制痂酊對(duì)大鼠深Ⅱ度燒傷的創(chuàng)傷修復(fù)及作用機(jī)制

李飛龍，黃趙剛，程 鋼,高金平，詹迪迪，李 俊，夏 泉

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科、國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科、安徽醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所，安徽 合肥 230032；4.安徽省兒童醫(yī)院藥劑科,安徽 合肥 230051)

燒傷是常見的創(chuàng)傷類疾病，處于外傷疾病第四位，全球每年有大量的人因燒傷而死亡。燒燙傷具有較高的致殘、致死率，危害程度高，給人類社會(huì)造成重大的負(fù)擔(dān)[1-2]。制痂酊為我院特色制劑(皖藥制字Z20050013)，由黃柏、黃芩、兒茶、冰片采用滲漉的方法制備而成。其主要成分為黃芩苷、兒茶素和小檗堿，具有抑菌、減少炎癥反應(yīng)、收斂、促進(jìn)創(chuàng)面愈合和結(jié)痂等作用，廣泛應(yīng)用于燒傷、褥瘡及皮膚擦傷的治療等，臨床療效確切[3-4]。前期研究對(duì)制痂酊主要成份黃芩苷、小檗堿的含量做了嚴(yán)格的質(zhì)量控制，保證了制劑安全有效[5]。本研究采用大鼠深Ⅱ度燒傷模型，觀察制痂酊對(duì)燒傷后大鼠的創(chuàng)面修護(hù)作用和對(duì)血清炎癥介質(zhì)的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為制痂酊的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量(200-250)g。由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(皖)2017-001。

1.1.2藥品與試劑 制痂酊(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑，皖藥制字Z20050013：批號(hào)190619)；濕潤(rùn)燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000004)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1B)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3儀器與設(shè)備 Zokia HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器公司); AB135-5電子天平(上海梅特勒)；YXQ-LS-100II高壓滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Tecan公司)；臺(tái)式控溫燙傷儀(振華儀器有限公司)；SB3200超聲波清洗器(必能信超聲儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組與模型制備 大鼠飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(濕潤(rùn)燒傷膏)、制痂酊高劑量組(含黃芩苷:5.92 g·L-1、鹽酸小檗堿:3.28 g·L-1、兒茶素：42.62 g·L-1)，制痂酊低劑量組(含黃芩苷:2.96 g·L-1、鹽鹽酸小檗堿:1.64 g·L-1、兒茶素：21.31 g·L-1)，各組20只。除正常組外，其余各組制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型[6]：大鼠禁水禁食12 h，剃除背部毛發(fā)后，用10%的硫化鈉溶液脫毛，腹腔注射10%水合氯醛溶液(3.5 mL·kg-1)麻醉，乳酸鈉林格抗休克，大鼠均未出現(xiàn)休克。病理證實(shí)為深Ⅱ度燒傷：燒傷部位局部表皮消失，部分真皮層內(nèi)細(xì)胞壞死，皮下組織血管擴(kuò)張水腫，可見急慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，為深Ⅱ度燙傷。

1.2.2創(chuàng)面處理及給藥方法 大鼠燙傷30 min后，陽(yáng)性對(duì)照組給予濕潤(rùn)燒傷膏、制痂酊高、低劑量組創(chuàng)面分別高劑量制痂酊、低劑量制痂酊，每天換藥2次，每次換藥前無(wú)菌生理鹽水清洗，正常組與模型組只用無(wú)菌生理鹽水清洗。為防止大鼠舔舐傷口，在其頭頸部套一硬殼項(xiàng)圈。單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.2.3創(chuàng)面愈合率 每組各取5只大鼠，計(jì)算3 d，7 d，14 d的創(chuàng)面愈合率。通過(guò)標(biāo)記稱質(zhì)量法計(jì)算創(chuàng)面愈合率：造模2 d后作為燒傷面積，大鼠創(chuàng)面鋪上方格透明紙，邊緣處描繪作為記號(hào)，方格紙剪下稱質(zhì)量代替創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率/%=(燒傷面積-創(chuàng)面面積)/燒傷面積×100%。

