電針對透鏡誘導型近視豚鼠脈絡膜血流和內(nèi)皮素-1及其受體表達的影響

於 亭，魏慧霞，田慶梅，紀海峰，宋繼科,3,4，解孝鋒

0引言

目前我國已成為世界第一近視大國，并且近視已成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。Holden等[1]預測，到2050年，將有47.58億近視患者(占世界人口的49.8%)和9.38億高度近視患者(占世界人口的9.8%)。目前造成近視的原因尚不明確[2]，對近視的治療仍以矯正視力的方法為主，但現(xiàn)有的治療方法尚不能解決近視增長率逐年增加的問題[3]。近視的發(fā)生發(fā)展主要與眼軸過度增長相關，其中脈絡膜作為視網(wǎng)膜和鞏膜之間的高度血管化層，其獨特位置可將視網(wǎng)膜信號傳遞至鞏膜，在近視的發(fā)展中起重要作用[4]。動物實驗[5]及臨床研究[6-7]也已證實脈絡膜與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關。近來在近視研究中發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，在眼軸大于26mm的高度近視患者中內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的血清濃度發(fā)生改變，提示ET-1可能參與近視發(fā)展，但其機制尚未完全明確[8]。而脈絡膜作為眼內(nèi)高度血管化組織可能受到血管收縮因子ET-1的影響參與近視發(fā)生發(fā)展。針刺疏通經(jīng)絡、調暢氣血，使經(jīng)脈之氣血旺盛通達[9]。大量臨床實踐證實，針刺治療近視相比其他治療方案顯示出更加顯著效果[10-14]，但目前針刺治療近視，仍多停留在臨床研究水平，且其效應機制不清楚。本研究擬建立透鏡誘導型近視豚鼠模型，探討近視發(fā)展過程中豚鼠脈絡膜毛細血管血流密度和脈絡膜ET-1及其受體表達變化，并通過電針干預治療初步闡釋其對近視的治療作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選用雄性健康英國種三色短毛豚鼠(濟南西嶺角生物科技有限公司)，體質量100～120g，實驗動物入組前均排除白內(nèi)障、角膜病變、近視等眼病。飼養(yǎng)條件：室溫保持22℃～25℃，予以12h/12h的晝夜節(jié)律，環(huán)境光照300Lx。實驗期間所有豚鼠自由攝食、進水，并給予富含維生素的飼料及新鮮蔬菜等以補充維生素C。實驗中嚴格遵守視覺與眼科動物研究協(xié)會原則，并且經(jīng)山東中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核批準。

1.1.2主要儀器及試劑10g/L鹽酸環(huán)噴脫酯滴眼液(愛爾康中國眼科產(chǎn)品有限公司，北京)；4g/L鹽酸奧布卡因(日本參天制藥株式會社，日本)；組織/細胞RNA快速提取試劑盒、反轉錄試劑盒(含基因組去除劑)、化學修飾熱啟動實時熒光定量PCR試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(思科捷科學儀器有限公司，山東)；ET-1、ETAR、ETBR試劑盒(江萊生物科技有限公司，上海)；ET-1一抗(博奧森生物技術有限公司，北京)；ET-1二抗(思科捷科學儀器有限公司，山東)；熒光倒置顯微鏡(Leica DM IL LED)；帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)；眼科超聲診斷儀(Quantel Medical Ophthalmology公司，法國)；光學相干斷層掃描儀(SpectralisHRA+OCT，海德堡公司，德國)；Elx800 酶標儀(BioTek，美國)；針灸針(華佗牌蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，電子診療儀(華佗牌SDZ-V型，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.2方法

1.2.1造模及分組45只豚鼠，隨機均分為正常對照(normal control，NC)組、透鏡誘導(lens-induced myopia，LIM)組、電針+透鏡誘導(lens-induced myopia+electroacupuncture，LIM+EA)組，每組15只。NC組豚鼠正常飼養(yǎng)，不干預；LIM組豚鼠使用醫(yī)用膠帶將-6.00D透鏡片配戴于豚鼠右眼，以建立近視模型，左眼不干預，見圖1；LIM+EA組在右眼透鏡誘導近視，左眼不干預，同時給予雙側合谷穴和太陽穴針刺，每天固定于上午9∶00開始電針治療，干預30min，早、晚巡視，及時發(fā)現(xiàn)脫落及臟的鏡片，清洗干凈后及時戴上，左眼為自身對照不干預。電針參數(shù)：連續(xù)波，頻率2Hz，強度2mA，脈沖長度0.1s。

