小鼠神經(jīng)細(xì)胞中胱硫醚β合成酶催化生成的H2S對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的影響及與VEGFR2的關(guān)系

陳佳妮，陳志武

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF),是一種重要的血管生成調(diào)節(jié)因子，可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、增殖和遷移及側(cè)支血管的形成，在生理和病理性的血管生成中發(fā)揮著基本作用[1]。VEGF作用是通過(guò)其特異的受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)來(lái)發(fā)揮的。VEGFR分為VEGFR1、VEGFR2和VEGFR33個(gè)亞型，其中，VEGFR2主要參與內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的發(fā)生，介導(dǎo)了VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)[2]。

缺血后神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中，腦血管再生直接關(guān)系到神經(jīng)組織損傷的發(fā)展和修復(fù)。在血管再生過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增殖是十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[3]。內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種氣態(tài)信號(hào)分子，在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[4]，主要由胱硫醚β合成酶(cystathionine-β-synthetase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)催化L-半胱氨酸(L-cysteine，L-Cys)來(lái)生成。CBS和CSE有組織分布特異性，CBS分布在神經(jīng)細(xì)胞中，而CSE分布在血管組織中[5]。因此，神經(jīng)細(xì)胞主要通過(guò)CBS催化產(chǎn)生H2S。腦組織中的H2S參與了海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、神經(jīng)元保護(hù)等功能的調(diào)節(jié)，發(fā)揮了一種非典型神經(jīng)遞質(zhì)的作用[6]。但內(nèi)源性H2S也是一種重要的血管活性物質(zhì)，參與血管的生理和病理過(guò)程。有研究表明H2S可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[7]，并有研究[8]顯示H2S可激活VEGFR2，siRNA介導(dǎo)的VEGFR2基因敲低可抑制H2S誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。但是由腦細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)源性H2S是否對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增殖產(chǎn)生一定的影響呢？尚未見(jiàn)這方面的研究報(bào)道。因此，本文在體外觀察了神經(jīng)元CBS催化產(chǎn)生的H2S對(duì)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移的影響，并初步探討了其作用與VEGFR2的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞小鼠海馬神經(jīng)元(HT22細(xì)胞株)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC細(xì)胞株)，均購(gòu)自上海名勁生物科技有限公司；小鼠腦微血管細(xì)胞(bEnd.3細(xì)胞株)，購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司。

1.2 主要試劑硫氫化鈉NaHS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；司馬沙尼 (semaxinib,SU5416)，購(gòu)自美國(guó)MCE公司；重組小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGFA/VEGF164購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司；胎牛血清FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；高糖DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Glpbio公司；4%多聚甲醛，0.1%結(jié)晶紫水溶液購(gòu)自Biosharp公司；H2S含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；24孔Transwell小室(直徑6.5 mm;孔徑:8 μm;ref.3422)和6孔Transwell小室(直徑24 mm;孔徑:0.4 μm;ref.3450)，購(gòu)自美國(guó)Corning公司；L-Cys購(gòu)自Macklin公司；氨基氧乙酸AOAA購(gòu)自源葉生物公司；NaHS于使用前用生理鹽溶液PBS溶解配制，并避光保存。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中，HUVEC細(xì)胞用含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，bEnd.3細(xì)胞和HT22細(xì)胞分別用含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并分別加入測(cè)試藥進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2HT22細(xì)胞和bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng) 在六孔板的Transwell小室的上室接種內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3細(xì)胞)，下室接種神經(jīng)細(xì)胞(HT22細(xì)胞)置入37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、AOAA組(1 mmol·L-1)、SU5416組(10 μmol·L-1)、L-Cys組(100 μmol·L-1)、L-Cys+AOAA組、L-Cys+SU5416組，各組分別加入溶媒或相應(yīng)的測(cè)試藥物孵育24 h后，進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.3CCK-8增殖試劑盒檢測(cè)增殖 在培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞或bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)孔中，分別加入不同濃度的NaHS、SU5416及陽(yáng)性對(duì)照藥VEGF164孵育一定時(shí)間后，棄除培養(yǎng)基，各孔細(xì)胞中分別加入100 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8測(cè)試液繼續(xù)在37 ℃下孵育2 h后，用酶標(biāo)儀讀取各培養(yǎng)孔在450 nm處的吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞增殖率：增殖率/%=(給藥后實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值) / (給藥前實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)×100%。

