負載槲皮素的酶法糖基化酪蛋白復(fù)合納米粒子的性能研究

劉 堯，樊永康，吳曉琴，沈建福

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

槲皮素（Quercetin，Que）是一種天然的植物類黃酮素，廣泛存在于蔬菜、水果、茶葉和葡萄酒中[1?2]，其具有抗氧化、改善肥胖、抗炎、抑菌等多種功效[3?6]，但其難溶于水（溶解度約1 mg/L），生物利用度低，且在外界的高溫、光照等條件下不穩(wěn)定，易發(fā)生降解，其應(yīng)用受到較大限制[7]。本科研團隊在前期研究中利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶法糖基化修飾酪蛋白并制備糖基化復(fù)合納米粒子，實驗表明，酪蛋白、酪蛋白-殼寡糖納米粒子能夠有效包埋槲皮素并且提高其水溶性，是非常理想且具有發(fā)展前景的親脂性藥物納米載體[8]。

與常規(guī)制劑相比，納米粒子具有許多優(yōu)點。首先，通過調(diào)整其壁材的材料與配比，可實現(xiàn)藥物的緩釋和靶向釋放，并減少不良反應(yīng)[9?10]；其次，納米粒子的粒徑小、比表面積大且高度分散，能夠提高難溶性藥物的水溶性和溶出速率[11]；此外，納米粒子所形成的封閉環(huán)境，還能提升藥物的生物活性和穩(wěn)定性[12]。由于納米粒子具有較小的尺寸，進入消化道以后易被微絨毛捕獲并粘附到粘膜上，從而使其在體內(nèi)存留時間延長，促進消化吸收；且納米粒子的臨界聚集濃度較低，在循環(huán)系統(tǒng)中不會因為稀釋而破碎[13]?？紤]到納米粒子被人口服后，其在胃腸道系統(tǒng)中的穩(wěn)定性高，可以使被包封的藥物能更多地到達小腸等吸收部分，因此，研究負載槲皮素的酪蛋白-殼寡糖納米粒子的穩(wěn)定性及生物學(xué)性能顯得尤為重要。Chen等[14]制備了負載7, 8-二羥基黃酮的玉米醇溶蛋白/乳鐵蛋白納米粒子，體外模擬消化試驗表明二元納米粒子比一元玉米醇溶蛋白納米粒子更能夠提高7, 8-二羥基黃酮的抗消化性和生物可及度。

本科研團隊前期已經(jīng)成功構(gòu)建了負載Que的酪蛋白-殼寡糖納米粒子并對其相關(guān)理化指標(biāo)和結(jié)構(gòu)特性進行了表征[8]，本文將對Que納米粒子的貯藏穩(wěn)定性、體外抗消化性、生物可及度、抗氧化性以及對PC-3細胞的抑制效果進行系統(tǒng)探究，以期為拓展其應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胃蛋白酶（酶活：3000 U/g）、胰酶（酶活：3000 U/g）、槲皮素（Que，純度：99%）、酪蛋白（Cas，純度＞80%）

上海阿拉丁生化科技股份有限公司；殼寡糖（分子量＜2000 Da，脫乙酰度：90%） 浙江金殼藥業(yè)有限公司；空載納米粒子（n-Cas、n-Cas-Cos）粉末 實驗室自制；酪蛋白糖基化產(chǎn)物（Cas-Cos） 實驗室自制；雄激素非依賴性前列腺癌細胞（PC-3） 上海中科院細胞庫；胎牛血清 賽默飛世爾生物有限公司；0.25%胰蛋白酶溶液（1X） 吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；噻唑藍（MTT）、鏈霉素、青霉素 北京雷根生物技術(shù)有限公司；其余試劑 均為分析純。

