重組蔗糖磷酸化酶表達培養(yǎng)基的優(yōu)化及化學試劑對酶活的影響

張 蕙，周曉梅，張 彪，孫 曉，李文杰, ，李拖平

（1.吉林師范大學博達學院食品科學與工程學院，吉林四平 136000；2.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽 110866；3.吉林師范大學生命科學學院，吉林四平 136000；4.沈陽市婦嬰醫(yī)院，遼寧沈陽 110011）

蔗糖磷酸化酶（EC2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，SPase）屬于糖基水解酶第13家族，是催化轉移葡萄糖苷鍵的特異性酶，能催化蔗糖發(fā)生磷酸解作用，生成1-磷酸葡萄糖（glucose-1-phosphate, Glc1P）和D-果糖以及其逆反應[1?2]。由于該催化特性，SPase長期以來一直用于生產Glc1P。此外，SPase結構穩(wěn)定，具有廣泛的底物特異性，在食品、藥品、化妝品等領域上均有廣泛的應用,如可催化半乳糖、鼠李糖、果糖等物質合成不同的低聚糖；修飾和改造含有醇羥基、酚羥基及羧基的化合物；或可以將曲酸糖苷化、催化氫醌合成熊果苷等[3?5]；也可以用于合成某些不穩(wěn)定物質的衍生物，如將葡糖基轉移到抗壞血酸上，使其穩(wěn)定性和水溶性得到提升[6]。

SPase主要存在于乳酸菌和雙歧桿菌中，有利于其能量代謝[7]。Kagan等[8]首次從Leuconostoc mesenteroides中發(fā)現(xiàn)SPase后，研究人員相繼從不同的微生物中發(fā)現(xiàn)了該酶,如Pseudomonas saccharophila[9?10]、Stococcus mutans[11]、Bifidobacterium adolescentis[12]等。但通過野生菌株發(fā)酵獲得的SPase產率較低，難以滿足大規(guī)模的工業(yè)化生產。所以，采用基因工程技術構建重組SPase工程菌，實現(xiàn)該酶的高效表達是一條合理且有利的途徑。常用于構建重組SPase工程菌的菌株有大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，如E. coliRosetta（DE3）、E. coliBL21、B.subtilisWS11等[13?14]。

目前，國內外對于重組SPase工程菌的研究大多是工程菌的構建、應用、固定化、酶學性質分析和表達條件的優(yōu)化等[15?20]，但幾乎沒有對重組SPase表達培養(yǎng)基成分優(yōu)化的研究。同時，化學試劑對SPase的影響直接關乎到該酶的貯存和使用，而這方面的研究也少之又少。因此，本文對來源于雙歧桿菌的SPase基因的重組菌株E. coliBL21/pET30-SPase表達培養(yǎng)基的成分進行了優(yōu)化，研究了不同的培養(yǎng)基成分對SPase表達的影響，并探究了常見化學試劑和金屬離子化合物對該酶活性的影響，以期為SPase的高效生產提供理論與技術的支撐條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組菌E. coliBL21/pET30-SPase 由本實驗室保存。其中，SPase基因克隆自Bifidobacterium longumJCM 1217（AB303838），與載體pET-30連接，轉化至大腸桿菌BL21中[21]；蛋白分子量Marker 北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半 乳 糖 苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）、BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；葡萄糖磷酸變位酶（phosphoglucomutase，PGM，100 U/mg）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH，150 U/mg）、1,6-二磷酸葡萄糖（Glucose-1,6-diphosphate，Glc 1,6-bP） 上海瑞永生物科技有限公司；其他試劑 均為國產分析純；LB培養(yǎng)基 按文獻配制[5]。

HNY-21恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16M高速冷凍離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SLPe超聲波細胞粉碎機 廣州中善儀器儀表有限公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌E. coliBL21/pET30-SPase的表達從LB固體平板上挑取單菌落接種于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。按1%接種量接種于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600=0.5～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)20 h[22]。