1.3.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將HUVEC細(xì)胞、bEnd.3細(xì)胞分別接種到24孔板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到100%匯合時(shí)，使用無(wú)菌的200 μL移液器吸頭在各孔單層細(xì)胞中心劃一直線“傷口”，并用無(wú)菌PBS洗滌兩次以去除死細(xì)胞。然后分別加入不同濃度的NaHS或SU5416或VEGF164以及500 μL含2%FBS的新鮮培養(yǎng)基(RPMI 1640和高糖DMEM)繼續(xù)孵育24 h。在倒置顯微鏡下，拍照0、24 h細(xì)胞劃痕傷口，并用ImageJ圖像軟件測(cè)定傷口面積。

1.3.5Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在Transwell上室中接種100 μL無(wú)血清細(xì)胞懸液(bEnd.3細(xì)胞或HUVEC細(xì)胞)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、SU5416組(10 μmol·L-1)、NaHS組(10-3.5mol·L-1)、NaHS+SU5416處理組、VEGF164組(10 ng·mL-1)、VEGF164+SU5416處理組，下室加入含10% FBS的RPMI 1640和高糖DMEM培養(yǎng)基各500 μL；共培養(yǎng)組在上室接種bEnd.3細(xì)胞(100 μL無(wú)血清細(xì)胞懸液)，下室接種HT22細(xì)胞。在37 ℃下孵育24 h后，將上室膜在室溫下用4% 多聚甲醛固定30 min，使用棉簽除去殘留在上室膜上表面的未遷移細(xì)胞，并用0.1 % 結(jié)晶紫染色在室溫下放置15 min。拍照，用Image-Pro Plus軟件計(jì)數(shù)。

1.3.6內(nèi)源性H2S含量的甲基藍(lán)法檢測(cè) 將神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)基取出250 μL置于離心管中，用250 μL 1% 醋酸鋅和10% 三氯乙酸處理，然后與20 μmol·L-1N，N-二甲基-對(duì)苯二胺硫酸鹽和30 μmol·L-1氯化鐵在1.2 mol·L-1鹽酸中混合。在室溫下孵育25 min后，用酶標(biāo)儀在665 nm處檢測(cè)吸光度，并使用空白管調(diào)零。根據(jù)NaHS標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2S含量。

1.3.7細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的鈣熒光成像法檢測(cè) 如前所述在神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)中，在Transwell小室的上室中放置一直徑為14 mm的圓形玻璃蓋玻片，將bEnd.3細(xì)胞接種在該蓋玻片上。在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后，在細(xì)胞中加入4 μmol·L-1Fluo-8 / AM和0.02% Pluronic F-127，繼續(xù)孵育30 min。用正常生理溶液 (NPSS：145 mmol·L-1NaCl，3 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1CaCl2，2 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1glucose，10 mmol·L-1HEPES，pH 7.4) 洗滌后，將含有細(xì)胞的蓋玻片安裝到Ca2+成像系統(tǒng)記錄室中記錄熒光強(qiáng)度(Fluorescence intensity,FT)，用波長(zhǎng)Ex/Em=490/520 nm來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，以FT來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的變化。

2 結(jié)果

2.1 NaHS促進(jìn)小鼠腦微血管和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖Fig 1A所示，與對(duì)照組比較，加入H2S 供體NaHS(1×10-8—1×10-3.5mol·L-1)培養(yǎng)24 h時(shí)，小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC細(xì)胞增殖有明顯的增強(qiáng)(P<0.01)。VEGF164(10 μg·L-1)有類(lèi)似的增強(qiáng)作用(P<0.01)。結(jié)果表明外源性H2S對(duì)小鼠腦微血管和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。Fig 1B與對(duì)照組相比，加入1×10-3.5mol·L-1NaHS 1 h時(shí)，bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的增殖作用不明顯，但加入1×10-3.5mol·L-1NaHS 6 h時(shí)，bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞增殖作用開(kāi)始增強(qiáng)，而加入48 h時(shí)，NaHS增殖作用進(jìn)一步增加。

Fig 1 Effects of NaHS on proliferation ability of bEnd.3 and HUVEC

2.2 SU5416對(duì)NaHS誘導(dǎo)的小鼠腦微血管和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的影響如Fig 2所示，在bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞中分別加入VEGFR2阻斷劑SU5416 10 μmol·L-1培養(yǎng)24 h對(duì)這兩種細(xì)胞的增殖均無(wú)明顯的影響，但可明顯地抑制1×10-3.5mol·L-1NaHS引起的bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的增殖，提示外源性H2S促進(jìn)小鼠腦微血管和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用可能與VEGFR2有關(guān)。