Zetasizer Nano ZS-90納米粒徑電位分析儀 英國Malvern公司；SLHW-4四聯(lián)加熱數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機有限公司；PowerWaveHT微孔板分光光度計 美國BioTek公司；pHS25數(shù)顯pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QUINTIX65-1CN電子天平 賽多利斯有限公司；Forma 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技有限公司；HZ-8812S-B水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉華利達公司；H1850臺式高速離心機 湖南湘儀儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈安泰有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 負載槲皮素的酪蛋白-殼寡糖和酪蛋白納米粒子的制備 參考于鈺[15]的方法，并作適當(dāng)修改。分別配制濃度為4 g/L的Cas和Cas-Cos溶液，調(diào)溶液的pH為5.8。取一定量的10 g/L的Que乙醇溶液加入20 mL蛋白質(zhì)溶液中，使蛋白質(zhì)與Que的質(zhì)量比為40:1，磁力攪拌20 min除去乙醇，將溶液在200 W的超聲頻率下超聲處理6 min得到負載Que的納米粒子溶液，即酪蛋白-槲皮素納米粒子（n-Cas-Que）和酪蛋白-殼寡糖-槲皮素納米粒子（n-Cas-Cos-Que）。

1.2.2 槲皮素納米粒子的貯藏穩(wěn)定性研究

1.2.2.1 槲皮素紫外光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制濃度為30 μg/mL的Que乙酸乙酯溶液5 mL，取3 mL置于石英皿中，于波長300～450 nm處進行光譜掃描，得到光譜曲線，進行分析。分別配制濃度為2、4、6、8、10 μg/mL的Que乙酸乙酯溶液，測定其在369 nm處的吸光度值。以槲皮素的濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 貯藏穩(wěn)定性的測定 參考閔敏[16]的方法，并作適當(dāng)修改。分別取1.2.1中制得的n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que溶液各20 mL，將其分裝至試管中，密封，分別置于4 ℃避光、25 ℃下避光、25 ℃自然光下貯藏60 d，每隔10 d取出2 mL的納米粒子溶液，在10000 r/min下離心10 min，上清液用16 mL乙酸乙酯萃取，渦旋5 min使其充分混合，混合液8000 r/min離心5 min，分離得到乙酸乙酯相。萃取重復(fù)兩次，合并萃取液。將萃取液用乙酸乙酯適當(dāng)稀釋，測定369 nm處的吸光值，根據(jù)1.2.2.1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定納米粒子的槲皮素含量，按下式計算保留率，以保留率表征其貯藏穩(wěn)定性。采用同濃度同體積的槲皮素水溶液和乙醇溶液作為對照。

1.2.3 槲皮素納米粒子的體外抗消化性研究 參考馮進[17]的方法并進行適當(dāng)修改。

1.2.3.1 樣品的制備 分別制備n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que溶液各20 mL（其中蛋白質(zhì)的濃度為4 g/L，Que的濃度為100 μg/mL）。將2 mg的Que粉末分散于20 mL超純水中作為對照。

1.2.3.2 胃、腸液消化實驗 a.胃液消化：將胃蛋白酶、NaCl溶解于超純水中，胃蛋白酶的濃度為3.2 g/L，NaCl的濃度為150 mmol/L。將n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que和Que與等量的胃液混合（各20 mL），并調(diào)pH至2.0。將混合溶液置于37 ℃搖床中，100 r/min轉(zhuǎn)速下孵育60 min，孵育時間達到60 min時，將pH調(diào)至7.0以終止反應(yīng)。

b.腸液消化：腸液中包含0.3 g/L的CaCl2、30.72 mmol/L NaCl、5 g/L膽汁鹽以及8 g/L的胰酶。取20 mL胃液消化60 min后的溶液與等體積的腸液混合，然后將混合溶液的pH調(diào)至7.0。將混合溶液置于37 ℃搖床中，100 r/min轉(zhuǎn)速下孵育120 min。

在胃-腸液的消化過程中，每隔30 min（即0、30、60、90、120、150、180 min）取出2 mL的消化液測定其粒徑（DZ）、分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位（Zetapotential）。

