外泌體在肝細(xì)胞性肝癌中的作用研究進展

劉興暉 彭婷瑋 楊 蘭

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的類型，具有發(fā)生率高、病死率高的特征[1]。HCC起病隱匿，并且缺乏敏感、特異的早期診斷方法，故常常漏診。其次，HCC的高轉(zhuǎn)移特性加速了疾病進展。目前針對HCC的治療包括手術(shù)切除和放化療干預(yù)(如索拉菲尼、射頻消融術(shù))，前者針對早期HCC患者，可以適當(dāng)延長患者生存期，但HCC肝內(nèi)復(fù)發(fā)和肝外轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高。后者針對晚期HCC患者，但容易誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。因此，兩種治療方案的預(yù)后均不樂觀。為了明確HCC的早期診斷、監(jiān)測疾病的進展、評估預(yù)后及治療方法的療效，發(fā)現(xiàn)一些敏感而特異的HCC標(biāo)志物是很重要的。大量研究表明,外泌體表面的膜結(jié)合分子，可被受體細(xì)胞識別并廣泛參與細(xì)胞間的信息傳遞，參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，包括腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及血管生成、免疫調(diào)節(jié)等過程[2, 3]。同時外泌體也會影響HCC的預(yù)后及治療。

一、外泌體的生物學(xué)特性

活細(xì)胞可以通過分泌胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)與鄰旁細(xì)胞或遠(yuǎn)端細(xì)胞進行信息交流。EV根據(jù)亞細(xì)胞來源分為兩大類：一類是細(xì)胞質(zhì)膜直接出芽形成、釋放直徑為100～1000nm的微囊泡;另一類是活細(xì)胞內(nèi)多囊泡體(MVB)與細(xì)胞質(zhì)膜融合后釋放出一系列小囊泡，即外泌體(exosomes)，其直徑為50～150nm[4]。

細(xì)胞質(zhì)膜向內(nèi)凹陷，在RAB5和RAB3介導(dǎo)下細(xì)胞質(zhì)膜向內(nèi)凹陷形成早期內(nèi)體，進一步發(fā)育成熟形成晚期內(nèi)體，在轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)體分選復(fù)合體(ESCRT)的作用下向內(nèi)側(cè)出芽，形成包裹多個腔內(nèi)小泡(IVB)的多囊泡體(MVB)。當(dāng)MVB與細(xì)胞質(zhì)膜融合后，腔內(nèi)囊泡釋放至細(xì)胞外，形成外泌體。幾乎所有細(xì)胞都能分泌外泌體。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體(tumor-derived exosome,TDE)攜帶一系列信號分子，包括蛋白質(zhì)(膜蛋白、黏附蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等)、核酸(DNA、mRNA、非編碼RNA)和脂質(zhì)(鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、膽固醇)[5]。

外泌體的分離方法較多，目前的金標(biāo)準(zhǔn)為差速超速離心法，還有一些其他方法如微流控技術(shù)、免疫親和層析等。外泌體的鑒定方法有電鏡下觀察形態(tài)、粒徑分析判斷其粒子大小以及蛋白質(zhì)印跡法檢測特異性蛋白的表達[6]。

二、外泌體與肝癌

1.外泌體與肝癌的診斷：近年來，由于外泌體攜帶的生物分子與來源細(xì)胞具有一致性， TDE作為腫瘤分子標(biāo)志物在腫瘤診治中的應(yīng)用得到了越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較，HCC患者血清中有19種miRNAs顯著增加。其中，miR-210分泌由HCC細(xì)胞來源的外泌體介導(dǎo)，因此，miR-210也可作為HCC診斷的生物學(xué)標(biāo)志物之一[7]。Pu等[8]研究發(fā)現(xiàn)， HCC患者血清中外泌體has-miR-21-5p和has-miR-144-3p表達水平顯著高于慢性乙型肝炎(CHB)患者，ROC曲線顯示，兩者在HCC診斷上的表現(xiàn)優(yōu)于甲胎蛋白，敏感度和特異性更高，作為腫瘤分子標(biāo)志物具有良好的臨床應(yīng)用前景。

2.外泌體與肝癌的發(fā)生和發(fā)展：腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子、炎性細(xì)胞因子等組成。不同細(xì)胞外泌體通過攜帶不同信號分子發(fā)揮細(xì)胞通訊作用，參與肝癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、血管生成以及免疫抑制型微環(huán)境構(gòu)建。