1.2.4創(chuàng)面組織含水量測(cè)定 每組各取5只大鼠，計(jì)算3 、7、14 d的創(chuàng)面組織含水量。大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，切下創(chuàng)面完整皮膚組織約200 mg，清凈后稱質(zhì)量(W1)，烤箱烘干(80 ℃，24 h)稱質(zhì)量(W2)。利用組織烘干前后水分前后減少的方法計(jì)算組織含水量：創(chuàng)面含水量/%=(W1-W2)/W1×100%。

1.2.5深Ⅱ度燒傷大鼠創(chuàng)面組織SOD 、CAT含量和MDA活性的測(cè)定 燙傷7 d取大鼠8只，麻醉處死后，切下創(chuàng)面完整皮膚組織在冰上破碎，用10%的冷生理鹽水研磨成漿，4 ℃離心(3 000 r·min-1，10 min)，按照試劑盒操作方法，測(cè)定各組大鼠創(chuàng)面組織SOD、CAT活性和MDA含量。

1.2.6深Ⅱ度燒傷大鼠血清制備及TNF-α、IL-1β、IL-6水平測(cè)定 大鼠麻醉后，股動(dòng)脈取血，離心取上清(3 500 r·min-1，10 min)，ELISA法檢測(cè)燙傷后 7 d各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，步驟按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，組間差異采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 制痂酊對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合率的影響燒傷后d 3各組大鼠創(chuàng)面愈合率無(wú)差異；d 7創(chuàng)面愈合率明顯升高，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量、低劑量制痂酊組差異均有顯著性(P< 0.05)；d 14各組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，制痂酊高劑量組與陽(yáng)性藥組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明制痂酊能促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，愈合效果和時(shí)間劑量呈一定的關(guān)系，創(chuàng)面愈合效果隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。見Tab 1。

Tab 1 Effect of Medicoscab Tincture on wound healing rate of deep partial thickness burn

2.2 制痂酊對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠創(chuàng)面含水量的影響深Ⅱ度燒傷大鼠各組創(chuàng)面含水量比正常組明顯升高(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組、制痂酊高低劑量組，創(chuàng)面含水量d 1就有所降低，隨著用藥持續(xù)，含水量在燙傷各時(shí)間點(diǎn)逐漸下降，但仍高于正常組。陽(yáng)性對(duì)照組，制痂酊高、低劑量組創(chuàng)面含水量在d 7、14顯著下降，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)。制痂酊高、低劑量與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)差異(P>0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Effect of Medicoscab Tincture on wound water content of deep partial thickness burn

2.3 制痂酊對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠對(duì)創(chuàng)面組織SOD、CAT含量和MDA活性的影響深Ⅱ度燒傷大鼠7 d，與正常組相比，各組大鼠創(chuàng)面組織SOD、CAT活性明顯降低，MDA含量升高(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組，制痂酊高、低劑量組SOD明顯升高、MDA下降(P<0.01)，CAT差異無(wú)顯著性(P>0.05)。說(shuō)明制痂酊能顯著升高燒傷大鼠SOD的活性而下調(diào)MDA的含量，見Fig 1。

Fig 1 Effect of Medicoscab Tincture on wound SOD, CAT, MDA of deep partial thickness burn rats

2.4 制痂酊對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響深Ⅱ度燒傷大鼠7 d，模型組

血清TNF-α、IL-1β、IL-6較正常組升高(P<0.01)。制痂酊高、低劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6明顯低于模型組(P<0.01),見Fig 2。

Fig 2 Effect of Medicoscab Tincture on serum TNA-α, IL-1β, IL-6 of deep partial-thickness burn

3 討論

制痂酊是由黃柏、黃芩、兒茶、冰片組成的特色中藥復(fù)方制劑，臨床主要用于燙傷(Ⅱ度燒傷及以下)、外傷，具有收斂消炎、抗菌、結(jié)痂等作用。燒傷創(chuàng)面處理非常重要，燒傷患者的生存質(zhì)量與創(chuàng)面治療的效果密切相關(guān)[7]。若創(chuàng)面處理不當(dāng)，會(huì)增加治療難度，引起創(chuàng)面加深甚至感染影響預(yù)后。制痂酊主要成分黃柏、黃芩具有清熱解毒、瀉火燥濕；兒茶能協(xié)助在創(chuàng)面形成一層膜，有收斂和防治細(xì)菌的感染的作用；冰片清涼開竅，以乙醇為溶媒可增強(qiáng)穿透力和殺菌作用。本研究顯示制痂酊能在一定程度促進(jìn)燒傷大鼠皮膚的愈合，縮短燒傷創(chuàng)面的愈合時(shí)間，對(duì)燒傷創(chuàng)面起到一定的保護(hù)作用。