1.2.4 槲皮素生物可及度的研究 參考馮進[17]的方法，并作適當(dāng)修改。取10 mL1.2.3.2中消化180 min后的樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，并在4 ℃，10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心60 min。樣品離心后一般被分為兩層，上層為負載Que的透明膠束層，下層為未消化的樣品形成的致密不溶物質(zhì)。分別取2 mL消化180 min后的樣品和2 mL透明膠束層溶液檢測Que的質(zhì)量（方法參考1.2.2.2）。Que的生物可及度用以下公式計算：

式中：Wdigesta為腸液消化后樣品中Que的質(zhì)量；Wnanoparticles為膠束層中Que的質(zhì)量。

1.2.5 槲皮素納米粒子的抗氧化性研究 參考劉夫國[18]的方法，并作適當(dāng)修改。

1.2.5.1 樣品溶液的配制 制備n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que溶液各20 mL，分別加入到兩個培養(yǎng)皿中，-35 ℃下冷凍12 h，然后放入真空冷凍干燥機中凍干，得n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que粉末。用超純水配制蛋白質(zhì)濃度為0.5 g/L的n-Cas、n-Cas-Cos、n-Cas-Que（其中Que的濃度為12.5 μg/mL）和n-Cas-Cos-Que（其中Que的濃度為12.5 μg/mL）各5 mL；分別用超純水和無水乙醇配制濃度為12.5 μg/mL Que溶液各5 mL；用超純水配制濃度為0.5 g/L的Cos溶液5 mL。以無樣品的超純水作為空白對照。

1.2.5.2 DPPH自由基清除實驗 用無水乙醇配制1.75×10?4mol/L的DPPH溶液，上述配制的樣品溶液各取100 μL加入到2 mL DPPH乙醇溶液中，室溫避光反應(yīng)60 min，隨后檢測其在517 nm處的吸光值，每個樣品重復(fù)3次測定，按下式計算自由基清除率。

1.2.5.3 ABTS自由基清除實驗 取7 mmol/L的ABTS水溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，避光反應(yīng)12 h以上。實驗前用甲醇將ABTS儲備液稀釋至734 nm處吸光值為0.7±0.02。上述配制的樣品溶液各取100 μL加入到2 mL ABTS溶液中，振蕩20 s，反應(yīng)6 min，在734 nm波長處測定其吸光值，每個樣品重復(fù)3次測定，按下式計算自由基清除率。

其中：A1為DPPH或ABTS空白對照的吸光值，At為反應(yīng)60/6 min后樣品溶液的吸光值，B為樣品空白的吸光值。

1.2.6 槲皮素納米粒子對人前列腺癌PC-3細胞抑制效果的研究

1.2.6.1n-Cas、Cos、n-Cas-Cos樣品儲備液的配制在99.5 mL的DME/F12細胞培養(yǎng)基中加入0.5 mL的二甲基亞砜（DMSO）溶液，成為濃度為0.5%的DMSO溶液。用此溶液配制濃度分別為400、800、1600、2400、3200 μg/mL的三種儲備液（其中n-Cas和n-Cas-Cos以蛋白質(zhì)濃度計），每種濃度的儲備液各20 mL（細胞實驗中所用的50 mL離心管經(jīng)過高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min）。

1.2.6.2 Que、n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que樣品儲備液的配制 制備n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que溶液各20 mL，分別加入到兩個培養(yǎng)皿中，?35 ℃下冷凍12 h，然后放入真空冷凍干燥機中凍干，得n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que粉末。在99.5 mL的DME/F12細胞培養(yǎng)基中加入0.5 mL的DMSO溶液，成為濃度為0.5%的DMSO溶液。利用此溶液配制槲皮素濃度分別為10、20、40、60、80 μg/mL的三種儲備液（其中負載槲皮素的蛋白質(zhì)濃度與n-Cas、n-Cas-Cos儲備液的蛋白質(zhì)濃度相同，均為400～3200 μg/mL）。

