基于HPLC指紋圖譜的木薯葉類黃酮質(zhì)量研究

詹春蓮，陳新富，麥力文，楊 霞，王定美,

（1.海南省文昌市會(huì)文鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，海南文昌 571343；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南?？?571101；3.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199；4.海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571101）

植物類黃酮由于具有天然、無毒、抗氧化活性等特點(diǎn)，利用其開發(fā)的功能食品及添加劑，日益受到人們重視[1?4]。木薯（Manihot esculenta）為世界第五大糧食作物，在熱帶地區(qū)廣泛栽培，木薯葉作為木薯生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，產(chǎn)量高，可達(dá)10 t/ha，目前除少部分作低附加值飼料外，大部分被丟棄，尚未得到充分開發(fā)利用[5]。研究表明，木薯葉類黃酮對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷具有保護(hù)作用[6]，具有較高的抑菌活性[7?8]，與維生素C相比木薯葉類黃酮表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[9]，并能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力[10?11]；實(shí)踐也表明，木薯葉經(jīng)搗爛、煮熟后，不僅可以作為蔬菜食用，還可以治療膀胱炎，并且孕婦和哺乳期的婦女均可食用[12]。說明木薯葉類黃酮在功能食品方面有著極大的開發(fā)潛力。

植物類黃酮為多組分復(fù)雜體系，其化學(xué)成分的多樣性和復(fù)雜性是其功效發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也是質(zhì)量評(píng)價(jià)的重點(diǎn)與難點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，木薯葉的保健功能可能與其含有豐富的類黃酮化合物有關(guān)，如能調(diào)節(jié)血脂、抗炎抑菌、抗氧化、抗腫瘤及抗病毒等[13?15]。類黃酮作為一種植物體內(nèi)代謝產(chǎn)物，其種類和組成受品種、產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境、栽培技術(shù)等多因素共同影響，往往有一定的區(qū)別，有些還差異明顯[16?19]。目前已鑒定的木薯葉類黃酮成分包括槲皮素、山奈酚、蘆丁、clovin、楊梅素-3-O-蕓香糖苷、金絲桃苷、刺槐甙、煙花甙、水仙甙、二氫黃酮甙、穗花杉雙黃酮、兒茶素等已達(dá)60余種[20?23]，而目前缺少針對(duì)如何全面表征木薯葉類黃酮質(zhì)量的報(bào)道，與木薯葉類黃酮質(zhì)量密切相關(guān)的特征成分尚不清楚，難以對(duì)木薯葉開展針對(duì)性的質(zhì)量控制，制約木薯葉類黃酮功能食品開發(fā)。

指紋圖譜是基于食品的固有品質(zhì)特性，運(yùn)用光譜、色譜等現(xiàn)代儀器檢測得到的能反映該食品內(nèi)部特征的圖譜，具有整體性、系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性的特點(diǎn)[24]。指紋圖譜已成為食品產(chǎn)地鑒別、真?zhèn)舞b別、優(yōu)劣鑒別與生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制的有效工具[25?28]，為木薯葉類黃酮的質(zhì)量控制提供了方法學(xué)借鑒。但目前未見有關(guān)于木薯葉類黃酮指紋圖譜研究的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于如何針對(duì)性的進(jìn)行質(zhì)量控制，更是缺少可靠依據(jù)。聚類分析是用相似度來衡量樣品之間的親疏程度，并以此來實(shí)現(xiàn)分類的一種方法[29]。主成分分析法是將多個(gè)相關(guān)性指標(biāo)轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，從而使繁多的求解目標(biāo)簡化的一種方法[30]。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量法進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，可相互驗(yàn)證和補(bǔ)充，能更全面地體現(xiàn)研究對(duì)象的內(nèi)在品質(zhì)[31]?；诖?，本研究采用高效液相色譜法，研究建立木薯葉類黃酮指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析、主成分分析等對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，篩選出與其質(zhì)量密切相關(guān)的特征成分，旨在為木薯葉類黃酮質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新途徑、并為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用樣品 分別為6個(gè)木薯品種（SC06、SC07、SC09、SC10、SC205、BC）的120、180、240 d植齡的葉片樣品，并按“品種-植齡”進(jìn)行編號(hào)，采自海南省?？谑腥?zhèn)美達(dá)農(nóng)園農(nóng)場種植基地（19.0°55.0'9.196"N，110.0°34.0'34.939"E）。新鮮木薯葉片洗凈后經(jīng)60 ℃烘干至恒重后，粉碎至粒徑0.3 mm后，?20 ℃保存?zhèn)溆?；?biāo)準(zhǔn)品蘆?。╮utin，含量≥98.1%，批號(hào)：1022799）、二氫黃酮甙（hesperidin，含量95.3%，批號(hào)：110721-201316）、槲皮 素（quercetin，含 量≥96.5%，批 號(hào)：100081-200907）、穗花杉雙黃酮（amentoflavone，含量≥90.2%，批號(hào)：111902-201102） 中國食品藥品檢定研究院；山奈酚（kaempferol，含量≥98.0%，編號(hào)：K107144） 阿拉丁公司；甲醇、乙腈為色譜純；超純水；其它試劑 均為分析純。