1.2.2 SPase粗酶液的制備及純化 將目的菌培養(yǎng)液離心（4 ℃、10000 r/min、10 min），收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌兩次沉淀。然后，超聲破碎細胞（超聲3 s、間歇5 s、共3 min，功率100 W），4 ℃、15000 r/min離心30 min得到粗酶液（上清液）。使用Ni-NTA柱以含60 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液（20 mmol/L，pH7.0）對粗酶液進行洗脫純化得到目標蛋白。

1.2.3 SPase的酶活性測定 將150 μL酶液和150 μL蔗糖溶液（10 mmol蔗糖、50 mmol/L磷酸緩沖液，pH7.0）在30 ℃反應30 min后，立即煮沸滅活10 min。加入300 μL反應液在30 ℃中反應30 min，然后在340 nm處測定吸光度值。反應液為2.5 U/mL PGM、2 U/mL G6PDH、20 μmol/L Glc 1,6-bP、2 mmol/L NADP+、10 mmol/L MgCl2、50 mmol/L MOPS緩沖液（pH7.0）[23?24]。采用標準曲線法，按照標準曲線公式y(tǒng)=2.1387x（R2=0.9992）計算酶與底物反應過程中生產的Glc1P。

酶活性定義為：在30 ℃、pH7.0條件下，以蔗糖為底物，每分鐘產生1 μmol的Glc1P所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

總酶活（U）為50 mL培養(yǎng)基中的總酶活。

1.2.4 蛋白含量測定及SDS-PAGE分析 以牛血清蛋白（BSA）為標準品，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質含量。SDS-PAGE采用12%濃縮膠和5%分離膠進行電泳，用考馬斯亮藍R-250染色?？偟鞍祝╩g）為50 mL培養(yǎng)基中蛋白的總量。

1.2.5 培養(yǎng)基成分的篩選 以50 mL LB培養(yǎng)基為基礎，并作為空白對照，將不同的碳源、氮源、穩(wěn)定劑、金屬離子分別加入到LB培養(yǎng)基中，按1.2.1方法培養(yǎng)。以總蛋白和總酶活為評價指標，考察其對SPase表達的影響。根據(jù)參考文獻[25?27]確定實驗方案如下：在考察碳源對SPase表達的影響時，分別向LB培養(yǎng)基中添加的碳源為0.5%葡萄糖、0.5%可溶性淀粉、0.5%蔗糖和0.5%丙三醇；在考察氮源對SPase表達的影響時，分別向LB培養(yǎng)基中添加的氮源為0.5%NaNO3、0.5%NH4Cl、0.5%（NH4）2SO4和0.5%尿素；在考察穩(wěn)定劑對SPase表達的影響時，分別向LB培養(yǎng)基中添加的穩(wěn)定劑為0.1%BSA、0.1%精氨酸、0.1%維生素C和0.1%FeCl2；在考察金屬離子對SPase表達的影響時，分別向LB培養(yǎng)基中添加的金屬離子為0.1%KH2PO4、0.1%MgSO4、0.1%CuSO4和0.1%ZnCl2。

1.2.6 正交試驗優(yōu)化 在單因素實驗的基礎上，選擇對重組SPase的表達有顯著性提高的因素，并根據(jù)現(xiàn)有的相關研究中較優(yōu)的因素水平[25?27]確定正交試驗的因素水平（表1）。以淀粉、K+和Mg2+為變量因子，以總酶活為評價指標，進行三因素三水平的正交試驗，研究三種培養(yǎng)基成分的協(xié)調作用對SPase表達的影響。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.7 化學試劑對重組SPase酶活性的影響 依據(jù)參考文獻[28]的方法，向純化的重組SPase酶液中分別加入不同的化學試劑或金屬離子化合物，考察其對重組SPase酶活性的影響。分別加入0.1%的吐溫80、BSA、丙三醇、山梨醇、維生素C、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；1%的吐溫80、BSA、丙三醇、山梨醇、維生素C、SDS；1 mmol/L的FeSO4、MgSO4、ZnCl2、CuSO4、MnSO4、CaCl2；10 mmol/L的FeSO4、MgSO4、ZnCl2、CuSO4、MnSO4、CaCl2。將對照組和實驗組在30 ℃下保溫1 h，測定其酶活。以未經試劑處理的酶液作為對照，酶活設定為100%，計算處理后的相對酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中的每組實驗均平行三次，采用Excel 2010軟件制圖，應用SPSS 18.0軟件進行正交試驗的方差分析和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 碳源和氮源對重組SPase表達的影響

