新型冠狀病毒進入細胞抑制劑的研究進展

龍昕雁，羅榮華，鄭永唐

(1.中國科學院昆明動物研究所, 中國科學院動物模型與人類疾病機理重點實驗室，云南 昆明 650223；2.中國科學院大學，北京 100049)

新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一種與SARS病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)具較高同源性的冠狀病毒，其感染導致新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease-19, COVID-19 )。SARS-CoV-2是具有囊膜結構且基因組為單股正鏈RNA的β屬冠狀病毒。該病毒具有4個結構蛋白及多個非結構蛋白，結構蛋白包括刺突蛋白(spike protein，S)、膜蛋白(membrane protein，M)、囊膜蛋白(envelope protein，E)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)，非結構蛋白包括主蛋白酶 main protease，Mpro)、木瓜樣蛋白酶(papain-like protease，PLpro)、RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerase，RdRp)等。當前新冠疫情仍然嚴峻，截止2021年3月底，全球累計確診的SARS-CoV-2感染者超過1.2億，累計死亡人數(shù)超過270萬[1]。

雖然多種新冠疫苗已被批準上市，但抗病毒藥物治療仍是應對新冠疫情的重要手段。當前僅有瑞德西韋(remdesivir)獲得FDA批準用于臨床治療，但瑞德西韋在臨床試驗中并未對COVID-19取得顯著治療效果[2]，因此仍需開發(fā)出有效的治療藥物。SARS-CoV-2進入細胞是病毒生命周期中研究相對清楚的過程，這一過程中涉及的各種分子是重要的治療靶點。進入抑制劑對COVID-19的治療和預防有重要作用，因此本文結合SARS-CoV-2進入細胞的分子機制，對SARS-CoV-2進入抑制劑的研究進展進行介紹。

1 SARS-CoV-2進入細胞的分子機制

SARS-CoV-2使用其表面的刺突蛋白作為配體，與宿主細胞膜表面血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 (angiotensin converting enzyme 2，ACE2)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)、神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin-1，NRP-1)、B族Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class B type 1，SR-B1)、CD147、酪氨酸蛋白激酶受體UFO(tyrosine-protein kinase receptor UFO，AXL)等膜蛋白結合，并由弗林蛋白酶(furin)、跨膜絲氨酸蛋白酶2 (transmembrane serine protease 2，TMPRSS2)、組織蛋白酶B (Cathepsin B，CatB)、組織蛋白酶L (Cathepsin C，CatL)等蛋白酶對S蛋白進行切割激活，進而發(fā)生膜融合，使得SARS-CoV-2能夠進入細胞(Fig 1)。

Fig 1 Replication cycle of SARS-CoV-2

1.1 刺突蛋白S蛋白由同源三聚體組成，其單體被分為S1亞基和S2亞基兩個部分。S1亞基包含N末端域(N-terminal domain，NTD)、受體結合域( receptor binding domain，RBD)、亞區(qū)域1 (subdomain 1，SD1)和亞區(qū)域2 (subdomain 2，SD2)。S2亞基包含融合肽(fusion peptide，F(xiàn)P)、七肽重復序列1 (heptad repeat 1，HR1)、七肽重復序列2 (heptad repeat 2，HR2)、跨膜結構域( transmembrane region，TM)和胞質(zhì)結構域(intracellular domain，IC)。

與SARS-CoV類似，SARS-CoV-2以RBD作為與細胞膜上功能性受體ACE2結合的主要區(qū)域[3]。由于SARS-CoV-2與ACE2的接觸面積更大，在促進蛋白間原子互作的同時保持了兩者結合的穩(wěn)定性，使得SARS-CoV-2與ACE2的結合親和力較SARS-CoV更高[3]。通常情況下，S蛋白的RBD隱藏在其內(nèi)部，當S蛋白發(fā)生構象改變使得RBD暴露在S蛋白表面時，S蛋白才能與ACE2結合[4]。

S蛋白結合受體后，S2亞基介導膜融合發(fā)生。由于S2亞基位于S蛋白的中部，在膜融合發(fā)生前需要宿主細胞內(nèi)TMPRSS2或CatB/L對S蛋白進行切割釋放S2亞基[5]。隨后，S2亞基的HR1和HR2通過互相識別并形成六螺旋束，促使病毒囊膜與細胞膜或內(nèi)體膜緊密結合繼而發(fā)生膜融合。