Waters e2605高效液相色譜儀 美國沃特斯公司；METTLER TOLEDO AL204電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木薯葉類黃酮樣品的制備 參考文獻(xiàn)[9]，采用超聲波輔助法制備木薯葉類黃酮，具體為：精確稱取1.0 g樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入40 mL 90%的乙醇提取液，進(jìn)行超聲波輔助提取，提取條件為：功率90 W，溫度70 ℃，時(shí)間20 min。合并兩次提取的上清液，在50 ℃、55 r/min下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，用90%乙醇清洗至50 mL離心管中，直立放置于4 ℃冰箱中12 h，在4000 r/min離心10 min后，上清液轉(zhuǎn)至圓底燒瓶中，50 ℃、55 r/min下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，用乙腈清洗膏狀物再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以保證乙醇徹底揮發(fā)，用乙腈清洗膏狀物至25 mL容量瓶中，定容后貯存在?20 ℃作為液相分析備用液。HPLC分析前，吸取備用液過0.22 μm濾膜。

1.2.2 色譜條件 以實(shí)驗(yàn)室前期建立的色譜條件為基礎(chǔ)[17]，優(yōu)化修改后如下：色譜柱CNW Athena C18-WP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.02%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～50 min,10%～80% A；50～55 min, 80%～100%A；55～57 min,100%A；57～59 min, 100%～10%A；59～68 min,10%A），流速1.0 mL/min，柱溫室溫，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長270 nm。

1.2.3 方法學(xué)考察 按以下實(shí)驗(yàn)條件，在“1.2.2色譜條件”下進(jìn)行測樣分析，計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD：a.精密度實(shí)驗(yàn)：同一份樣品備用液，連續(xù)進(jìn)樣6次分析；b.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：同一份樣品備用液分別于0、4、8、12 h進(jìn)樣分析；c.重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品，平行稱取6份，按“1.2.1”制備木薯葉類黃酮樣品，按“1.2.2” 色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和計(jì)算。將HPLC圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）》軟件，生成木薯葉類黃酮指紋圖譜共有模式，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。用SPSS 25、SIMCA 14.0軟件對(duì)HPLC圖譜共有峰進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

采用1.2.2所述色譜條件，木薯葉類黃酮樣品連續(xù)測定6次，各共有峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別小于0.14%和0.91%，說明該方法具有較高的精密度。同一樣品在12 h內(nèi)的6次測定結(jié)果中，各共有峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.03%～0.18%和0.03%～1.65%，說明該方法在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。同時(shí)，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各共有峰保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.04%～0.19%和1.06%～3.67%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。因此，本文采用的高效液相色譜法可準(zhǔn)確表征不同品種不同植齡木薯葉中組成與含量復(fù)雜多樣的類黃酮物質(zhì)群，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)木薯葉類黃酮質(zhì)量提供了可靠的方法學(xué)依據(jù)，克服了現(xiàn)評(píng)價(jià)方法難以全面反映木薯葉類黃酮質(zhì)量不足問題。

2.2 指紋圖譜共有模式的確定

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件》（2004A版），以SC06-120的色譜圖為參照，時(shí)間窗口設(shè)為0.5，選擇樣品中均含有的、含量相對(duì)較高且分離度較好的色譜峰位進(jìn)行多點(diǎn)校正，釆用平均數(shù)法生成對(duì)照圖譜。結(jié)果見圖1、圖2（b），從18張圖譜中匹配出5個(gè)共有峰（X3、X6、X13、X15、X18），這些共有峰的峰面積之和均大于整張色譜圖峰面積的90%，證明本文建立的指紋圖譜符合中藥色譜指紋圖譜的評(píng)價(jià)要求，可用于評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)樣品的整體質(zhì)量。以上共有峰，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照指認(rèn)，如圖2（a），色譜峰X3、X6、X15分別為蘆丁、二氫黃酮苷、穗花杉雙黃酮，X13、X18未能指認(rèn)。以此5個(gè)共有峰作為特征峰，以色譜峰X6為參照，計(jì)算各樣品共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見表1。由表1可知，各品種各植齡樣品的共有峰相對(duì)保留時(shí)間基本一致（RSD范圍為0～0.136%）。由上述結(jié)果可見，各特征峰穩(wěn)定、具有指紋圖譜特征性，可初步視為木薯葉類黃酮的指標(biāo)成分群。