(1)腫瘤發(fā)生：當(dāng)癌基因表達過度活化或抑癌基因表達過度受抑時，細(xì)胞表現(xiàn)為增殖能力的過度增強和凋亡能力的過度削弱，進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。PTEN是一種抑癌基因，負(fù)向調(diào)控腫瘤的發(fā)生。有研究表明，肝癌細(xì)胞外泌體miR-155抑制鄰旁或遠(yuǎn)端受體HCC細(xì)胞中PTEN表達，活化PI3K/AKt信號通路以促進HCC細(xì)胞的增殖[9]。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清中脂肪細(xì)胞來源外泌體circDB表達水平上調(diào)，通過與HCC細(xì)胞中miR-34a結(jié)合，上調(diào)去泛素相關(guān)分子USP7的表達，通過減少細(xì)胞增殖過程中的DNA損傷來促進腫瘤發(fā)生。Mao等[11]在研究中提到了癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞來源EV中的NID1通過激活肺臟中的CAFs，促進其旁分泌腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)，進而誘導(dǎo)HCC細(xì)胞克隆的形成，表現(xiàn)出更加活躍的增殖能力。

(2)腫瘤轉(zhuǎn)移：腫瘤轉(zhuǎn)移是HCC發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常常提示疾病朝著不良方向進展。外泌體中的信號分子通過細(xì)胞間信號交流介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管滲漏等生物學(xué)過程，促進HCC的侵襲與肝外轉(zhuǎn)移[3]。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymale transition,EMT)是指腫瘤細(xì)胞在CAFs的影響下從上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型，功能上體現(xiàn)為低增殖活性、高侵襲與遷移能力，形態(tài)上由上皮細(xì)胞的立方形、圓形轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的梭形、星形，細(xì)胞分子上體現(xiàn)為失去上皮表型標(biāo)志(如鈣黏蛋白)，獲得間質(zhì)表型標(biāo)志(如α-SMA)[3]。Zhu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HCC細(xì)胞外泌體中circ-0004277表達水平上調(diào)，通過細(xì)胞通訊作用，提高癌旁正常肝細(xì)胞中circ-0004277的表達水平，進而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，促進HCC的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。Fang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞外泌體中高表達的miR-1247-3p進入肝成纖維細(xì)胞后，通過結(jié)合胞內(nèi)B4GALT3抑制其表達，促進NF-κB磷酸化，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-1β、IL-6和 IL-8等促炎性細(xì)胞因子，進而被活化為CAFs，促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，侵襲力增加。

腫瘤細(xì)胞穿透血管內(nèi)皮屏障在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)血管通透性增強時，肝臟中的HCC細(xì)胞可穿過血管壁，進入血液循環(huán)中，隨血流轉(zhuǎn)移至全身各處，在適宜的靶器官中定植，形成肝外轉(zhuǎn)移灶。血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠攝取HCC細(xì)胞外泌體miR-103，通過抑制VE-鈣黏蛋白、p120連接素和閉鎖連接蛋白1合成，削弱內(nèi)皮細(xì)胞間黏附連接與緊密連接的完整性，增加血管通透性，促進HCC細(xì)胞血管滲漏與侵襲轉(zhuǎn)移[14]。除了削弱血管間的黏附作用以外，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞與HCC細(xì)胞間的黏附也能夠介導(dǎo)HCC的高轉(zhuǎn)移特性。細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)是一種能夠顯著增強內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞黏附作用的分子，CD90+Huh7細(xì)胞外泌體lncRNA H19上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達，使得內(nèi)皮細(xì)胞黏附更多CD90+Huh7細(xì)胞，以利于HCC細(xì)胞穿過內(nèi)皮侵襲轉(zhuǎn)移[15]。