1.2 細胞膜表面受體ACE2作為SARS-CoV-2的功能性受體通常保持二聚體形態(tài)，其與S蛋白的結合是一動態(tài)過程。ACE2偏好與開放構象的S蛋白結合，同時ACE2與S蛋白的結合能促進S蛋白形成更為開放的構象[6]。除ACE2外，另外一些分子也可能參與了SARS-CoV-2進入細胞的過程。

有研究證明HS能與SARS-CoV-2 S蛋白的RBD結合并由此促進S蛋白與ACE2的結合，進而增加吸附于細胞表面的病毒數(shù)量，促進病毒進入細胞[7]。NRP-1能與S蛋白的S1亞基結合并增強病毒進入細胞及感染細胞的能力，但僅當ACE2存在時NRP-1才可促進病毒進入細胞[8]。SR-B1是在多種細胞上表達的高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)受體，SARS-CoV-2 S蛋白能通過NTD與HDL結合，隨后借助HDL間接與SR-B1發(fā)生互作。但與NRP-1類似，SR-B1促進SARS-CoV-2吸附并進入細胞需要ACE2的幫助[9]。此外，AXL能與SARS-CoV-2的NTD結合而有效促進病毒進入細胞，這一受體在病毒進入人肺上皮細胞時至關重要[10]。除上述分子外，Wang等[11]研究表明CD147是能與SARS-CoV-2 RBD區(qū)域結合的細胞表面蛋白，通過介導內(nèi)吞作用促進病毒進入細胞，可作為ACE2的替代受體有效促進病毒感染 。

綜上，ACE2是SARS-CoV-2的功能性受體，HS、SR-B1、NRP-1等作為潛在輔助受體，其中HS促進病毒吸附，NRP-1促進病毒進入細胞，SR-B1則起到雙重作用。此外，CD147、AXL則是除ACE2外病毒進入細胞的膜表面蛋白。除上述受體外，SARS-CoV-2還能與細胞膜表面的許多分子進行結合，其受體偏好性仍待進一步探究。

1.3 輔助蛋白在SARS-CoV-2進入細胞的過程中，宿主細胞蛋白酶對病毒的進入起到重要作用。TMPRSS2通過切割S蛋白FP區(qū)域前S2’位點而促進病毒囊膜與細胞膜的融合，TMPRSS家族的成員同時表達能促進SARS-CoV-2的感染[5]。存在于次級內(nèi)體或溶酶體膜上的CatB和CatL在病毒進入細胞時能對S蛋白進行切割激活，使病毒顆粒釋放到細胞質(zhì)中，其中CatL對SARS-CoV-2的進入起主要的作用[5]。弗林蛋白酶在細胞內(nèi)分布范圍廣，它通過切割S蛋白的S1/S2位點，使S蛋白呈現(xiàn)開放構象達到預激活S蛋白目的，促進病毒與細胞結合并使得感染細胞形成合胞體[12]。除弗林蛋白酶外，胰蛋白酶也能夠有效切割S1/S2位點，但無胰蛋白酶存在時病毒仍能進行膜融合步驟，因此，胰蛋白酶在病毒感染細胞中的作用有待明確。

