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    蘋果腐敗菌的分離與鑒定

    2021-08-11 02:54:34季春艷段夢晴曾雅倩獨(dú)夢蕊劉生杰劉艷紅
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2021年14期
    關(guān)鍵詞:孢屬懸浮液侵染

    季春艷,段夢晴,曾雅倩,獨(dú)夢蕊,劉生杰,2, 劉艷紅

    (1.阜陽師范大學(xué) 信息工程學(xué)院,安徽 阜陽 236037;2.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 阜陽 236037)

    蘋果中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),因其營養(yǎng)價值高為人們所喜愛,但富含營養(yǎng)也為腐敗微生物滋生提供了良好條件,為蘋果的貯藏保鮮帶來難度[1]。影響蘋果腐敗變質(zhì)的因素有很多,有物理因素、化學(xué)因素、生物因素等,其中微生物感染是導(dǎo)致蘋果腐敗變質(zhì)的重要原因。只要環(huán)境適宜,病原菌侵染蘋果后生長繁殖,分解吸收利用果實(shí)中的營養(yǎng)物質(zhì),來滿足自身生長代謝的需要,蘋果的營養(yǎng)成分被破壞,果實(shí)腐敗并產(chǎn)生不良?xì)馕?,失去了原有的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值[2-3]。蘋果的常見微生物侵染型病害有霉心病、輪紋病、青霉病等[4]。引起這些病害的主要微生物為青霉(Penicillium sp.)、鏈格孢菌(Alternaria sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)等,都是從碰、壓、磕、刺傷或病蟲害的部位侵入果實(shí),引起蘋果發(fā)病。蘋果腐敗變質(zhì)嚴(yán)重阻礙了我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

    以市售常見紅富士腐爛蘋果為原料,對爛蘋果上的微生物進(jìn)行了分離,通過侵染試驗(yàn)驗(yàn)證分離菌株的致腐能力,并對該微生物進(jìn)行鑒定,以期為深入研究致腐微生物對蘋果的致病機(jī)理和保鮮提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    市售自然腐爛紅富士蘋果。

    1.2 儀器設(shè)備

    BPC-250F 型生化培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品;T100P 型PCR 儀,上海興曼生物科技有限公司產(chǎn)品;BM1000 型光學(xué)顯微鏡,德國Eppendof 公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 分離可能的致病菌

    挑選腐敗的紅富士蘋果,切除蘋果表面腐敗組織作為樣品,將25 g 果肉樣品加入225 mL 滅菌水中,均質(zhì),按照10 倍系列稀釋[5]。選擇適當(dāng)?shù)南♂屢?,? mL 的稀釋液涂抹在PDA 培養(yǎng)基上。培養(yǎng)1~2 d,再用平板劃線方法分離純化,連續(xù)純化5~6 次,直至長出單個菌,將純化的菌種置于4 ℃下保存[6-8]。

    1.3.2 致腐能力測定

    (1)孢子懸浮液制備。將已分離菌接種到PDA培養(yǎng)基上,在28 ℃下培養(yǎng)約5 d,挑取菌落孢子于無菌水中,用血球板計數(shù),孢子懸浮液的質(zhì)量濃度配制為1×105CFU/mL。

    (2)接種。蘋果→清洗→消毒(200 mg/L 次氯酸鈉浸泡10 min)→70 %酒精噴涂蘋果表面→晾干→在蘋果果實(shí)的赤道部位用滅菌不銹鋼鐵釘(約4 mm)形成統(tǒng)一大小的創(chuàng)傷口。每個蘋果隨機(jī)選擇3 個創(chuàng)口接種20 μL 孢子懸浮液,另一個創(chuàng)口接種等量的無菌水作為對照試驗(yàn)。

    (3)菌斑直徑的測量。接種后的蘋果放置在28 ℃環(huán)境下培養(yǎng),并每天觀察和測量病斑直徑,若蘋果病斑直徑大于2 mm 為腐敗菌,反之不是腐敗菌。