1.2.6.3 不同樣品對人前列腺癌PC-3細胞抑制效果的影響 參考趙波[19]的方法，并作適當(dāng)改動。取對數(shù)生長期的PC-3細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液150 μL，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，以每孔200 μL細胞懸液接種于96孔板中，最邊緣孔用PBS代替，待上述96孔板中的細胞培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基，加入200 μL不同濃度的樣品儲備液，每組設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，以不含樣品，含0.5%DMSO的培養(yǎng)基為空白對照。在測定前4 h加入含有10% MTT溶液的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，置于搖床上振蕩10 min，最后置于570 nm處測定吸光值，計算細胞存活率。

式中: A2為實驗組吸光值，A1為空白對照組吸光值，AZ為空白孔的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)使用Origin 2018繪制相關(guān)圖表，使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA）。每次測試前需更換樣品，且每組實驗均重復(fù)3次，實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素納米粒子的貯藏穩(wěn)定性分析

本實驗研究了不同條件下游離的Que水溶液、乙醇溶液以及負載Que的兩種納米粒子的貯藏穩(wěn)定性。四種Que溶液體系的保留率如圖 1所示。

圖1 不同貯藏條件對槲皮素保留率的影響Fig.1 Effects of different storage conditions on the retention rate of quercetin

Que的紫外光譜曲線如圖 1a所示，槲皮素在369 nm處的紫外吸光度值最高。因此，選取369 nm作為Que乙酸乙酯溶液的最大吸收波長。槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1b所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合效果良好。

圖1A中，4種體系在4 ℃下避光貯存60 d后，n-Cas-Cos-Que中Que的保留率為91.30%；而圖 1B顯示，在25 ℃下避光貯存60 d后，n-Cas-Cos-Que中Que的保留率為79.25%。游麗君等[20]利用熱誘導(dǎo)法制備酪蛋白-槲皮素納米粒子，在4 ℃避光條件下貯藏30 d后，Que的保留率為75.38%。表明酶法糖基化能提高酪蛋白對Que的保護效果。圖 1C中，在自然光照下貯存60 d后，Que的水溶液、乙醇溶液兩種體系中Que的保留率幾乎為0，而n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que的保留率分別為22.18%和34.33%。這表明了納米載體能夠減緩Que的降解，且n-Cas-Cos-Que的雙層結(jié)構(gòu)對Que有更好的保護效果。

結(jié)合圖 1A和B可得出，貯存溫度升高后，n-Cas-Cos-Que中Que的保留率有所下降，而其它3種溶液體系也表現(xiàn)出相似的降低趨勢。這表明貯存溫度的升高會減弱納米粒子對Que的保護效果。此外，在兩種條件下，n-Cas-Cos-Que中Que的保留率均高于其它3種體系，這表明n-Cas-Cos-Que能夠更加有效地保護Que，減少外界條件對Que的損害。

結(jié)合圖 1B和C，可以看出在光照條件下n-Cas-Cos-Que中Que的保留率明顯下降，從79.25%下降至34.33%，其它3種體系也表現(xiàn)出相似的降低趨勢。這表明光照會加速Q(mào)ue的降解。

