孕期及哺乳期苯并[a]芘暴露與子代胰腺受損及mtDNA拷貝數(shù)的關(guān)系

夏力旦·阿力甫 魯 英 崔 蓉

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的持久性有機污染物。有研究發(fā)現(xiàn)，PAHs暴露可能與糖尿病的發(fā)生有關(guān)[1]。環(huán)境污染物暴露導致mtDNA拷貝數(shù)的異常變化，并且與機體多種不良結(jié)局有相關(guān)性，如心血管疾病和糖尿病等[2，3]。胎兒對多環(huán)芳烴引起的DNA損傷程度可能比母親敏感10倍且可能會引發(fā)成人期的慢性疾病[4]。

本研究用PAHs的典型代表苯并[a]芘{benzo[a]pyrene，BaP}染毒，觀察不同劑量BaP染毒后，Wistar母鼠及子代血糖及mtDNA拷貝數(shù)差異性，為進一步探索孕期BaP暴露與子代糖代謝的關(guān)聯(lián)性提供依據(jù)。

材料與方法

1.試劑及儀器：純度為99.0%的苯并[a]芘(德國 Dr.Ehrenstorfer 公司)、水合氯醛(天津福晨化學試劑有限公司)、血糖儀(江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司)、ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)、全自動石蠟包埋機及切片機(德國徠卡儀器有限公司)、組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)、分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)、熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

2.實驗對象：SPF(specific pathogen free)級健康未生育Wistar雌鼠24只，平均體質(zhì)量為213.20±9.57g。雄鼠8只，平均體質(zhì)量為211.10±8.85g。由新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(新)2018-0002。動物研究遵循了新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心有關(guān)實驗動物管理和使用規(guī)定并通過了倫理審批，倫理審批號：20190226-30。

3.動物交配：適應期飼養(yǎng)1周，第8天晚8:00時按照雄雌1∶3比例進行合籠，次日晨用棉棒以0.9%NaCl溶液在陰道口緩慢插入雌鼠的陰道，取內(nèi)容物，均勻涂抹載玻片，放置于光學顯微鏡下觀察，兩名操作者分別核查，均發(fā)現(xiàn)精子者判定為受孕，記為妊娠第1天。

4.動物分組及染毒：排除未受孕的大鼠，將已受孕母鼠按體質(zhì)量隨機分為對照組，BaP低(2μg/kg)、中(200μg/kg)、高(800μg/kg)劑量組，每組6只孕鼠。孕鼠BaP灌胃染毒至哺乳期結(jié)束時(孕期21天，哺乳期21天，共6周)，排除體質(zhì)量差異性較大子鼠，剩余子鼠隨機選其1只確定為本實驗研究對象。每組6只與母鼠相配對子鼠，共24只。以上確定的子鼠在出生第21天斷乳后(PND21)與母鼠同時、同步進行下一步實驗。BaP染毒劑量根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的孕產(chǎn)婦多環(huán)芳烴接觸限量以及美國環(huán)保署等得出的呼吸道暴露BaP致癌劑量設定[5,6]。稱取一定量的BaP,溶解于玉米油中并4℃超聲30min制成一定濃度的BaP 原液，使用時按照劑量，用玉米油進行稀釋。BaP暴露從孕期開始至哺乳期結(jié)束(6周)每天灌胃1次，對照組暴露同等劑量的玉米油。染毒期間自由飲水。

表1 引物序列

結(jié) 果

1.大鼠一般情況:與對照組比較，高、中劑量組母鼠飲水量、進食量明顯減少，毛發(fā)干枯，精神狀態(tài)不佳。低劑量組母鼠與高、中劑量組比較，精神狀態(tài)較好，飲水量、進食量正常。對照組母鼠生長良好，飲水、進食及活動均正常。

2.BaP暴露與母鼠及子鼠臟器系數(shù)的變化：實驗得出，染毒組母鼠胰腺臟器系數(shù)均高于對照組，其中低劑量組母鼠胰腺臟器系數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著染毒劑量增加，高劑量組子鼠胰腺臟器系數(shù)均高于中、低劑量組及對照組(P<0.05)，詳見表2。

表2 各組大鼠臟器系數(shù)的比較

3.母鼠不同時間點空腹血糖的變化：中、高劑量組母鼠PND10及PND21空腹血糖值顯著高于GD1的空腹血糖值(P<0.05)，詳見表3。

4.母鼠斷乳期空腹血糖、胰島素、胰島素相關(guān)指數(shù)的比較：哺乳期第21天，各組母鼠空腹血糖值、胰島素含量及HOMA指數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表4。

5.子鼠斷乳期空腹血糖、胰島素、胰島素相關(guān)指數(shù)的比較：子鼠胰島素水平中、高劑量組分別與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，且對照組顯著低于高劑量組，詳見表5。

6.BaP暴露對子代胰腺組織形態(tài)的影響：子鼠胰腺HE染色結(jié)果顯示，高劑量組胰島邊界模糊，胰島內(nèi)β細胞排列稀疏，細胞明顯減少，可見空泡變性及凋亡細胞，部分胰島細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。中劑量組胰島β細胞腫脹，同樣可見空泡變性。低劑量組胰島相對完整，胰島邊界較清晰，β細胞形態(tài)較好。對照組胰島邊界清晰，胰島內(nèi)β細胞分布均勻，胞質(zhì)豐富，胰島細胞間毛細血管豐富紅染(圖1)。