1.2.2檢影驗光各組豚鼠于2、4wk行帶狀檢影驗光檢查。檢查前結膜囊內(nèi)用10g/L鹽酸環(huán)噴脫酯滴眼液滴眼3次，每次1滴，間隔10min，滴眼后30min由同一驗光師在暗室中進行檢影驗光，屈光度為垂直和水平兩條主子午線檢驗的平均值。

1.2.3A超檢測眼軸長度由眼科A超測量，檢查前以4g/L鹽酸奧布卡因滴眼液進行表面麻醉。眼科超聲診斷儀參數(shù)設置：前房傳播速度1557m/s，玻璃體傳播速度1540m/s，晶狀體傳播速度1723m/s。測量時探頭垂直角膜平面，且盡可能對準瞳孔中心，不壓迫角膜，取圖形較穩(wěn)定、清晰且晶狀體后囊膜和視網(wǎng)膜雙峰均高于基線為確定圖像，每眼重復測量10次，取平均值。整個過程均由同一技師操作完成。

1.2.4OCTA檢查各組豚鼠于2、4wk行OCTA檢查。檢查前結膜囊內(nèi)用10g/L鹽酸環(huán)噴脫酯滴眼液滴眼3次，每次1滴，間隔10min，滴眼后30min進行檢測。由一人將豚鼠固定于OCT頜架合適位置，另一人按照設備使用方法對豚鼠眼球后極部進行掃描。選擇870nm波長，以視盤中心為中心，選擇1.5mm×3mm大小進行拍攝。脈絡膜毛細血管定義為Bruch膜至膜下20μm，選取圖像質量大于30的圖像，使用Image J 1.8.0軟件進行測量。首先截取圖片，然后將圖片二值化(圖2B)，分析血流面積(圖2中白色高亮部分)與全部面積的比值。每只豚鼠測量3次，取平均值。測量過程均由兩位醫(yī)師在OCT檢查室內(nèi)進行操作完成。

圖2 OCTA圖像 A：以視盤為中心，選擇1.5mm×3mm大小進行檢測；B：脈絡膜毛細血管層血管造影圖像。

1.2.5q-PCR 造模2、4wk后每組隨機選取3只豚鼠，麻醉致死后取出右眼眼球，沿角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體等眼前節(jié)組織，剝離玻璃體，使用虹膜刮去除視網(wǎng)膜，獲取脈絡膜組織。提取總RNA，逆轉錄為cDNA，采用q-PCR技術檢測ET-1、ETAR和ETBR mRNA表達水平，以GAPDH為內(nèi)參基因。利用DNAStar 7.0軟件設計引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。采用2-△△Ct方法對結果進行分析，將NC組目的基因的相對表達量設置為1。

表1 ET-1、ETAR和ETBR引物序列

1.2.6ELISA檢測造模后2、4wk，每組取3只豚鼠，麻醉致死后分離右眼脈絡膜組織。使用液氮研磨，按質量體積比(20mg∶200μL)加入含苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF)的放射免疫沉淀法緩沖液裂解液(radio immunoprecipitation assay buffer,RIPA)，充分勻漿直至裂解完全，14000r/min離心4min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。按照酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒步驟檢測ET-1、ETAR和ETBR蛋白表達水平。

1.2.7免疫組化檢測造模4wk后，每組取3只豚鼠，麻醉致死后在12∶00方向用墨水做標記，分離右眼球，剔除多余組織，置于眼球固定液中固定24h后進行石蠟包埋。于視神經(jīng)前0.5mm處進行5μm切片,梯度乙醇水化,超純水浸泡5min，水浴鍋加檸檬酸鈉抗原修復液(95℃ 15min)進行抗原修復，PBS清洗。正常山羊血清封閉，依次加入一抗(1∶100)、二抗(1∶200)進行孵育，DAB顯色(1min 22s)，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、拍照。以細胞質內(nèi)出現(xiàn)淡黃色或深棕色顆粒沉積者為染色陽性反應。各組豚鼠隨機選取5張切片,每張切片在20倍鏡下隨機采集視野。

2結果

2.1屈光度和眼軸各組右眼屈光度在不同時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(F時間=1230.509，P時間<0.001；F組間=737.843，P組間<0.001；F組間×時間=222.284，P組間×時間<0.001)。造模后2、4wk，與NC組右眼相比，LIM組、LIM+EA組右眼近視屈光度均增加(均P<0.001)。造模后2、4wk，與LIM組右眼相比，LIM+EA組右眼近視屈光度減小(均P<0.01)，見表2。

表2 造模2、4wk后豚鼠屈光度和眼軸比較

各組右眼眼軸在不同時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(F時間=1463.554，P時間<0.001；F組間=52.529，P組間<0.001；F組間×時間=15.150，P組間×時間<0.001)。造模后2、4wk，與NC組右眼相比，LIM組、LIM+EA組右眼眼軸均增加(均P<0.001)。