2.2 槲皮素納米粒子的體外抗消化性分析

在體外模擬胃腸道消化中，兩種Que納米粒子的DZ、Zeta-potential和PDI如圖 2所示。

在0～60 min模擬胃液階段，n-Cas-Que的DZ呈現(xiàn)出迅速增大的趨勢，從169.1 nm迅速增加到2854.2 nm（圖 2A）；Zeta-potential從14.5 mV降低到8.95 mV（圖 2B）；PDI從0.217增加到0.859（圖 2C）；此時納米粒子溶液中出現(xiàn)了絮狀沉淀。其原因可能是n-Cas-Que經(jīng)過胃液水解后，胃液中的鹽離子屏蔽了蛋白質(zhì)表面電荷，使蛋白質(zhì)表面電荷量降低，分子間靜電斥力降低，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。同時，胃液中胃蛋白酶會促使蛋白質(zhì)之間的發(fā)生架橋絮凝或排斥絮凝[21?23]。溶液的PDI迅速增大，表明溶液中納米顆粒分布不均一。而對于n-Cas-Cos-Que，其粒徑從0 min時的125.6 nm增加到60 min時的1073 nm（圖 2A）；Zeta-potential從14.96 mV降低到10.06 mV（圖 2B）；PDI從0.161增加到0.804（圖 2C）；納米粒子溶液中未出現(xiàn)明顯絮狀沉淀。這表明，n-Cas-Cos-Que納米粒子經(jīng)過胃液消化之后，同樣出現(xiàn)DZ增加、Zeta-potential降低等現(xiàn)象，但n-Cas-Cos-Que納米粒子在胃液消化過程中的粒徑增加幅度要遠小于n-Cas-Que納米粒子。其原因可能是Cas經(jīng)過糖基化后，其二級結(jié)構(gòu)變得更加有序，不容易被胃蛋白酶水解[24]，蛋白質(zhì)在經(jīng)過胃蛋白酶消化過程中，首先會消化Cos外殼，這延緩了蛋白質(zhì)被消化聚集。以上結(jié)果表明n-Cas-Cos-Que在胃液中有較好的抗消化效果。

圖2 體外消化過程中納米粒子的平均粒徑（A）、Zeta電勢（B）、PDI（C）的變化Fig.2 Changes in average particle size(A), Zeta potential(B),and PDI(C) during in vitro digestion

在60～180 min之 間，n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que進入腸液消化階段。對于n-Cas-Que，其DZ從2854.2 nm減小到423.6 nm（圖 2A）；Zeta-potential從8.95 mV變 化 到?13.76 mV（圖 2B）；PDI從0.859減小到0.436（圖 2C）；納米粒子溶液無絮狀沉淀。這表明n-Cas-Que經(jīng)過腸液消化之后，其在胃液中形成的聚集體發(fā)生解離，使溶液的粒徑減小。Zeta-potential從正值變到負值，且電位的絕對值增大，這是因為腸液的pH高于蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)在高于其等電點的溶液中帶負電。另外，pH和腸液中的離子強度增強了蛋白質(zhì)的電荷量，使其分子間靜電排斥增強，從而提高了穩(wěn)定性[25]。對于n-Cas-Cos-Que，其DZ在腸液中呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，從1073 nm增加到2919 nm再減小到392.7 nm（圖 2A）；Zeta-potential從10.06 mV變化到?16.93 mV（圖 2B）；PDI從0.804減小到0.431（圖 2C）；無明顯絮狀沉淀產(chǎn)生。這表明Cas-Cos在胰酶的作用下繼續(xù)被消化而發(fā)生聚集，使其粒徑變大，在一段時間的腸液繼續(xù)消化后，n-Cas-Cos-Que粒徑呈現(xiàn)出降低的趨勢，這表明聚集體發(fā)生解離。另外由于腸液中存在著CaCl2、NaCl等鹽，其中的離子會對蛋白質(zhì)電荷起到一定屏蔽的作用。但總的來看，腸液消化后，蛋白質(zhì)所帶的電荷量要高于胃液消化后所帶的電荷量。腸液消化后兩種納米粒子的粒徑電荷量相似，這可能是納米顆粒經(jīng)過腸液消化后，溶液中的組成相似，包括少量的未消化樣品、混合膠束、膽汁鹽和析出的Que、鈣皂等[26]。