    1.3.3 菌株的鑒定

    (1)形態(tài)觀察。挑取純培養(yǎng)菌落,于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征,進(jìn)行初步鑒定。

    (2)微生物基因組DNA 提取與電泳檢測。采用CTAB 方法提取基因組DNA,主要參照易慶平,馮廣達(dá)等人[9-10]的方法,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的凝膠,電泳檢測基因組DNA。根據(jù)電泳檢測結(jié)果判斷該菌基因組序列大小[3,11]。

    (3)真菌ITS 序列測定與分析。將提取出來的DNA 產(chǎn)物送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序,采用ITS 序列擴(kuò)增通用引物ITS4,ITS5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,從而鑒定分離純化的菌的ITS 序列,將測得的序列通過BLAST 軟件進(jìn)行比對,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 分離可能的致病菌

    注射孢子懸浮液5 d 后的蘋果腐敗情況見圖1。

    圖1 注射孢子懸浮液5 d 后的蘋果腐敗情況

    2.2 致腐能力測定

    注射孢子懸浮液后的病斑直徑見圖2。

    圖2 注射孢子懸浮液后的病斑直徑

    圖1 是在同一個蘋果上用滅菌不銹鋼鐵釘(約4 mm)形成統(tǒng)一大小的創(chuàng)傷口,4 個創(chuàng)傷口,如圖1(a)(b)(c)(d),分別命名為孔1,2,3,4,其中孔1~3(a~c)是試驗(yàn)組,3 個孔分別接種質(zhì)量濃度為1×105CFU/mL 的該菌孢子懸浮液20 μL 于28 ℃培養(yǎng)5 d,圖1(d)為對照組,即接種等量的無菌水。圖2 為接種后1~5 d 菌斑直徑的測定結(jié)果。從圖1 和圖2 可以看出,該菌可以使健康蘋果腐敗,且病斑直徑隨著接種時間延長不斷生長,根據(jù)科赫法則原理,可以確定分離出的菌株能夠使蘋果腐敗。

    2.3 菌株的鑒定

    2.3.1 形態(tài)觀察

    對純化后的菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察見圖3。

    圖3 對純化后的菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察

    從蘋果表面提取病料,接種至PDA 培養(yǎng)基,經(jīng)分離純化發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上長出單個菌落,菌落較大、疏松、干燥,呈絨毛狀,灰白色,可沿培養(yǎng)基表面蔓延生長(圖3(a))。挑取單菌落邊緣部分于載玻片上的無菌水中,在光學(xué)顯微鏡下(油鏡下,10×100 倍)觀察,可以看出有纖細(xì)管狀的疑似菌絲的結(jié)構(gòu)(圖3(b)),從形態(tài)觀察推測該菌株是真菌。

    2.3.2 ITS 序列擴(kuò)增及電泳

    基因組DNA 電泳的檢測結(jié)果見圖4。

    從純化后的菌株中提取了7 管基因組DNA,編號為1~7,分別以7 管中的DNA 為模板,以真菌ITS 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,從圖4 中可以看出,1,2,4,5 這4 個管中序列DNA 條帶明顯,且DNA 序列大小在500 bp左右,這與真菌的ITS 序列片段長度一般在500~750 bp 相吻合,所以可以初步判斷該菌株為真菌。

    圖4 基因組DNA 電泳的檢測結(jié)果

    2.3.3 真菌ITS 序列測定與分析

    將提取出來的DNA 產(chǎn)物進(jìn)行基因序列的測定,得到真菌的基因ITS 序列。

    真菌ITS 測定序列見圖5。

    圖5 真菌ITS 測定序列

    將測得的序列通過BLAST 軟件進(jìn)行比對[12-17],比對結(jié)果顯示,菌株(命名為XXGC-1)與色二孢屬基因序列的同源性高達(dá)99.34%,將測得的序列通過BLAST 軟件與已知微生物比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,在系統(tǒng)發(fā)育樹中XXGC-1 與色二孢屬Diplodia seriata CBS 112555(NR 111151.1)等菌能聚在一起(圖6),表明菌株是色二孢屬中一種。