Fig 2 Effects of SU5416 on NaHS-promoted proliferation of bEnd.3 and HUVEC

2.3 NaHS促進(jìn)小鼠腦微血管和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及SU5416對(duì)其的影響Fig 3結(jié)果中，與對(duì)照組相比， NaHS(1×10-6—1×10-3.5mol·L-1)加入24 h可明顯并呈濃度依賴(lài)性地增加bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的遷移面積(P<0.01)；Fig 4的Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與溶媒對(duì)照組相比，加入NaHS 1×10-3.5mol·L-124 h可明顯地增加bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞從Transwell上室膜內(nèi)遷移到膜外的細(xì)胞數(shù)(P<0.01)。10 μg·L-1VEGF164對(duì)bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的遷移面積和遷移細(xì)胞數(shù)有類(lèi)似的作用(P<0.01)。結(jié)果表明外源性H2S可明顯地促進(jìn)小鼠腦微血管及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。Fig 4還表明SU5416單獨(dú)加入24 h對(duì)bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯的影響，但可明顯地減少1×10-3.5mol·L-1NaHS或10 μg·L-1VEGF164引起的bEnd.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)的增加，提示外源性H2S促進(jìn)小鼠腦微血管及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移可能與VEGFR2有關(guān)。

Fig 3 Influence of NaHS on migration of bEnd.3 and HUVEC cells(×100)

Fig 4 NaHS-promoted migration of bEnd.3 and HUVEC cells and effects of SU5416 on

2.4 神經(jīng)元CBS催化產(chǎn)生的H2S促進(jìn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移結(jié)果如Fig 5和Fig 6所示，在小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞與腦微血管bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，H2S合酶CBS底物L(fēng)-cys(100 μmol·L-1)可明顯地增加bEnd.3細(xì)胞增殖和遷移細(xì)胞數(shù)(P<0.01)；CBS抑制劑AOAA(1 mmol·L-1)單獨(dú)使用對(duì)bEnd.3細(xì)胞增殖和遷移細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯的影響，但可明顯地減弱L-cys引起的bEnd.3細(xì)胞增殖和遷移細(xì)胞數(shù)的增加。結(jié)果提示神經(jīng)元CBS催化生成H2S可促進(jìn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。

Fig 5 Effect of neuro CBS-derived H2S on proliferation of bEnd.3cells in Transwell co-culture

Fig 6 Effect of neuro CBS-derived H2S on migration of bEnd.3 cells in Transwell co-culture system(×200)

2.5 阻斷VEGFR2對(duì)神經(jīng)元CBS催化產(chǎn)生的H2S促小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移的影響如Fig 5和Fig 6所示，VEGFR2阻斷劑SU5416單用對(duì)bEnd.3細(xì)胞增殖和遷移無(wú)明顯的影響，但可明顯地減弱L-Cys促進(jìn)bEnd.3細(xì)胞增殖和遷移作用，提示HT22神經(jīng)元CBS催化產(chǎn)生的H2S促小鼠腦微血管bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移作用可能與VEGFR2有關(guān)。

2.6 L-Cys單用及合用AOAA或SU5416對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)中H2S生成的影響

結(jié)果如Fig 7所示，CBS底物L(fēng)-Cys可明顯提高小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng)中的H2S含量(P<0.01)；CBS抑制劑AOAA和VEGFR2阻斷劑SU5416單用對(duì)共培養(yǎng)中的H2S含量均無(wú)明顯影響，但AOAA可明顯地降低L-Cys引起的H2S含量的提高，而SU5416卻無(wú)明顯的影響。結(jié)果提示，L-Cys可通過(guò)海馬神經(jīng)元CBS催化生成H2S來(lái)提高共培養(yǎng)中的H2S含量。

Fig 7 Effect of L-Cys alone or in combination with AOAA or SU5416 on H2S content in co-culture system of bEnd.3 cells and HT22

2.7 L-Cys單用及合用AOAA或SU5416對(duì)共培養(yǎng)中小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的影響結(jié)果如Fig 8所示，在小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng)中，加入CBS底物L(fēng)-Cys可明顯提高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度(P<0.01)；加入CBS抑制劑AOAA和VEGFR2阻斷劑SU5416單用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度均無(wú)明顯影響，但AOAA 和SU5416能夠降低L-Cys引起的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的提高。結(jié)果提示L-Cys可通過(guò)小鼠海馬神經(jīng)元CBS催化生成H2S來(lái)提高共培養(yǎng)中的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，并可能與VEGFR2有關(guān)。

Fig 8 Effect of L-Cys alone or in combination with AOAA or SU5416 on Ca2+ fluorescence intensity in bEnd.3 cells co-cultured with HT22

3 討論

缺血性腦損傷既有神經(jīng)組織的損傷，也有腦血管的損傷，并且腦血管損傷或堵塞導(dǎo)致的腦血流減少甚至停止，是神經(jīng)組織損傷的最直接原因[9]。因此，缺血后腦損傷修復(fù)中，恢復(fù)腦血流供應(yīng)是至關(guān)重要的。缺血后腦血流供應(yīng)的恢復(fù)不僅可通過(guò)腦血管的舒張，新的腦血管生成對(duì)恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)也是非常重要的。

