的脫甲基途徑、吡啶途徑、吡咯烷途徑以及吡啶吡咯烷交叉途徑。除了上述報道比較完整的代謝途徑外，還存在另外的途徑，主要集中在Pseudomonas plecoglossicidaTND35[22]、Pseudomonassp. HF-1[26]、Pseudomonassp. Nic22[3]、Shinellasp. HZN1[19]、Pseudomonas geniculataN1[27]、Pseudomonassp. CS3[18]。這些菌株在降解煙堿過程中，檢測到一些不同上述途徑的中間產(chǎn)物，如尼古提林、可鐵寧和1-Methyl-5-(pyridin-3-yl)pyrrolidin-2-ol等物質(zhì)。在一些菌株代謝過程中還檢測到脫甲基尼古丁、麥斯明和尼古提林。這些菌株具體的代謝途徑有關(guān)的酶以及降解有關(guān)的基因還需進一步研究。本研究，通過GC-MS對Pseudomonassp.Y5在煙堿培養(yǎng)基中進行代謝產(chǎn)物分析，檢測到一系列代謝產(chǎn)物，如尼古提林、脫甲基尼古丁、3-丙?；拎ぁ⒖设F寧和5-pyridin-3-yloxolan-2-one等物質(zhì)。其中，3-丙?；拎づc5-pyridin-3-yloxolan-2-one為新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物，在煙堿的代謝途經(jīng)中未見報道。根據(jù)檢測結(jié)果，推測菌株Y5以一條新的吡咯烷代謝途徑降解煙堿。