2.3 槲皮素納米粒子的生物可及度分析

通過體外模擬消化對Que、n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que的生物可及度進行評價。生物可及度是指消化后，活性物質(zhì)從食物基質(zhì)中釋放并溶解在消化液中，可以被小腸吸收的部分占其在消化液中總量的比例[21]。不同樣品的生物可及度如表 1所示。如表 1所示，游離的槲皮素分散在水中處于結(jié)晶狀態(tài)，其溶解度較低，經(jīng)過胃腸道消化后，其生物可及度為10.13%。這種結(jié)果的原因可能是腸液中存在的膽汁鹽，使Que轉(zhuǎn)移至混合膠束中，提高了Que的溶解度。但是，Que經(jīng)過納米粒子包埋后，其水溶性增加，使n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que的生物可及度可分別達到27.65%、48.91%，與Que相比，分別增加了1.72倍和3.83倍。同時，Cas和Cas-Cos在經(jīng)過胃蛋白酶和胰酶水解后，產(chǎn)生部分肽類，這些肽類可以與游離的Que相結(jié)合，進一步提高其在水中的溶解度，從而增加其生物可及度。另外，n-Cas-Cos-Que的生物可及度顯著高于n-Cas-Que（P＜0.05），其原因可能一方面是糖基化作用使得復(fù)合納米粒子在消化系統(tǒng)中更加穩(wěn)定，納米粒子的非晶體態(tài)促進結(jié)晶Que在膠束化過程中的溶解度[27]；另一方面，在胃腸道酶的水解過程中，糖基化接入的Cos也能夠結(jié)合游離的Que，從而提高其溶解度[21]。Francisco等[28]利用玉米醇溶蛋白納米粒子包埋Que，使Que的體外生物可及度提升了1.6倍。綜上，n-Cas-Que能顯著提高Que的生物可及度，且n-Cas-Cos-Que的提升效果要優(yōu)于n-Cas-Que。

表1 不同樣品的生物可及度Table 1 Bioaccessibility of different samples

2.4 槲皮素納米粒子的抗氧化性能分析

Que具有抗氧化性，其抗氧化作用取決于其酚羥基，其中Que A環(huán)上的5-OH和7-OH及B環(huán)上的3'-OH和4'-OH是主要的抗氧化基團。有前人研究表明，多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其抗氧化活性降低[29]。本研究采用DPPH和ABTS法來評價不同溶液體系的抗氧化性。

如表 2所示，在本實驗條件下，Cos、n-Cas和n-Cas-Cos對DPPH的清除率分別為56.8%、6.27%、11.98%，這表明Cas經(jīng)過糖基化后，其抗氧化性提高，其原因可能Cos共價接入Cas后，產(chǎn)生協(xié)同作用，使Cas-Cos的抗氧化性增強。如表 3所示，槲皮素水溶液、槲皮素醇溶液（Que-乙醇）、n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que對DPPH的清除率分別為18.83%、65.26%、53.82%、58.71%，ABTS自由基活性清除結(jié)果與DPPH清除結(jié)果有著相似的趨勢。從這樣的結(jié)果可以看出，Que水溶液對DPPH的清除效果較差，其原因可能是槲皮素在水溶液中溶解度低，處于結(jié)晶態(tài)，不能與自由基進行有效接觸，所以其抗氧化性遠小于Que乙醇溶液。而Que經(jīng)過Cas和Cas-Cos包埋之后，其水溶性增加，抗氧化性也大大提升，但低于溶解在無水乙醇中的Que溶液，其原因可能是Que中的活性基團與蛋白質(zhì)分子間的形成氫鍵，對活性基團產(chǎn)生一定的屏蔽效果[30]。

表2 3種原材料的DPPH和ABTS自由基清除能力Table 2 DPPH and ABTS free radical scavenging ability of the three raw materials

表3 不同納米粒子的DPPH和ABTS自由基清除能力Table 3 DPPH and ABTS free radical scavenging ability of different nanoparticles

2.5 槲皮素納米粒子對人前列腺癌PC-3細胞抑制效果的研究

很多研究報道，Que具有很多生物學(xué)功效，其中最重要的是抗癌活性。槲皮素能夠抑制多種癌細胞，包括肺癌細胞、胰腺癌細胞、乳腺癌細胞的增殖，并表現(xiàn)出誘導(dǎo)其凋亡的作用[31?33]。為了考察槲皮素納米粒子的抗癌活性，本研究采用經(jīng)典的MTT法、以細胞存活率來評價納米粒子對PC-3細胞的抑制效果。