造模后2、4wk，與LIM組右眼相比，LIM+EA組右眼眼軸均減小(P<0.05，<0.01)，見表2。

2.2脈絡膜毛細血管密度OCTA結果表明，造模2、4wk后，各組脈絡膜毛細血管密度比較，差異均有統(tǒng)計學意義(2wk：F=5.645，P<0.05；4wk：F=16.563，P<0.001)。造模2、4wk后，與NC組(2wk：28.74%±4.11%，4wk：27.64%±2.91%)相比，LIM組右眼脈絡膜毛細血管密度降低(2wk：23.43%±3.9%，P<0.01；4wk：21.29%±2.17%，P<0.001)。造模2、4wk后，與LIM組相比，LIM+EA組右眼脈絡膜毛細血管密度升高(2wk：27.66%±1.43%，P<0.05；4wk：25.28%±2.39%，均P<0.01)。造模2、4wk后，與NC組相比，LIM+EA組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 造模2、4wk時脈絡膜毛細血管密度 aP<0.05，bP<0.01 vs LIM組。

2.3ET-1和ETAR及ETBRmRNA表達水平PCR結果表明，不同時間點各組右眼脈絡膜中ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(2wk：FET-1=15.086，PET-1<0.01；FETAR=7.331，PETAR<0.05；FETBR=9.368，PETBR<0.05；4wk：FET-1=17.844，PET-1<0.01；FETAR=37.084，PETAR<0.001；FETBR=20.153，PETBR<0.05)。造模2、4wk后，與NC組相比，LIM組ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達水平升高(均P<0.05)；與LIM組相比，LIM+EA組ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達水平降低(2wk：ETAR，P>0.05；其余均為P<0.05)；與NC組相比，LIM+EA組ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖4 造模2、4wk時ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達水平 aP<0.05，bP<0.01 vs LIM組。

2.4ET-1和ETAR及ETBR蛋白表達水平ELISA結果表明，不同時間點各組右眼脈絡膜中ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(2wk：FET-1=15.464，PET-1<0.01；FETAR=6.098，PETAR<0.05；FETBR=15.988，PETBR<0.01；4wk：FET-1=25.829，PET-1<0.01；FETAR=49.759，PETAR<0.001；FETBR=12.391，PETBR<0.01)。造模后2、4wk，與NC組相比，LIM組右眼脈絡膜中ET-1、ETAR、ETBR蛋白表達水平升高(均P<0.05)；與LIM組相比，LIM+EA組ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表達水平降低(2wk：ETAR，P>0.05；其余均為P<0.05)；與NC組相比，LIM+EA組ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 造模2、4wk后脈絡膜ET-1、ETAR、ETBR蛋白表達水平

2.5免疫組化檢測脈絡膜ET-1蛋白造模后4wk可見，ET-1免疫陽性反應呈棕色,脈絡膜胞質內(nèi)表達。NC組中脈絡膜ET-1免疫反應呈棕色，且血管排列整齊有序；LIM組中脈絡膜ET-1免疫反應較強，著色較深，且血管排列紊亂不齊；LIM+EA組中脈絡膜ET-1免疫反應呈棕色，且血管排列相對整齊，見圖5。

圖5 造模后4wk時ET-1蛋白在脈絡膜中的表達 A：NC組；B：LIM組；C：LIM+EA組。

3討論

豚鼠屬于哺乳動物，由于其屈光狀態(tài)、正視化機制與人類相似，常用于制作近視模型[10-11]，并且豚鼠透鏡誘導型模型已廣泛應用于近視的實驗研究。本實驗采用負透鏡誘導豚鼠制備近視模型，研究模擬人眼在近距離工作狀態(tài)下近視發(fā)生發(fā)展中的作用，為本研究奠定了模型基礎。

ET-1是于1988年首次從豬主動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)上清液中分離出來一種有效的血管收縮劑[15]，是評估眼內(nèi)血動力的有用標志，在角膜上皮、睫狀體、脈絡膜以及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中均有表達[16]。近來，有研究報道發(fā)現(xiàn)ET-1含量在高度近視兒童和青少年血清中含量發(fā)生改變[8]。與眼軸小于26mm的近視患者相比，在眼軸大于26mm的患者中發(fā)現(xiàn)ET-1血清濃度顯著降低，并且ET-1濃度與眼軸長度呈弱負相關，提示ET-1的水平變化可能影響近視發(fā)展[8]。ET-1屬于內(nèi)源性血管收縮因子，是評估眼內(nèi)血流動力學的有用標志物，并且ET-1在眼內(nèi)分布廣泛，脈絡膜中水平最高[17]。ET-1主要通過與ETAR和ETBR結合而發(fā)揮血管收縮作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)ET-1可以通過調節(jié)眼收縮，以調節(jié)視網(wǎng)膜血流[8]。而豚鼠作為無視網(wǎng)膜血管哺乳動物[18]，其血液以及氧氣供應的主要來源是脈絡膜[4]。研究已發(fā)現(xiàn)，向健康男性注射ET-1后會降低脈絡膜的血流[19]。并且越來越多的證據(jù)也表明近視發(fā)展過程中脈絡膜血流會降低[6,20-21]。提示ET-1可能會通過影響脈絡膜血流參與近視的發(fā)生發(fā)展。而在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在近視發(fā)展過程中，隨著脈絡膜毛細血管密度降低，血流下降的同時ET-1表達水平明顯上調，符合我們的猜測。