(3)血管生成：新血管生成不僅能為腫瘤提供大量的氧氣和營養(yǎng)，促進腫瘤的生長，還作為轉(zhuǎn)移細(xì)胞進入體循環(huán)的入口點，介導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強。Lin等[7]研究發(fā)現(xiàn)HCC患者微血管密度與血漿miR-210表達水平具有明顯相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝癌細(xì)胞來源的外泌體miR-210與單層內(nèi)皮細(xì)胞共孵育后， HCC細(xì)胞來源外泌體miR-210通過下調(diào)SMAD4和STAT6蛋白表達來促進毛細(xì)血管生成。腫瘤干細(xì)胞樣CD90+肝癌細(xì)胞通過外泌體高水平表達lncRNA H19，顯著增加促血管生成因子VEGF和相應(yīng)受體VEGF-R1的釋放，也能上調(diào)促血管生成作用[15]。Shao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HCC細(xì)胞來源EVs的miR-584-5p通過結(jié)合磷酸烯醇式丙酮酸激酶1(PCK1)抑制其活性，誘導(dǎo)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)活化，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)表達，促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增強血管生成能力。Wang等[17]認(rèn)為，HCC細(xì)胞來源的外泌體中miR-1290富集，當(dāng)其被血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化后，能夠抑制胞內(nèi)SMEK1的表達，削弱其對VEGFR2磷酸化的抑制作用，從而誘導(dǎo)VEGFR2的活化和血管生成。除了非編碼RNA介導(dǎo)血管生成外，蛋白質(zhì)分子也可參與其中。血管緊張素轉(zhuǎn)運蛋白(vasorin，VASN)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，在腫瘤發(fā)生和血管生成中發(fā)揮重要作用。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞外泌體高表達VASN，被受體HUVEC內(nèi)化攝取后，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力增強，大量的內(nèi)皮細(xì)胞聚集有利于血管生成。

(4)免疫調(diào)節(jié)：正常情況下，機體能夠通過抗腫瘤免疫來清除體內(nèi)癌細(xì)胞，但在腫瘤進展過程中，腫瘤免疫微環(huán)境由激活轉(zhuǎn)為抑制，腫瘤細(xì)胞逃避機體的免疫破壞作用。巨噬細(xì)胞作為腫瘤免疫微環(huán)境中一類重要的免疫細(xì)胞，通過其表面配體與T細(xì)胞表面受體相互作用，介導(dǎo)腫瘤免疫抑制型微環(huán)境的形成。Tan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞外泌體中表達LOXL4蛋白質(zhì)分子，并且能被骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)內(nèi)化攝取，在BMDM成熟早期促進其向CD11b+F4/80+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞群(TAM)分化，銅依賴的H2O2產(chǎn)生通過激活I(lǐng)FN相關(guān)的信號通路，誘導(dǎo)STAT3和STAT1活化，增強TAM表面PD-L1分子的表達，巨噬細(xì)胞可通過PD-L1和CD86等細(xì)胞表面抗原與細(xì)胞毒性T細(xì)胞相互作用，抑制T細(xì)胞的活化，并促進TIM3陽性的CD4+和CD8+T細(xì)胞的耗竭，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。根據(jù)活化方式不同巨噬細(xì)胞分為兩種類型，一類是具有抗炎抗腫瘤活性的M1型，另一類是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫抑制，腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的殺傷破壞作用得以生存的M2型[20]。有研究表明，肝癌細(xì)胞來源外泌體中高表達lncRNA TUC339，被巨噬細(xì)胞內(nèi)化攝取后，降低巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-4等促炎性細(xì)胞因子的能力，吞噬作用減弱，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化，促進HCC進展[21]。

3.外泌體與肝癌預(yù)后：HCC早期患者可進行肝切除術(shù)治療，外泌體一些信號分子的表達與術(shù)后復(fù)發(fā)時間、總生存期長短、轉(zhuǎn)移潛能等密切相關(guān)，可作為評估預(yù)后的指標(biāo)。Wang等[22]跟蹤隨訪183例行肝細(xì)胞癌切除術(shù)后的丙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞性肝癌患者10年發(fā)現(xiàn)，這些患者血清外泌體中的分化拮抗非蛋白質(zhì)編碼RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)的表達水平與HCC復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，并且成為HCC復(fù)發(fā)和病死率相關(guān)的最具預(yù)測性的因素。另外一項研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者外泌體miR-103表達與HCC的轉(zhuǎn)移潛能和復(fù)發(fā)風(fēng)險呈正相關(guān)，外泌體中miR-103水平高表達提示預(yù)后較差[14]。Jung等[23]檢測并分析14例HCC患者(其中8例患者1年內(nèi)沒有發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，6例患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移)血清外泌體的miRNA表達譜后發(fā)現(xiàn)，有61種miRNA在轉(zhuǎn)移性HCC患者血清外泌體中表達顯著上調(diào)，提示HCC的不良預(yù)后。

