野生牛大力子葉誘導(dǎo)愈傷組織方法初探

周如鹍，方利娟，龐月蘭

（1 廣西壯族自治區(qū)茶葉科學(xué)研究所，廣西桂林 541004 2 百色學(xué)院，廣西百色 533000）

牛大力，又叫牛古大力、山蓮藕、豬腳笠，因其主要以塊莖為藥為食，所以又叫大力薯。牛大力屬于豆科（Leguminosae）崖豆藤屬（Millettia Wight et Arn.），美麗崖豆藤（Millettia specisoa Champ），其性味甘、平，具有潤肺、補虛、強筋活絡(luò)的功用，臨床醫(yī)學(xué)研究表明：牛大力對腰肌勞損、慢性支氣管炎、肺結(jié)核、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病有不錯的療效[1]。研究表明：牛大力含有大量的三萜類、木質(zhì)素類、黃酮類、多糖類物質(zhì)[2]，其中異甘草素、芒柄花素、高麗槐素[3]等黃酮類成分含量較高，在此之前高麗槐素已經(jīng)被證實具有抗菌、抗寄生蟲、抗癌等功效[4]。膳食方面：塊莖富含淀粉、蛋白質(zhì)及生物堿，牛大力塊莖中還富含微量元素，如鋅、鐵、鈣、錳、鎂、銅等，這些元素對人體新陳代謝有重要作用，可參與機體內(nèi)酶、血紅蛋白的合成，增強人體造血能力[5]。

野生牛大力具有很高的藥用、膳食保健價值，市場對野牛大力需求日益增大，野生牛大力供不應(yīng)求，隨之而來的是人們對野生牛大力的過度采挖，造成野生牛大力數(shù)量急劇減少，嚴(yán)重影響野生牛大力資源可持續(xù)利用。為滿足人們對牛大力的需求，引導(dǎo)群眾通過人工栽培提高牛大力產(chǎn)量，增加山區(qū)人民的經(jīng)濟收入，避免野生牛大力受人為過度破壞，保障牛大力野生資源的可持續(xù)利用，利用野生牛大力資源進行人工繁殖已刻不容緩。目前，牛大力主要靠種子繁殖方法，其繁殖系數(shù)低、生長慢，品種退化，病毒傳染嚴(yán)重，進行牛大力組織培養(yǎng)技術(shù)的研究有助于解決這些問題。

國內(nèi)外研究者對牛大力進行了大量的組培研究。消毒方面：張桂琴和黃雪娟[6]以牛大力嫩枝為外植體，用70%酒精和0.1%升汞滴加吐溫進行消毒，消毒結(jié)果污染率最低為20%，最高為90%，褐化率最低為40%，最高為95%；時群等[7]以嫩莖為外植體進行表面消毒，采用0.1%的HgCl2溶液，同時添加1 滴吐溫-80 進行5 min 滅菌后，添加50 mg/L 的頭孢唑林鈉溶液進行浸泡，時間為10 s，無菌水沖洗后接種到添加10 mg/L 頭孢唑林鈉的MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，牛大力外植體污染率20%。愈傷組織誘導(dǎo)方面：黃碧蘭等[8]研究者以牛大力嫩莖為外植體，以MS+1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LIBA 作為啟動培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率高達100%，生根率達到80%；潘穎南等[9]研究者以牛大力嫩莖為外植體，再以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加濃度為2.0、2.5 mg/L 的6-BA 和0～2.5 mg/L 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)率達58.3%。國內(nèi)外研究者多以嫩莖和嫩葉片為外植體進行消毒和愈傷組織誘導(dǎo)研究，由于嫩莖和嫩葉片表面被有大量短絨毛，與外界直接接觸附著大量的病菌，消毒困難，污染率較高[7]。牛大力果實有一層厚豆莢殼包裹，避免種子與外界接觸，種子子葉有種皮包裹，極大保障子葉不受外界感染，本試驗在總結(jié)前人對外植體、消毒方法、誘導(dǎo)激素[10-11]的選用經(jīng)驗基礎(chǔ)上，嘗試?yán)靡吧４罅ψ尤~片誘導(dǎo)愈傷組織，探索可靠的外植體消毒及愈傷組織誘導(dǎo)方案，建立野生牛大力快速繁殖技術(shù)體系，以期為野生牛大力資源可持續(xù)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用野生牛大力種子取自廣西欽州市十萬大山，摘取成熟飽滿的野生牛大力豆莢曬干備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒試驗。本試驗參考前人對子葉類外植體的消毒研究，采用無菌水浸泡4 h，將種子子葉泡剝開種皮得到子葉片，采用75%酒精和HgCl2搭配使用進行消毒，先統(tǒng)一用75%酒精對子葉消毒15 s，結(jié)合不同濃度梯度（0.1%、0.2%、0.3%）HgCl2浸泡不同時間梯度（5 min、8 min、10 min）組合得到9 個消毒處理（A1～A9），每個消毒環(huán)節(jié)均用無菌水浸洗3 次，然后將子葉片切成0.5cm×0.5cm 的塊狀外植體接種到無菌MS 培養(yǎng)基中，每個消毒處理6 瓶，每瓶接種4 塊外植體，置于無菌環(huán)境下培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計外植體污染及成活數(shù)量。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)試驗。本試驗嘗試以MS 為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度6-BA、2，4-D、NAA 設(shè)置2 個愈傷組織誘導(dǎo)方案，方案1：MS+6-BA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L）+NAA（1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L）；方案2：MS+6-BA（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L）+2，4-D（1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L），每個方案分12 個配方，每個配方6 瓶。配方如下表：