碳源和氮源是培養(yǎng)基的重要組成部分，是微生物生長代謝的能量來源和物質基礎，與目的蛋白的表達有著密切的聯(lián)系[29]。對培養(yǎng)基中碳源的研究結果如圖1a所示，向LB培養(yǎng)基中添加0.5%可溶性淀粉可顯著提高SPase的總酶活和總蛋白含量（P＜0.05），而蔗糖和丙三醇的添加雖然提高了蛋白的表達量，但其酶活性極顯著降低（P＜0.01），推測這可能是由重組蛋白的高水平表達易形成無活性的包涵體[30]。氮源對SPase表達的影響如圖1b所示，實驗所用的四種氮源中，NaNO3對目的蛋白表達無顯著的影響（P＞0.05），其余三種氮源均較為明顯的抑制了SPase蛋白的表達。并且，通過總蛋白含量和總酶活所表現(xiàn)的不同氮源和碳源對蛋白表達的影響與SDSPAGE分析結果（圖1c）相一致（目的蛋白的分子量為56.51 kDa）。

圖1 碳源和氮源對重組SPase表達的影響Fig.1 Effects of carbon and nitrogen sources on the expression of recombinant sucrose phosphorylase

2.2 穩(wěn)定劑和金屬離子對重組SPase表達的影響

穩(wěn)定劑除了可以影響酶的活性和穩(wěn)定性以外，對微生物的生長也具有一定的影響效應[31]。如圖2a所示，四種穩(wěn)定劑對重組SPase在大腸桿菌中的表達均起到了抑制作用，SDS-PAGE分析（圖2b）也顯示了同樣的結果。其中，維生素C和FeCl2極顯著（P＜0.01）抑制了蛋白的表達，這可能是由于維生素C和FeCl2抑制了大腸桿菌的生長，從而使菌密度和SPase的表達水平降低，導致總蛋白和總酶活較低。

圖2 穩(wěn)定劑和金屬離子對重組SPase表達的影響Fig.2 Effects of stabilizers and metal ions on the expression of recombinant sucrose phosphorylase

金屬離子是微生物生長繁殖及產物合成中的重要輔助因子，作為其生理活性物質的組成或生理活動的調節(jié)物，對酶的活性具有一定的激活作用[32]。由圖2c可知，培養(yǎng)基中添加0.1% K+或Mg2+均提高了SPase的總酶活和總蛋白含量，促進了大腸桿菌的生長及SPase的表達。而Cu2+和Zn2+的添加則完全抑制了菌體的生長和SPase的表達。這可能是由于Cu2+和Zn2+的金屬毒性較強，當其與微生物接觸后，會破壞微生物的蛋白質結構，使微生物體內的一系列生化反應發(fā)生紊亂，從而導致了微生物的死亡[33]。同時SDS-PAGE的分析（圖2d）結果也支持了總酶活和總蛋白含量的測定結果，可明顯的看出K+或Mg2+處理的目標蛋白條帶較粗。

2.3 培養(yǎng)基最優(yōu)組成的正交試驗結果

由表2、表3可知，在三個因素中對SPase表達影響的大小順序為C＞B＞A，即Mg2+的添加量對SPase表達的影響表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01），K+和淀粉的添加量對SPase表達的影響表現(xiàn)為顯著（P＜0.05）。培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A2B2C1，即淀粉的添加量為0.5%、K+的添加量為0.1%和Mg2+的添加量為0.05%。根據(jù)所得最優(yōu)培養(yǎng)基組合進行驗證試驗，SPase的總酶活平均值達到1207.83 U，比該酶在單因素實驗的基礎培養(yǎng)基中表達的總酶活提高了3.6倍，其優(yōu)化結果在SPase的工業(yè)化生產中具有較大的應用潛力。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗的方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experimental results