4.外泌體與肝癌治療

(1)免疫治療：樹突狀細(xì)胞(DC)因其具有極強的抗原遞呈作用和激活抗腫瘤免疫的能力而越來越廣泛地應(yīng)用于HCC免疫療法中，其誘導(dǎo)的腫瘤免疫強度很大程度上取決于腫瘤抗原的含量及特性，外泌體因其具有選擇性富集來源細(xì)胞胞內(nèi)成分的作用，故與腫瘤細(xì)胞碎片比較，腫瘤來源外泌體(TDE)作為抗原誘導(dǎo)DC活化的能力和腫瘤免疫強度更強。研究表明，HCC細(xì)胞衍生的外泌體中特征性肝癌抗原AFP和分子伴侶蛋白Hsp70顯著增加，在體外能夠被DC細(xì)胞內(nèi)化攝取并促進DC細(xì)胞的成熟與活化，進一步放大TDE引發(fā)的免疫反應(yīng)。同時，將TDE活化的DC細(xì)胞注入小鼠血清中發(fā)現(xiàn)，CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞顯著增多，CD25+FoxP3+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯著減少，產(chǎn)生免疫抑制性因子IL-10、TGF-β濃度顯著降低，免疫活化性因子IFN-γ濃度顯著升高，腫瘤免疫微環(huán)境得到了顯著改善，由免疫抑制轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呋罨瑸榭鼓[瘤免疫效應(yīng)提供有利的環(huán)境條件[24]。

(2)作為藥物運送載體：外泌體因其具有低免疫原性、低毒性、可進行人工修飾，并且能夠自由穿過生物屏障的特點，是非常理想的藥物輸送載體。外泌體既可以包裹HCC化療藥物，通過外層脂質(zhì)膜保護作用使其不容易被降解，延長其在機體內(nèi)作用時間，也可以包裹提高HCC細(xì)胞對化療藥物敏感度的miRNA等，利于化療藥物在機體內(nèi)發(fā)揮抑瘤作用。Zhang等[25]將阿霉素或索拉菲尼裝載至紅細(xì)胞來源的EVs中，該載藥EVs可明顯抑制小鼠原位肝癌細(xì)胞的生長,并且其對肝癌的抑制作用強于傳統(tǒng)化療藥物給藥方式及劑量所誘導(dǎo)的肝癌抑制作用。miR-122表達下調(diào)可激活I(lǐng)GF-1R進而活化RAS/RAF/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，介導(dǎo)HCC細(xì)胞對索拉菲尼耐藥性的形成，過表達miR-122時可使得HCC細(xì)胞對索拉菲尼敏感而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。Lou等[27]在研究中用編碼miR-122的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)后，產(chǎn)生的外泌體可通過分泌miR-122增加HCC細(xì)胞對索拉菲尼的敏感度。此外，外泌體還能夠通過包裹抑制腫瘤細(xì)胞生長和侵襲的miRNA，使其轉(zhuǎn)移到HCC細(xì)胞后逆轉(zhuǎn)其惡性表型。人肝成纖維細(xì)胞miR-335-5p表達上調(diào)可抑制鄰旁HCC細(xì)胞增殖，進而抑制腫瘤生成，CAFs外泌體分泌的miR-320a可作為一種抗腫瘤miRNA，與其下游靶點PBX3結(jié)合，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移[28，29]。因此，選擇合適的外泌體裝載這些miRNA，為HCC的靶向治療提供了新的途徑。

三、展 望

綜上所述，不同細(xì)胞來源的外泌體攜帶不同的信號分子，通過靶向不同的受體或介導(dǎo)不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與HCC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等，包括腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及血管生成和免疫調(diào)節(jié)，因此，通過對患者體液中外泌體蛋白質(zhì)、非編碼RNA等分子的檢測和分析能夠為癌癥的早期診斷、預(yù)后評估和治療方法的改善提供一定的參考和依據(jù)。但由于目前的外泌體分離方法無法獲得完全純化的外泌體，所以限制了外泌體作為HCC分子標(biāo)志物的臨床應(yīng)用。今后應(yīng)進一步研究外泌體的特性，以利于將外泌體與大小相近的凋亡小體和微囊泡區(qū)分開來。此外，目前外泌體攜帶信號分子通過細(xì)胞通訊介導(dǎo)HCC發(fā)生、發(fā)展的機制已經(jīng)得到了充分研究，但外泌體的生成過程同樣具有致瘤作用，因此，今后應(yīng)致力于研究外泌體的生成在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用，使得HCC診斷的分子標(biāo)志物與治療途徑更多樣。