2 靶向刺突蛋白(S)的抑制劑

2.1 蛋白多肽抑制劑當前，靶向S蛋白的多肽抑制劑(Tab 1)主要可分為兩類，一類以RBD為靶點阻斷病毒與受體的結合，一類以HR1為靶點阻斷病毒的膜融合。

Tab 1 Peptidic inhibitors of spike protein

以RBD為靶點的多肽抑制劑包括兩類，一類基于ACE2設計，另一類則從頭合成。人源化可溶性ACE2 (human recombinant soluble ACE2，hrsACE2)通過重組表達ACE2蛋白獲得，最初主要用于降低血管緊張素2水平并減少急性肺損傷。將hrsACE2用于治療COVID-19時，hrsACE2有效降低了血漿中病毒載量及炎癥因子的水平，同時對肺等臟器起到了一定的保護作用，患者并未出現(xiàn)嚴重不良反應，具有良好的臨床治療潛力[13]。由于ACE2肽酶區(qū)域的α螺旋是RBD結合的重要區(qū)域，根據(jù)這一序列合成的多肽能與RBD結合從而抑制病毒吸附與細胞表面?；谶@一原理，Zhang等[14]合成了與RBD具微摩爾親和力的多肽SBP1 。隨后，Cao等[15]以同一原理設計得到多肽AHB1和AHB2，對SARS-CoV-2表現(xiàn)出較好親和力，但Cao等[15]采用從頭合成的方法得到的多肽LCB1和LCB3能以更高的親和力結合病毒并抑制病毒進入細胞。因此與基于ACE2序列開發(fā)的多肽相比較而言，從頭合成的多肽抗病毒活性更佳，表明從頭合成的抑制多肽更具治療潛力。除從頭合成外，Zhao等[16]將抗病毒多肽P9R進行交聯(lián)獲得的多肽8P9R與病毒的結合能力更強，其抗病毒活性更高。因此，將單個多肽交聯(lián)形成多聚體是多肽抑制劑改進的有效方式。

阻斷病毒膜融合發(fā)生的進入抑制多肽是對HR2的氨基酸序列進行修飾后得到的。由于冠狀病毒的S2亞基高度保守，因此基于HCoV-OC43 HR2開發(fā)的多肽抑制劑EK1能有效抑制SARS-CoV-2的感染[17]。隨后基于EK1修飾得到的HR2P[17]、EK1C4[18]則對病毒感染表現(xiàn)出更強的抑制作用，表明氨基酸修飾和脂類修飾是改善多肽進入抑制劑抗病毒效果的有效方式。膽固醇修飾后的多肽IPB02具有比未修飾多肽IBP01更好的抗病毒效果，這可能是由于SARS-CoV-2的S蛋白除NTD外，其RBD區(qū)域或許也能與脂類結合，因此脂類修飾能夠提高肽段的抗病毒活性[19]。但這些肽類藥物的安全性如何仍需進一步的驗證。

2.2 小分子抑制劑用作抗凝劑的肝素( heparin ) (IC50=5.99 μmol·L-1)以及用于預防和治療靜脈血栓及肺栓塞的依諾肝素( enoxaparin ) (IC50=1.08 mmol·L-1)，能夠模仿SARS-CoV-2進入細胞所需蛋白HS而與S蛋白RBD區(qū)域競爭性結合，抑制病毒與細胞膜表面受體結合。同時這兩種小分子化合物能與S2水解切割位點進行互作，進一步抑制S蛋白的膜融合步驟[7]。已證明使用肝素對COVID-19患者進行治療能有效降低患者的死亡率，減少感染引起的血栓形成，但尚未有證據(jù)顯示肝素能直接對病毒起效而降低患者的死亡率[20]。此外，肝素及依諾肝素在治療過程中會提高患者出現(xiàn)大出血癥狀的概率，需要謹慎使用[20]。

3 靶向細胞受體的抑制劑

3.1 靶向ACE2的抑制劑作為SARS-CoV-2主要受體，靶向ACE2進行SARS-CoV-2感染的治療是一個有效途徑。但ACE2表達在一定程度上使得人體組織器官免受炎癥損傷。因此，靶向ACE2進行COVID-19治療仍需慎重考慮。

氯碘羥喹(clioquinol)被用于研究及治療前列腺癌和神經(jīng)退行性疾病，氯碘羥喹(EC50=12.62 μmol·L-1)及其類似物CLBQ14(EC50=14.69 μmol·L-1)、CLCQ(EC50=16.30 μmol·L-1)，能與S蛋白競爭性結合ACE2從而有效抑制SARS-CoV-2對細胞的感染[21]，但這一化合物在體內(nèi)抗病毒效果如何尚待進一步研究。達巴萬星(dabavancin)是一種糖肽類抗生素，已被美國FDA批準上市用于治療革蘭氏陽性菌導致的皮膚感染性疾病。我們的研究表明，達巴萬星能直接與ACE2結合從而抑制病毒S蛋白與ACE2的互作。這一抗生素藥物在細胞水平(EC50=12 nmol·L-1)及兩種動物模型中均具有良好的抑制病毒效果，且對肺等臟器發(fā)揮了保護作用，具有進入臨床試驗的良好潛力[22]。