表1 愈傷組織誘導(dǎo)方案1（MS+6-BA+NAA）

表2 愈傷組織誘導(dǎo)方案2（MS+6-BA+2，4-D）

分析1.2.1 試驗結(jié)果，獲得可靠消毒方案對外植體進行消毒，并接種到方案1 和方案2 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)瓶接種外植體4 個，每個誘導(dǎo)配方共接種24 個外植體，放置無菌環(huán)境下培養(yǎng)，保持光照16 h/d，溫度22～25 ℃。培養(yǎng)過程中觀察外植體是否受到細菌性污染，觀察每個配方外植體誘導(dǎo)愈傷組織始愈時間、愈傷組織數(shù)量、愈傷組織色澤、質(zhì)地疏密度以及愈傷化程度并作記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對外植體表面消毒效果的影響

本次消毒試驗9 個方案在75%酒精消毒時間及HgCl2消毒時間相同情況下，HgCl2濃度越高，污染率越低，成活率呈下降趨勢，其中A1、A4、A7方案相比較污染率由12.5%下降至4.2%趨平，A1、A4成活率為87.5%，處于良好水平，A7下降至79.2%；A2、A5、A8方案相比較，A2、A5污染率為4.2%，A8下降至0；A2成活率最高，達95.8%，A5降至83.3%，A8降至66.7%；A3、A6、A9方案相比較，A3污染率為4.2%，A6及A8均降至0，污染率大大降低；A3成活率91.6%，A6、A9降至較低水平75.0%、54.2%。

9 個處理總體表現(xiàn)為消毒時間越長，污染率越低，成活率越低，HgCl2濃度越高，污染率越低，成活率越低，綜合分析得出，A2為最優(yōu)消毒方案，即外植體經(jīng)75%酒精消毒15 s、0.1%HgCl2消毒8 min 后接種污染率控制在4.2%的較低水平，成活可達95.8%。

表3 不同處理對外植體表面消毒效果的影響

2.2 方案1（MS+6-BA+NAA）愈傷組織誘導(dǎo)效果分析

2.2.1 愈傷組織生長態(tài)勢分析。由表4 可見，外植體培養(yǎng)7d 后配方B1和配方B3各出現(xiàn)褐色乳狀染菌1 瓶，配方B2和配方B9各出現(xiàn)黑色絲狀染菌1 瓶，配方B5、B7、B12各出現(xiàn)白色絲狀染菌1 瓶，繼續(xù)培養(yǎng)觀察其他外植體不再出現(xiàn)新的污染。外植體培養(yǎng)至7d 時各配方均長出愈傷組織，各配方始愈情況：B1、B5始愈時間為4d，B10、B12始愈時間為5d，B2、B4、B7、B9、B11始愈時間為6d，B3、B6、B8始愈時間7d，培養(yǎng)至30d 出愈數(shù)接近穩(wěn)定，愈傷組織大小未定型，40d 出愈數(shù)固定，愈傷組織大小定型。

表4 不同濃度6-BA 和NAA 對愈傷組織生長的影響

由顏色可見，配方B1、B3、B5、B10、B12色澤最好，配方B2、B8、B9色澤次之，配方B4、B6、B7、B8、B11色澤最差；由疏密度可見，配方B1、B5、B6、B8、B10、B12疏松度最好，有利細胞增殖，如配方B10中的愈傷組織（圖6）色澤為淺綠色，質(zhì)地疏松，生長態(tài)勢較好，配方B2、B3、B9疏密度次之，配方B4過于緊密，細胞增殖空間小，效果較差，配方B7、B11過于松散細胞團容易散落，不利于愈傷組織生長，效果較差，如配方B6中牛大力愈傷組織（圖7）色澤偏黃，質(zhì)地松散，生命力弱。綜合分析得出，愈傷組織生長效果：配方B1、B5、B10、B12效果較好，配方B2、B3、B8、B9次之，配方B4、B6、B7、B11較差。