血管生成是指從已經(jīng)存在的毛細(xì)血管或其后靜脈形成新的血管，包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行與增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化形成血管環(huán)等極其復(fù)雜的過(guò)程[10]。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞及其增殖與遷移能力在血管生成中是至關(guān)重要的[11]。本研究在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的HUVEC細(xì)胞上，觀察到了H2S供體NaHS促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移作用，這與Longchamp等[12]報(bào)道的H2S可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移是一致的。本研究進(jìn)一步在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的bEnd.3細(xì)胞中，首次發(fā)現(xiàn)NaHS可明顯地增加bEnd.3細(xì)胞的增殖及遷移面積與遷移細(xì)胞數(shù)，表明H2S可促進(jìn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。

血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖受到多種細(xì)胞信號(hào)調(diào)控[13]。其中，VEGF/VEGFR2信號(hào)最為重要[14]。H2S可促進(jìn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移可能涉及有VEGFR2機(jī)制。有研究[15]表明，siRNA介導(dǎo)的VEGFR2基因敲低可抑制H2S誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR2阻斷劑SU5416不僅可以降低H2S對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移的促進(jìn)，也可明顯地抑制H2S促進(jìn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。結(jié)合文獻(xiàn)研究報(bào)道H2S可激活VEGFR2[8]，我們的結(jié)果提示外源性H2S可能通過(guò)激活VEGFR2來(lái)促進(jìn)小鼠腦微血管及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。

神經(jīng)細(xì)胞中H2S合酶CBS催化產(chǎn)生的H2S可參與神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。本研究將小鼠海馬神經(jīng)元(HT22細(xì)胞)與小鼠腦微血管內(nèi)皮(bEnd.3細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)H2S合酶CBS底物L(fēng)-cys可明顯地增加bEnd.3細(xì)胞增殖、遷移及共培養(yǎng)中的H2S含量，而CBS抑制劑AOAA雖然單獨(dú)使用對(duì)bEnd.3細(xì)胞增殖、遷移無(wú)明顯影響，但可明顯地減弱L-Cys引起的bEnd.3細(xì)胞增殖、遷移并減少H2S的含量。由于CBS是腦細(xì)胞特有的H2S合酶，結(jié)果表明小鼠海馬神經(jīng)元CBS可催化L-Cys生成H2S來(lái)促進(jìn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，也即小鼠海馬神經(jīng)元CBS催化產(chǎn)生的H2S可促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。

本研究在HT22細(xì)胞與bEnd.3細(xì)胞共培養(yǎng)中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)雖然VEGFR2阻斷劑SU5416本身對(duì)bEnd.3細(xì)胞增殖和遷移無(wú)明顯的影響，但可明顯地減弱L-Cys經(jīng)CBS催化生成H2S引起的bEnd.3細(xì)胞增殖和遷移的增加，并且此時(shí)共培養(yǎng)中的H2S含量無(wú)明顯的變化，結(jié)果表明神經(jīng)元CBS催化生成的H2S增加腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移作用可能與VEGFR2可能有關(guān)。結(jié)合上述的外源性H2S可通過(guò)激活VEGFR2來(lái)促進(jìn)bEnd.3細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移，結(jié)果提示神經(jīng)元CBS催化生成的H2S可激活VEGFR2促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，至于H2S如何激活VEGFR2及其詳細(xì)機(jī)制有待于今后的進(jìn)一步研究。

Ca2+是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的一種重要信使離子，可參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分泌、細(xì)胞增殖及遷移等多種生理功能的調(diào)節(jié)。有研究[15]表明，抑制鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移。本研究在小鼠海馬神經(jīng)元與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，發(fā)現(xiàn)CBS底物L(fēng)-Cys可明顯提高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度，并可被CBS抑制劑AOAA明顯減弱，表明L-Cys可通過(guò)神經(jīng)元CBS催化生成H2S來(lái)提高內(nèi)皮細(xì)胞的胞內(nèi)游離Ca2+濃度。并且進(jìn)一步觀察到L-Cys引起的提高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的提高可被VEGFR2阻斷劑明顯減弱，結(jié)合上述的VEGFR2在外源性H2S或神經(jīng)元CBS催化生成的H2S在內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移中的作用，提示神經(jīng)元CBS催化生成的H2S可能通過(guò)激活VEGFR2，導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述，神經(jīng)元CBS催化生成的H2S可促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，其可能是與激活VEGFR2，升高內(nèi)皮細(xì)胞的胞內(nèi)游離Ca2+濃度有關(guān)。