3.2 其他除ACE2外，HS、NRP1、SR-B1、CD147和AXL是近期發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-2進入細胞相關膜蛋白，由于這些蛋白與SARS-CoV-2的相互作用剛發(fā)現(xiàn)，尚未針對這些靶標進行專一性抗病毒藥物的研究。但已有研究顯示，以這些蛋白作為靶點可得到有效的病毒抑制劑。例如，抗腫瘤藥物米托蒽醌(mitoxantrone)能與HS結合并抑制HS依賴的內(nèi)吞作用，從而阻斷病毒進入細胞[7]。但米托蒽醌使用后會引起消化系統(tǒng)不適、降低血小板和白細胞數(shù)量，且具有一定心臟毒性，在用于COVID-19臨床治療前需謹慎評估。

4 靶向SARS-CoV-2輔助蛋白的抑制劑

4.1 靶向TMPRSS2的抑制劑當前，靶向TMPRSS2治療COVID-19的小分子化合物包括卡莫司他(camostat mesylate)和萘莫司他(nafamostat mesylate)。卡莫司他在日本被用于治療慢性胰腺炎及反流性食管炎，是跨膜絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑，已被證明能夠有效地抑制SARS-CoV-2的進入[5]。萘莫司他在日本被用于治療急性胰腺炎和彌散性血管內(nèi)凝血，與卡莫司他類似，萘莫司他也通過結合TMPRSS2而抑制SARS-CoV-2進入細胞。同等濃度下，萘莫司他的體外抗病毒效果比卡莫司他好[23]。將這兩種藥物用于治療COVID-19患者，會導致腦出血、過敏反應、心臟驟停等[24]，因此將這兩種藥物用于COVID-19的治療尚需評估。

由于SARS-CoV-2可通過兩種不同途徑進入細胞，因此，僅當病毒是通過與細胞膜發(fā)生膜融合進入細胞時，TMPRSS2抑制劑才能對病毒發(fā)揮有效的抑制作用。在以內(nèi)吞為病毒進入途徑的Vero E6細胞中，TMPRSS2抑制劑無法抑制病毒感染細胞，但在以細胞膜膜融合為病毒進入途徑的Calu-3、Caco2細胞中，TMPRSS2抑制劑對病毒具良好抑制效果[5]。因此，TMPRSS2抑制劑是否可作為有效的臨床藥物進行廣泛應用，尚待進一步驗證。

4.2 靶向CatB/L的抑制劑由于組織蛋白酶主要存在于內(nèi)體、溶酶體等細胞器中，因此組織蛋白酶抑制劑對病毒的抑制效果僅在病毒以內(nèi)吞為主要進入途徑的細胞系中起效。阿洛司他丁(aloxistatin, E-64d)是一種已知的CatB/L抑制劑，在Vero E6細胞、HEK 293 / hACE2細胞中被證實能夠有效抑制SARS-CoV-2的進入[5]。但這一化合物尚未進入臨床試驗，要將其應用到COVID-19的治療中存在一定的困難。替考拉寧(teicoplanin) (EC50=1.66 μmol·L-1)主要被用于治療葡萄球菌感染，人體對該藥物的耐受性良好，使用后僅少數(shù)人群會出現(xiàn)過敏等不良反應。替考拉寧能通過抑制CatL對內(nèi)體中病毒S蛋白的酶切激活而抑制病毒的膜融合過程，阻止SARS-CoV-2感染細胞[25]，但當前尚未將替考拉寧應用至COVID-19的臨床治療中。