圖6 配方B10 愈傷組織

圖7 配方B6 愈傷組織

2.2.2 愈傷組織成活率、誘導(dǎo)率及出愈率分析。由表5可見，經(jīng)過40d 培養(yǎng)誘導(dǎo)出穩(wěn)定的愈傷組織，12 個配方的成活率平均值為67.0%，最高值為配方B3（MS+1.5 mg/L6-BA+1.0 mg/LNAA），達到95.8%，最低值為配方B7和配方B11，僅為37.5%；誘導(dǎo)率平均值為50.0%，最高值為配方B3（MS+1.5 mg/L6-BA+1.0 mg/LNAA）和配方B10（MS+1.0 mg/L6-BA+3.0 mg/LNAA），均 達 到79.2%，最低值為配方B7，僅為20.8%；出愈率的平均值為72.1%，最高值為配方B1（MS+0.5 mg/L6-BA+1.0 mg/LNAA），達到89.5%，最低值為配方B7（MS+1.5 mg/L6-BA+2.0 mg/LNAA），僅為45.5%。優(yōu)良的配方誘導(dǎo)效果應(yīng)是出愈率、成活率、誘導(dǎo)率均較高，出愈時間早，愈傷組織生長態(tài)勢應(yīng)是色澤綠，愈傷化程度高，質(zhì)地有一定的疏松度且生長旺盛。比較分析得出愈傷組織生長效果：配方B1、B5、B10、B12效果較好，配方B2、B3、B8、B9次之，綜合分析方案1 得出：野生牛大力子葉誘導(dǎo)愈傷組織最優(yōu)配方為B10：MS+1.0mg/L，6-BA+3.0 mg/L NAA。

表5 不同濃度6-BA 和NAA 對愈傷組織成活率、誘導(dǎo)率和出愈率的影響

2.3 方案2（MS+6-BA+NAA）愈傷組織誘導(dǎo)效果分析

2.3.1 愈傷組織生長態(tài)勢分析。由表6 可見，外植體培養(yǎng)7d 后配方C1出現(xiàn)白色乳狀染菌1 瓶，配方C3出現(xiàn)淡黃色及白色乳狀染菌兩瓶，配方C6出現(xiàn)褐色粉狀染菌1 瓶，配方C10和配方C11出現(xiàn)白色乳狀染菌各1 瓶，配方C12出現(xiàn)白色絲狀染菌1 瓶。外植體培養(yǎng)至7d 時，各配方均已長出愈傷組織，30d 時出愈數(shù)接近穩(wěn)定，愈傷組織大小未定型，40d 時出愈數(shù)固定，愈傷組織大小定型。間隙小不利于增殖效果差。

表6 不同濃度6-BA 和2，4-D 對愈傷組織生長的影響

由始愈時間可見各配方出愈時間較相近，均在3～6d，最快的是配方C4，培養(yǎng)4d 開始長出愈傷組織，最慢的是配方C9、C10，需要6d，其他均為4d 或5d 出愈時間較為相近；由顏色可見配方C1、C2、C4、C5、C8、C10誘導(dǎo)出來的愈傷組織色澤顯淺綠色，色澤最好，配方C3、C7、C11培養(yǎng)出來的愈傷組織顏色顯黃綠色，色澤次之，配方C3、C6、C9、C12的愈傷組織色澤偏差，顯黃色；由疏密度可見配方C1、C2、C3、C5、C8、C10疏松度最好，細胞間隙充足不松散，利于細胞持續(xù)增殖，配方C4、C7、C11疏密度次之，有一定的增殖空間，但緊密度較高，影響增殖效果，配方C6則過于緊密，細胞間隙小，沒有足夠空間給內(nèi)部細胞增殖，效果較差，配方C7、C11過于松散，愈傷組織容易散落，不利于細胞增殖，效果較差；由愈傷化程度可見配方C1、C2、C4、C5、C8、C10、C11分化效果最好，總體分化程度大于3/4，配方C3、C6、C7、C9、C12風(fēng)化效果較差，沒有超過1/2。比較分析可得：配方C1、C4、C8、C11愈傷組織生長效果最好，如配方C4中的愈傷組織生長色澤淺綠，質(zhì)地疏松，愈傷完全，生命力旺盛，是優(yōu)質(zhì)的愈傷組織；配方C2、C5、C10次之，配方C3、C6、C7、C9、C12愈傷組織生長狀況較差，如配方C9，其愈傷組織色澤偏黃偏暗，質(zhì)地偏散，愈傷化程度低，生長態(tài)勢較差。