2.4 化學試劑和金屬離子對重組SPase穩(wěn)定性的影響

當某些化學試劑與酶混合后，有可能影響酶的分子結構，近而對酶的活性產生不同程度的影響[34]。從表4的結果可以看出，低濃度（0.1%）的吐溫80和高濃度（1%）的BSA對SPase的活性具有一定的提升作用，這是由于BSA具有穩(wěn)定酶的作用，能有效地保護酶不被降解，從而促進了酶的活性。濃度為0.1%的BSA、丙三醇和山梨醇對酶活的影響不大；而0.1%的維生素C、SDS，1%的吐溫80、維生素C、SDS、丙三醇和山梨醇對酶活性有不同程度的抑制作用，這可能是由于其改變了酶的活性中心結構，導致了該酶的活性部分或全部喪失。其中，作為蛋白質變性劑的SDS抑制了90%以上的酶活性，因為SDS分子上的硫酸基團與蛋白質表面的氨基酸緊密結合，其分子上的烷基則與蛋白質的疏水部分緊密結合，從而使蛋白質變性失活。吐溫80屬于非離子型表面活性劑，在低濃度時與酶的疏水活性中心產生相互作用，有利于底物與酶的結合，從而促進酶的活性；在高濃度時吐溫80與酶的活性中心緊密結合，使底物無法進入到酶的活性中心，而無法催化其他化學反應，從而抑制了酶的活性[35]。

表4 化學試劑對重組SPase穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of chemical reagents on stability of recombinant SPase

另一方面，金屬離子在酶的催化反應過程中也均有重要的作用，可使底物直接結合到酶的活性部位,或者通過可逆地改變金屬離子的氧化態(tài)從而調節(jié)氧化還原反應，或者通過靜電穩(wěn)定及屏蔽負電荷等途徑參與酶的催化。國內外已有大量的研究表明，將金屬離子作為激活劑添加到在酶反應液中是一種改善酶活性或穩(wěn)定性的行之有效的方法[36?38]。如表5所示，1 mmol/L的Fe2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+均可以影響到SPase的穩(wěn)定性，經這些離子處理后的酶活均有不同程度的下降。而較高濃度（10 mmol/L）的Fe2+和Mg2+則對SPase的活性和穩(wěn)定性表現(xiàn)出較好的促進作用。

表5 金屬離子對重組SPase穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of metal ions on stability of recombinant SPase

3 結論

通過單因素實驗和正交試驗結果表明，雖然作為碳源的淀粉和無機離子K+和Mg2+對SPase的表達具有一定的促進作用，但三者的協(xié)同作用是重組SPase工程菌（E.coliBL21/pET30-SPase）高效表達SPase的優(yōu)選條件，可以在很大程度上提高SPase的表達效率。其中，在LB培養(yǎng)基的基礎上添加0.5%淀粉、0.1% K+和0.05% Mg2+的組合，可提高到3.6倍的表達效率。與現(xiàn)有的重組SPase表達優(yōu)化研究相比，該優(yōu)化方式提高目的蛋白表達的水平較高，在SPase的工業(yè)化生產上具有一定的實際應用價值。另外，通過一些適當濃度的表面活性劑如吐溫80，或一些金屬離子如Fe2+和Mg2+可以對重組SPase的活性起到一定的促進作用，對該酶的高效利用提供了理論依據(jù)，也為日后進一步研究該酶的性質奠定了基礎。但本試驗也存在不足之處，在粗酶液的制備過程中存在影響酶活的操作，如細胞破碎。因此，在日后的科研工作中，將對此類操作步驟進行優(yōu)化，以期進一步提高該酶的活性。