CatB/L的酶活性受到內(nèi)體的PH值的影響，因此對內(nèi)體pH值有影響的化合物能在一定程度上對病毒感染起到抑制作用。阿比朵爾(arbidol)是一種抗流感病毒的藥物，已在體外證明其能有效阻止SARS-CoV-2進入細胞并抑制病毒在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(EC50=4.11 μmol·L-1)[16]。先前猜測阿比朵爾可能通過與SARS-CoV-2的S蛋白進行結合而發(fā)揮活性，但最近的研究顯示，阿比朵爾主要通過改變內(nèi)體pH,調(diào)節(jié)CatB/L的酶活性而起效[16]。阿比朵爾在用于治療COVID-19是能顯著降低病毒載量，個別患者出現(xiàn)白細胞數(shù)量激增，但經(jīng)治療后可恢復，未出現(xiàn)嚴重不良反應[26]。但阿比朵爾并未進行大規(guī)模臨床試驗評估，其療效尚待進一步確定。氯喹和羥氯喹作為抗瘧疾藥物被廣泛使用，在新冠疫情爆發(fā)早期就已證實能有效抑制SARS-CoV-2感染細胞。早期猜測氯喹(chloroquine)和羥氯喹(hydroxychloroquine)能通過抑制ACE2糖基化或結合ACE2而起到抗病毒效果，但近期研究證實氯喹和羥氯喹主要通過抑制內(nèi)體酸化而抑制CatB/L的酶活性，進而抑制病毒進入細胞[16]。世界衛(wèi)生組織對氯喹及羥氯喹療效的臨床試驗證明氯喹和羥氯喹并未能對COVID-19起到顯著的治療效果[2]，表明這一類抑制劑的抗病毒活性受到病毒進入細胞方式的影響，在尚不清楚SARS-CoV-2感染人體細胞的具體進入方式前，單獨使用這一類抑制劑并不能取得良好的治療效果。

4.3 靶向furin的抑制劑目前針對furin進行的抗病毒藥物研究較少，但已證實弗林蛋白酶抑制劑CKM(decanoyl-RVKR-chloromethylketone，CMK ) (EC50=0.057 μmol·L-1)能夠有效抑制furin對S蛋白的酶切激活從而抑制病毒進入，具有作為預防藥物的潛力[12]。此外，CKM能夠降低CPE，抑制具感染力的子代病毒的產(chǎn)生，具有一定的治療效果[12]。但弗林蛋白酶抑制劑D6R(hexa-D-arginine amide，D6R)及SSM3 (SSM 3 trifluoroacetate，SSM3)未能阻止S蛋白的酶切激活而對病毒無抑制效果，因此弗林蛋白酶在病毒進入過程中所起的作用尚待進一步明確，以furin為靶點的SARS-CoV-2進入抑制劑仍需進一步研究。

5 結語與展望

進入細胞對病毒而言是極為重要一步，S蛋白作為病毒進入細胞的重要元件，是極易突變的結構蛋白。D614G突變株、A501Y突變株等均具有較原始病毒株更強的傳播能力與感染能力，現(xiàn)有疫苗對突變毒株的預防能力尚待評估，因此仍需加大對COVID-19藥物的研發(fā)力度。進入抑制劑作為能起到治療和預防雙重作用的藥物，具有很高的開發(fā)價值。當前投入COVID-19臨床治療及試驗中的多為已上市藥物或經(jīng)過臨床試驗驗證的藥物。雖然老藥新用是治療COVID-19的一個主要方式，但對天然化合物進行篩選評估仍是開發(fā)進入抑制劑的有效方式。

當前SARS-CoV-2進入抑制劑的開發(fā)還存在許多問題。首先，處于臨床試驗評估的進入抑制劑中，hrsACE2價格較高，卡莫司他、萘莫司他及阿比朵爾的臨床相關實驗尚未得到最終結果且均會導致不良反應的出現(xiàn)，尚無法有效用于COVID-19的治療。其次，隨著研究的深入，SARS-CoV-2的其他受體也被進一步發(fā)現(xiàn)，許多蛋白酶在病毒感染過程中的作用也被進一步明確。同時由于病毒感染是多分子互作的過程，這一過程的復雜性使得針對單個靶點開發(fā)的抑制劑在臨床治療中不一定具有可靠療效，無法進一步推廣。

因此，仍需加大對藥物開發(fā)的力度，并在開發(fā)過程中對藥物進行多層次評估，從而為COVID-19的治療提供依據(jù)。同時，在治療中應將不同靶點的藥物進行聯(lián)用，以達到預期治療效果。