    基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6。

    圖6 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 結(jié)論

    對腐爛蘋果上腐敗菌分離、鑒定。通過平板分離純化、蘋果菌落特征觀察、光學(xué)顯微鏡觀察、ITS序列測定,及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,結(jié)果表明該菌種與色二孢屬(Diplodia seriata)有99.34%的相似率,且與色二孢屬Diplodia seriata CBS 112555(NR 111151.1)親緣關(guān)系最近。通過侵染試驗(yàn)表明,該菌種具有致腐能力。致腐試驗(yàn)結(jié)果與原腐敗現(xiàn)象基本一致、癥狀表現(xiàn)基本相同。

    目前,從腐敗蘋果中分離并鑒定出的微生物主要有細(xì)菌和真菌,細(xì)菌有歐文氏菌(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、棒桿菌屬(Corynebacteriurn)、芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬等,真菌有青霉菌屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)等,色二孢屬在果蔬種植過程中較常見,如它能夠引起葡萄藤頂端枯萎、藤蔓變白、芽體壞死及嫁接失敗等癥狀。而對于色二孢屬對蘋果果實(shí)的致腐問題鮮有研究。

    一般腐敗霉菌侵入果蔬組織先附著在果蔬表面,孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管能夠識別合適的滲透位置,然后形成附著胞和侵染墊等侵染結(jié)構(gòu),在侵染結(jié)構(gòu)形成期間,逐漸代謝產(chǎn)生纖維素酶和果膠酶等細(xì)胞壁降解酶,腐敗霉菌的主要致病因子是細(xì)胞壁降解酶和毒素,有的腐敗菌也會增加蘋果中促使果蔬發(fā)生褐變的關(guān)鍵酶的活性,如PPO 和POD 等,從而加速果實(shí)的褐變反應(yīng);有的腐敗菌能夠改變果蔬的風(fēng)味物質(zhì),加快風(fēng)味物質(zhì)的代謝和揮發(fā),改變與軟化相關(guān)的關(guān)鍵酶的活性,如PG、PME、CX 酶等[3]。所以,推測試驗(yàn)分離的腐敗菌可能有以上致病機(jī)理。試驗(yàn)存在一些不足之處,只對蘋果上的腐敗菌進(jìn)行分離鑒定,且只分離鑒定出一種菌,未能分離出多種菌株,也無法解釋該菌的致病機(jī)理,在此試驗(yàn)的基礎(chǔ)上可以從以下幾個方面進(jìn)行深入研究:

    (1)該菌種導(dǎo)致蘋果腐敗機(jī)理尚不清楚,還需要進(jìn)一步檢測相關(guān)指標(biāo),如壞果率、抗壞血酸含量、丙二醛含量、過氧化氫酶活性等,同時也可進(jìn)一步檢測相關(guān)抗性基因表達(dá)情況,從而進(jìn)一步探尋該菌對蘋果果實(shí)的致腐機(jī)理及蘋果果實(shí)的應(yīng)答機(jī)制。

    (2)尋找能夠抑制蘋果中的色二孢屬(Diplodia seriata)的方法,并通過感官評價和相關(guān)指標(biāo)的測定證明該方法安全有效。

    (3)在腐爛的蘋果上再分離純化多個菌種,并探尋它們的致病制腐機(jī)理,也可從其他腐爛水果上分離鑒定菌種,并探尋其致病或致腐機(jī)理。

    (4)探尋蘋果保鮮方法,找到抑制有害微生物生長繁殖的安全可行的方法。但是,由于其中的微生物種類多,影響因素繁多,環(huán)境條件也變化多端,存在許多不定的因素,且不同微生物之間也會相互影響。因此,探尋最佳蘋果保鮮效果是需要大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的,還需進(jìn)一步深入研究。

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