2.3.2 愈傷組織成活率、誘導(dǎo)率及出愈率分析。由表7可見，方案2 誘導(dǎo)試驗中配方C4、C8成活率最高，達到100%，其次是配方C5，成活率為95.8%，最低為配方C3，其成活率為66.7%，總體平均值為84.4%；由誘導(dǎo)率可見配方C4、C10誘導(dǎo)率較高，超過90%，誘導(dǎo)率最低的是配方C3，其誘導(dǎo)率過低是受到污染率過高的影響，出現(xiàn)出愈率高但是誘導(dǎo)率偏低的現(xiàn)象，總體誘導(dǎo)率平均值為73.3%，誘導(dǎo)率處于中上水平；由出愈率可見配方C1、C4、C8、C10、C11出愈率較高，均超過90%，出愈率最低為78.9%，總體出愈平均值為86.4%，出愈效果較優(yōu)。比較分析得出：配方C1、C4、C8、C11愈傷組織生長效果最好，配方C2、C5、C10次之，配方C3、C6、C7、C9、C12愈傷組織生長狀況較差；配方C1、C4、C8、C11愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，其中配方C4誘導(dǎo)愈傷組織出愈時間最早，僅為3d，色澤淺綠，愈傷組織疏松度較好，愈傷化接近100%，其外植體率，誘導(dǎo)率，出愈率高于95%，誘導(dǎo)效果最好，綜合分析方案2 得出野生牛大力子葉誘導(dǎo)愈傷組織最優(yōu)配方為C4：MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D。

表7 不同濃度6-BA 和2，4-D 對愈傷組織成活率、誘導(dǎo)率和出愈率的影響

3 討論與結(jié)語

本試驗在以野生牛大力子葉作外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)試驗中，消毒試驗污染率低于10%，平均成活率為84.4%，污染率比用嫩莖消毒20%左右的污染率降低10%[7]，成活率較以嫩莖為外植體高，表明子葉是誘導(dǎo)愈傷組織較可靠的外植體。

在外植體消毒方案優(yōu)選中，綜合污染率和成活率分析得出A2為最優(yōu)消毒方案，即通過75%酒精消毒15 s，再用0.1%HgCl2消毒8 min，獲得的外植體成活率達95.8%，屬于較高水平，污染率4.2%，屬于較低水平，可用作野生牛大力子葉誘導(dǎo)愈傷組織試驗消毒方案，但本試驗僅以HgCl2作為主要消毒藥品，并未采用其他消毒藥品進行比較試驗，為牛大力子葉外植體消毒提供更多選擇，這是本次消毒試驗的不足之處。

愈傷組織的特點是色澤綠，疏密度適中，生長快，生命力旺盛，愈傷化程度越高，誘導(dǎo)效果越好，愈傷組織疏密程度對下一步進行試驗探究非常重要，愈傷組織質(zhì)地較密時有利于進行芽和根的誘導(dǎo)，愈傷組織松散時有利于進行懸浮培養(yǎng)，而質(zhì)地適度疏松有利于進行愈傷組織的擴大繁殖，在選擇最優(yōu)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)劑配方時，需要綜合考慮愈傷組織的色澤、疏密度、愈傷化程度、污染率、成活率、出愈率，其中出愈數(shù)和成活數(shù)的比值，最能判斷愈傷組織的誘導(dǎo)效果好差，誘導(dǎo)率則受到外植體污染和死亡的影響，因為誘導(dǎo)率將外植體污染死亡數(shù)算作有效因素，而污染因素很多，外植體本身攜帶，培養(yǎng)基滅菌不徹底，人為操作不當(dāng)?shù)?。本試? 個愈傷組織誘導(dǎo)方案均分別得出最優(yōu)配方，即B10：MS+1.0 mg/L 6-BA+3.0mg/LNAA，C4：MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L2，4-D，綜合比較2 個配方的各個參數(shù)，方案1 配方B10始愈時間、色澤、疏松度、愈傷化程度、成活率、誘導(dǎo)率、出愈率等數(shù)據(jù)總體低于方案2 配方C4，在以牛大力子葉做外植體誘導(dǎo)愈傷組織生產(chǎn)中可優(yōu)先參考使用配方C4：MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D。