圖3A研究了不同濃度的n-Cas、Cos、n-Cas-Cos溶液對PC-3細胞的抑制效果。由圖可知，隨著濃度的升高，三種樣品對PC-3細胞的生長有一定的促進作用。其原因可能是Cas和Cos為PC-3細胞的增殖提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)[34]。

圖3B研究了不同濃度的Que溶液對PC-3細胞的抑制效果。從圖中可以看出，隨著Que濃度的增加，Que、n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que對PC-3細胞的抑制效果逐漸增強。當(dāng)Que的濃度達到80 μg/mL，三種Que體系處理PC-3細胞后的存活率分別為73.25%、56.84%、49.88%（P＜0.05）。這表明Que經(jīng)過Cas、Cas-Cos包埋之后，能提高其對PC-3細胞的抑制效果。其原因可能是納米粒子提高了Que的水溶性，改善其所處的微環(huán)境，使其有更多的有效活性基團與PC-3細胞接觸。這一結(jié)果也與前人的研究結(jié)論相符[29]。另外，n-Cas-Cos-Que對Que有更高的包埋率，能夠包埋更多的Que，使更多的Que活性基團與PC-3接觸，這也可能是n-Cas-Cos-Que對PC-3抑制效果更好的原因。

圖3 原材料（A）納米粒子（B）對PC-3細胞的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of raw materials (A)nanoparticles (B) on PC-3 cells

3 結(jié)論

本文主要探究了n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que兩種納米粒子的貯藏穩(wěn)定性、體外抗消化性、生物可及度、抗氧化性及對PC-3細胞的抑制效果。兩種納米粒子均表現(xiàn)出較好的貯藏穩(wěn)定性。在4 ℃避光和25 ℃避光和25 ℃自然光照射條件下分別貯藏60 d，兩種納米粒子的保留率分別為80.78%、91.30%；66.87%、79.25%；22.18%、34.33%。這表明與Que水溶液和醇溶液相比，n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que能夠?qū)ue起到很好的保護效果，且n-Cas-Cos-Que的保護效果更好。體外模擬胃腸道消化結(jié)果表明，n-Cas-Cos-Que比n-Cas-Que具有更好的抗消化性和更高的生物可及度。在體外模擬消化180 min后，Que水溶液以及n-Cas-Que和n-Cas-Cos-Que兩種納米粒子的生物可及度分別為10.13%、27.65%和48.91%。DPPH和ABTS的清除實驗顯示Que經(jīng)過Cas和Cas-Cos包埋后，其抗氧化能力大大提升，n-Cas-Cos-Que、n-Cas-Que對DPPH和ABTS的清除率分別為58.71%、53.82%和56.98%、48.34%。體外抑制PC-3細胞試驗的結(jié)果表明，n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que兩種納米粒子對PC-3細胞的抑制作用具有濃度依賴性，且與Que和n-Cas-Que相比，n-Cas-Cos-Que納米粒子對PC-3細胞有更好的抑制效果。

本實驗證實負載槲皮素的酶法糖基化酪蛋白納米粒子（n-Cas-Cos-Que）能夠有效保護Que，降低外部條件對Que的損害并減緩Que的降解，提高其生物可及度、抗氧化性和抗癌活性，進一步拓寬了其在醫(yī)藥及功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用。在今后的研究中，可探究n-Cas-Cos-Que在細胞水平上的生物學(xué)性能，并利用不同方法的糖基化（如美拉德反應(yīng)糖基化）與本文方法作對比，比較不同方法的糖基化酪蛋白納米粒子對槲皮素的保護效果，并探究其性能，以期將槲皮素應(yīng)用到更廣泛的領(lǐng)域。