圖1 孕期BaP暴露對子鼠胰腺形態(tài)的影響(HE，×400)A.高劑量組:胰島邊界模糊，胰島內(nèi)β細胞排列稀疏，如短箭頭所示可見空泡變性，三角形所示可見細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;B.中劑量組:胰島內(nèi)β細胞排列稀疏，如短箭頭所示可見空泡變性;C.低劑量組：胰島相對完整，胰島邊界清晰，β細胞數(shù)目增加，細胞形態(tài)較好，無明顯的空泡變性、腫脹及脂質(zhì)沉淀; D.對照組: 胰島呈橢圓形團索狀，胰島邊界清晰，β細胞分布均勻、 排列緊密，如長箭頭所示可見胰島細胞間毛細血管豐富紅染

7.母鼠及子鼠胰腺組織 mtDNA 拷貝數(shù)組間差異性分析：通過RT-PCR定量技術(shù)得出，母鼠胰腺組織平均mtDNA拷貝數(shù)組間比較，差異無統(tǒng)計學意義。子鼠高劑量組胰腺組織平均mtDNA拷貝數(shù)與其余3組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組胰腺組織平均mtDNA拷貝數(shù)為405.04±287.72，高劑量組平均mtDNA拷貝數(shù)為68.30±13.02,對照組是高劑量組的5.96倍，詳見圖2。

圖2 母鼠及子鼠胰腺mtDNA拷貝數(shù)與高劑量組比較，*P<0.05

討 論

研究表明，長期接觸多環(huán)芳烴與肥胖和2型糖尿病有關(guān)聯(lián)性[7,8]。BaP是毒性不良反應最強的多環(huán)芳烴之一，其接觸途徑有攝入BaP含量高的食物和呼吸道吸入[9]。高脂飲食時攝入BaP通過誘導促進2型糖尿病相關(guān)基因的表達而增加2型糖尿病的發(fā)生風險[10]。2型糖尿病的早期階段，胰腺β細胞通過胰島素的高分泌進行補償，以維持正常的血糖水平[11]。然而，由于線粒體功能紊亂，β細胞代償功能失調(diào)，進而導致β細胞凋亡[12]。本研究中，中、高劑量組母鼠均有不同程度體質(zhì)量減輕現(xiàn)象。隨著實驗的進行，染毒組母鼠及子鼠胰腺臟器指數(shù)亦隨之升高，提示大鼠的胰腺可能發(fā)生了一定程度的損傷。

本實驗檢測了大鼠的血糖、胰島素以及HOMA指數(shù)。空腹血糖作為檢測糖尿病的“金標準”，反映胰島素分泌以及胰島β細胞功能[13]。HOMA指數(shù)已被廣泛應用于機體胰島素敏感度、胰島素抵抗水平與胰島β細胞功能的評價[14]。本研究中，中、高劑量組母鼠PND10及PND21的空腹血糖值顯著高于GD1的空腹血糖值,然而, HOMA指數(shù)組間比較，差異無統(tǒng)計學意義，這可能與大鼠個體差異較大或因樣本量較小有關(guān)。

研究顯示，胰島 β 細胞功能具有很強的遺傳性[15]。Simmons等[16]提出大鼠胰腺類似與人類胰腺，胎兒胰腺發(fā)育對妊娠期宮內(nèi)葡萄糖水平十分敏感，故宮內(nèi)不良環(huán)境可使子代胰腺發(fā)育受損，且這種效應可延續(xù)至成年。在本研究中，高劑量組子鼠胰島素水平顯著高于對照組。胰腺HE染色結(jié)果中，隨著染毒劑量的增加子代胰腺胰島邊界模糊，胰島內(nèi)β細胞排列稀疏，細胞明顯減少，可見空泡變性且部分胰島細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。結(jié)合不同組間子鼠胰島素水平差異性以及胰島細胞數(shù)目及形態(tài)的改變，提示孕期BaP暴露對子代β細胞胰島功能有一定的影響。

線粒體在能量代謝、活性氧自由基生成等方面發(fā)揮著重要作用。線粒體遺傳信息只能通過母親遺傳給后代[17]。相對于核DNA,mtDNA 缺少染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和組蛋白的保護并且DNA修復能力的不足，易受環(huán)境污染物影響，導致mtDNA 的突變與缺失[18]。McCarthy等[19]在非胰島素依賴性糖尿病人群中檢測出mtDNA ND1 G3316A突變。Hirai等[20]研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA ND1 T3394C突變在日本糖尿病人群中高發(fā)。在大學生和親自做飯的婦女中，PAHs暴露與其mtDNA拷貝數(shù)呈負相關(guān)[21，22]。但在焦爐工人中，PAHs 暴露與mtDNA拷貝數(shù)卻呈正相關(guān)[23]。

綜上所述，本實驗以mtDNA ND1基因為切入點發(fā)現(xiàn)，隨著BaP暴露濃度的增加子鼠胰腺組織平均mtDNA拷貝數(shù)降低，且對照組平均mtDNA拷貝數(shù)為高劑量組的5.96倍。本研究結(jié)果為孕期BaP暴露與子代胰腺組織mtDNA拷貝數(shù)的變化之間的聯(lián)系提供了證據(jù)，其子代mtDNA拷貝數(shù)的減少可能是孕期BaP暴露導致2型糖尿病發(fā)生的重要原因之一。鑒于人類與其他哺乳動物有著許多共同的生物特性，認為表突變可能也會在人類中一代代地遺傳下去似乎是合理的。本研究也存在不足之處，因本研究染毒周期為孕期開始至斷乳期，只針對 21 天齡的子鼠進行了孕期及哺乳期BaP暴露與糖脂代謝分子機制相關(guān)研究。今后可進一步研究子代成年期糖脂代謝的情況，使研究結(jié)果更具有代表性。