圖1 木薯葉類黃酮HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of flavonoids from cassava leaves

表1 各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（min）Table 1 Relative retention time of each common peak（min）

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC指紋圖譜（a）和各樣品HPLC指紋圖譜的共有模式（b）Fig.2 HPLC fingerprints of mixed standards （a） and common pattern from each sample （b）

2.3 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

以18個(gè)木薯葉樣品類黃酮的共有模式（R）為對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。各樣品的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度范圍為0.886～0.998（大于0.88），說明不同品種不同植齡的木薯葉類黃酮表現(xiàn)出較好的相似度，說明其類黃酮成分組成基本一致，但不同品種和植齡的樣品色譜峰的峰面積有差異（見表3），RSD為19.86%～51.84%，說明其化學(xué)成分含量存在一定差異。

表2 木薯葉類黃酮指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Table 2 Similarity evaluation of fingerprints of flavonoids from cassava leaves

表3 各共有峰的相對(duì)峰面積Table 3 Relative peak area of each common peak

2.4 木薯葉類黃酮樣品聚類分析

將各共有色譜峰峰面積相對(duì)于稱樣質(zhì)量進(jìn)行量化，使用SPSS25.0軟件對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間平均聯(lián)結(jié)法、余弦法測度方法，結(jié)果見圖3（a）。由圖3（a）可知，當(dāng)測度值約為8時(shí)，木薯葉樣品經(jīng)聚類分析后被分為四類：I類包括BC-120、SC10-180、SC09-240、SC09-120、SC10-120、SC205-120、SC09-180、SC205-180、SC07-240、BC-120、SC09-120；II類為SC06-120、SC06-240、SC06-180；III類包 括SC07-120、BC-240；Ⅴ類 包 括SC07-180、SC10-240、SC205-240、BC-180。結(jié)合基于聚類分析排列順序的相似度線性擬合圖如圖3（b），各樣品的聚類情況見該圖虛線圓形標(biāo)識(shí)，分為4類，與聚類分析結(jié)果一致。但從相似度大小排列來看，總體上I類＞III類＞II類＞V類，其中I類與III類（其相似度在0.96以上）、II類與Ⅴ類（其相似度在0.96以下）較接近。聚類結(jié)果為相似度分析作了補(bǔ)充。以上分析中，除SC06、SC09外，同一品種不同植齡的樣品均不能歸到一類并且質(zhì)量水平差別較大，同時(shí)，不同品種不同植齡的樣品亦能聚到一起，說明不同品種不同植齡的樣品具有一定的內(nèi)在相似性。證明了木薯葉類黃酮的相似性受品種和植齡的共同影響，與王琴飛等[18]的研究結(jié)果“不同品種不同生育期的木薯葉片黃酮醇物質(zhì)含量差異較大”一致。

圖3 聚類分析圖（a）與相似度線性擬合圖（b）Fig.3 Clustering analysis diagram （a） and similarity linear fitting diagram （b）

2.5 主成分分析

以5個(gè)共有峰為對(duì)象，利用SPSS25.0軟件進(jìn)行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值及其方差貢獻(xiàn)率，結(jié)果見表4，可見主成分?jǐn)?shù)為2時(shí)，特征值均大于1，但此時(shí)方差累計(jì)貢獻(xiàn)率只有69.886%，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為3時(shí)，方差累計(jì)貢獻(xiàn)率可達(dá)到86.748%，但此時(shí)特征值為0.843，未達(dá)到1。陡坡圖是根據(jù)各主成分對(duì)數(shù)據(jù)變異的解釋程度繪制的圖，圖上每一個(gè)主成分為一個(gè)點(diǎn)，通過“陡坡趨于平緩”的位置判斷提取主成分的數(shù)量。本研究中，陡坡圖見圖4，可見，第四主成分之后的數(shù)據(jù)趨于平緩，因此認(rèn)為提取的前3個(gè)主成分可用來代表本研究中木薯葉類黃酮指紋圖譜共有峰的大部分信息，可以顯示研究樣品的相似性與差異性。選取前3個(gè)主成分作為公因子，對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，按方差貢獻(xiàn)率加權(quán)計(jì)算綜合得分，結(jié)果見表5。可見，排名前3的樣品為SC10-180、SC205-120、SC205-180，綜合得分在2.2以上，其中，SC10-180因子1和3表現(xiàn)突出，SC205-120和SC205-180因子2和3表現(xiàn)突 出；SC06-240、SC07-120、SC205-240、SC10-240的綜合得分值均在?2以下，排名較低。