在解剖學上，脈絡膜是由毛細血管和中大血管組成，其中血管是不斷暴露于脈動血流和壓力引起的各種類型的血動力中，而作為與血液直接接觸的單層，血管內(nèi)皮細胞承受著大部分流體剪切應力[22]。剪切力可以通過刺激血管擴張劑的產(chǎn)生對血管內(nèi)皮產(chǎn)生保護作用[23]，并且研究發(fā)現(xiàn)剪切力的變化會改變ET-1的表達[24]。先前已有研究報道，脈絡膜毛細血管的血流與近視程度負相關[25]。此外，Zhang等[5]在近視豚鼠中發(fā)現(xiàn)，隨著近視程度的加深脈絡膜血流逐漸降低，而Gupta等[20]在人類高度近視眼中也發(fā)現(xiàn)脈絡膜血管成分的減少。Al-Sheikh等[6]研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，在近視眼中脈絡膜毛細血管血流面積顯著降低。Milani等[26]在高度近視患者中也發(fā)現(xiàn)，脈絡膜毛細血管灌注區(qū)減少，脈絡膜毛細血管密度降低。提示脈絡膜毛細血管密度與近視密切相關。本實驗也證實在近視發(fā)展中脈絡膜毛細血管密度降低。而脈絡膜血流的減少會影響血管剪切力，這可能會影響ET-1的表達。在本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著近視的發(fā)生發(fā)展脈絡膜變薄，ET-1及其受體表達水平明顯上調，可能是ET-1通過與ETAR和ETBR結合引起了脈絡膜血管的收縮，導致脈絡膜血流降低影響近視的發(fā)展。

目前對于近視的治療手段十分有限，而針刺在臨床[12-13]和動物[10-11]中已證實可以改善近視發(fā)展，但具體機制尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)針刺后可以降低眼周血管平滑肌緊張度，解除睫狀肌痙攣，加快血流速度，改善消除缺血和缺氧狀態(tài)，而有利于眼緩解視疲勞癥狀[12]。因此，我們猜測電針可以改善脈絡膜血液循環(huán)。

脈絡膜主要是處于交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)調控之下[27]。目前研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物和鳥類的脈絡膜主要分布三種神經(jīng)纖維：(1)來自翼腭神經(jīng)節(jié)(pterygopalatine ganglion，PPG)和睫狀神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生的副交感神經(jīng)纖維；(2)來自頸上神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生的交感神經(jīng)纖維；(3)來自三叉神經(jīng)節(jié)的感覺纖維。其中哺乳動物中的PPG是從面部核運動復合物的唾液上核(superior salivatory nucleus,SSN)接收輸入的[28]。Linder[29]在出血性低血壓兔子中發(fā)現(xiàn)，面部神經(jīng)刺激可使脈絡膜血流升高。先前的研究也表明，下丘腦支核的血液壓力敏感位點可輸入到SSN的脈絡膜神經(jīng)元，由SSN-PPG通路介導部分對脈絡膜血管舒張性補償[27]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)電針刺激大鼠脈絡膜血管的副交感神經(jīng)節(jié)前纖維細胞體的SSN,可使眼底血流增加[30]。提示，電針可通過SSN-PPG通路提高近視發(fā)展中的脈絡膜血流。因此，我們猜測電針干預治療后，通過SSN-PPG通路改善了脈絡膜的血流，影響了血管剪切力下調ET-1及其受體含量，延緩近視的發(fā)生發(fā)展。本研究中，我們也觀察到電針干預后脈絡膜毛細血管血流密度上升，改善了脈絡膜血流，下調ET-1及其受體含量。然而，具體信號分子及發(fā)展機制尚未完全明確，仍需進一步研究。其中，脈絡膜血流將是我們今后研究的重點，不斷探索電針治療近視與脈絡膜血流變化之間的內(nèi)在相關性，為近視的治療提供有效的分子生物學基礎。