皮膚燒傷后，燒傷組織會(huì)因炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量的炎性滲出。滲出液能夠一定程度的稀釋毒素和致炎因子，減輕毒素對(duì)局部損害，其所含補(bǔ)體和抗體可消滅病原體或滅活毒素。但滲出物主要成分是水，組織含水過(guò)多會(huì)引起組織水腫而缺血缺氧，造成進(jìn)一步損傷，創(chuàng)面難以恢復(fù)。因此含水量能間接反映創(chuàng)面的恢復(fù)情況。本研究顯示，制痂酊能減少燙傷后7 d、14 d大鼠創(chuàng)面組織中含水量，減少水腫，改善燒傷創(chuàng)面，防止進(jìn)一步惡化。

皮膚燒傷后由于組織水腫而處于缺氧狀態(tài)，能量代謝發(fā)生障礙，細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。ROS可引起過(guò)氧化反應(yīng)，損害細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，也可以破壞血管引起滲出增加，進(jìn)一步加重?fù)p傷。細(xì)胞損傷也會(huì)促進(jìn)多種炎癥因子如TNF-α、IL-1等釋放，加重炎癥損傷延緩創(chuàng)傷愈合[8]。天然活性的抗氧化肽AOP1可減輕燙傷引起的氧化應(yīng)激，促進(jìn)小鼠皮膚燙傷創(chuàng)面的愈合修復(fù)[9]；通過(guò)藥物抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠降低燒傷大鼠心肌、肺、腎臟組織并發(fā)癥損傷[10]。SOD是生物體內(nèi)一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成O2-和H2O2，在機(jī)體參與抗氧化、清除氧自由基中發(fā)揮重要作用。在過(guò)氧化氫酶(CAT)作用下H2O2分解為分子氧和水，SOD和CAT可以減少氧化應(yīng)激，增強(qiáng)，燒傷大鼠創(chuàng)面的抗氧化能力，加快燒傷創(chuàng)面的恢復(fù)。膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)會(huì)破壞蛋白質(zhì)和核酸等大分子，加劇膜的損傷。所以測(cè)量組織中SOD、CAT及MDA能夠反映脂質(zhì)過(guò)氧化，間接反映細(xì)胞損傷程度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制痂酊能明顯升高燒傷大鼠創(chuàng)面組織SOD的活性，下調(diào)MDA的含量，制痂酊促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合可能與此機(jī)制有關(guān)。

皮膚燒傷后，體內(nèi)環(huán)境會(huì)發(fā)生一系列調(diào)控，表現(xiàn)為多種細(xì)胞炎癥介質(zhì)和生長(zhǎng)因子之間相互協(xié)作。炎癥反應(yīng)與創(chuàng)面的修復(fù)有著密切的關(guān)系，炎癥程度的大小能夠反應(yīng)燒傷創(chuàng)面的修復(fù)情況，過(guò)度炎癥反應(yīng)不利于燒傷創(chuàng)面的修復(fù)，甚至引起壞死[11]。炎癥反應(yīng)關(guān)鍵分子TNF-α、IL-1β，IL-6在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。TNF-α可活化各種免疫細(xì)胞如中細(xì)粒細(xì)胞引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6等的產(chǎn)生，以致發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[12]。因此，盡早減少燒傷早期創(chuàng)面炎癥因子的釋放，可以促進(jìn)燒傷的創(chuàng)面愈合、減少全身反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，在燒傷7 d后制痂酊能明顯降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，從而減輕炎癥反應(yīng)，有利于創(chuàng)面愈合。

綜上所述，制痂酊可以提高大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合率，降低創(chuàng)面組織含水量，其可能與制痂酊能升高燒傷大鼠創(chuàng)面組織SOD的活性，下調(diào)MDA的含量，降低燙傷大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量有關(guān)。關(guān)于制痂酊治療燒傷具體分子機(jī)制和信號(hào)通路還需進(jìn)一步研究。