表5 主成分分析綜合得分排序表Table 5 Ranking table of aggregate scores of principal component analysis

圖4 主成分分析陡坡圖Fig.4 Steep slope plot of principal component analysis

表4 主成分分析特征值與貢獻(xiàn)率Table 4 Eigen value and contribution rate of principal component analysis

為了進(jìn)一步確定與木薯葉類黃酮質(zhì)量密切相關(guān)的成分，將樣品共有峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.0中，用PCA-X模型對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析。主成分載荷見圖5。離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)對(duì)模型影響較大，離中心較近的點(diǎn)對(duì)模型影響較小，由圖5可知，指紋圖譜中對(duì)于聚類起主要作用的色譜峰為X3、X6、X15，即蘆丁、二氫黃酮苷、穗花杉雙黃酮這3個(gè)成分與其質(zhì)量有密切的相關(guān)性。建議以后在質(zhì)量控制上要重點(diǎn)關(guān)注這3個(gè)成分?，F(xiàn)有報(bào)道已證明，以上3種黃酮成分具有多種生物功能，說明木薯葉在保健方面有很大的開發(fā)潛力。另據(jù)王偉等[22]、王定美等[17]、陶海騰[21]報(bào)道，蘆丁、穗花杉雙黃酮是SC07、SC09、SC205木薯葉類黃酮的主要成分，蘆丁和煙花甙是SC05木薯葉類黃酮的主要成分，與本研究結(jié)果不完全一致，推測主要是由于種植地區(qū)不同造成的。為了建立更為廣泛的木薯葉質(zhì)控方法，應(yīng)進(jìn)一步采集不同種植地區(qū)的木薯葉樣品進(jìn)行測定分析。

圖5 特征峰主成分分析載荷圖Fig.5 Principal component analysis load diagram of characteristic peak

通過主成分分析PCA得分圖（圖6）可知，以X3、X6、X15色譜峰3個(gè)主成分為指標(biāo)成分進(jìn)行得分分析，各得分點(diǎn)均位于Hotelling的T2公差橢圓之內(nèi)，無離群值，與指紋圖譜相似度不小于0.88一致，說明各樣品之間趨同性較高。根據(jù)得分點(diǎn)分布，圖中可分為四個(gè)得分區(qū)，其中I區(qū)包括BC-120、SC10-180、SC09-240、SC09-120、SC10-120、SC205-120、SC09-180、SC205-180、SC07-240、SC09-180、SC205-180、SC07-240；II區(qū) 為SC06-120、SC06-240、SC06-180；III區(qū)包括SC07-120、BC -240；Ⅴ區(qū)包括SC07-180、SC10-240、SC205-240、BC-180，其分區(qū)結(jié)果與聚類分析一致。這也驗(yàn)證了上文結(jié)論：色譜峰X3、X6、X15所代表的類黃酮成分與本文所考察的18個(gè)樣品質(zhì)量有密切的相關(guān)性。以上化學(xué)計(jì)量分析方法，相互驗(yàn)證和補(bǔ)充。

圖6 主成分分析得分圖Fig.6 Score plot of principal component analysis

3 結(jié)論

植物類黃酮組分復(fù)雜多樣，本文采用的HPLC指紋圖譜法通過考察精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，結(jié)果均符合方法學(xué)要求，能系統(tǒng)、客觀反映出不同品種不同植齡木薯葉樣品中類黃酮物質(zhì)群的內(nèi)在質(zhì)量信息。指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)、聚類分析與主成分分析，又進(jìn)一步探討樣品內(nèi)在質(zhì)量的差異性及引起差異的原因，表明：各樣品木薯葉類黃酮特征指紋圖譜的相似度在0.88以上，主成分分析得分圖中各樣品的得分點(diǎn)均未超出公差橢圓，不同品種不同植齡的木薯葉類黃酮的質(zhì)量比較一致。聚類分析將木薯葉類黃酮分為4類，不同品種不同植齡的樣品亦能聚到一起，表明木薯葉類黃酮的相似性受品種和植齡的共同影響。主成分分析結(jié)果顯示，前3個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為86.748%，SC10-180、SC205-120、SC205-180樣品綜合得分最高（＞2.2）、質(zhì)量最好，蘆丁X3峰、二氫黃酮苷X6峰、穗花杉雙黃酮X15峰與木薯葉黃酮質(zhì)量有密切的相關(guān)性。該結(jié)果為評(píng)價(jià)木薯葉類黃酮提供了新途徑，也為開展木薯葉類黃酮質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。為了建立更為廣泛的木薯葉類黃酮質(zhì)量控制，應(yīng)進(jìn)一步采集不同種植地區(qū)的木薯葉樣品進(jìn)行測定分析。