約氏瘧原蟲與伯氏瘧原蟲誘導(dǎo)感染小鼠產(chǎn)生保護(hù)性抗體的特點(diǎn)研究

丁 祎， 張銘宇， 龐 維， 鄭 麗， 曹雅明

(中國醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，遼寧 沈陽 110122)

瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的威脅人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲感染性疾病[1]。隨著氯喹、青蒿素等一線抗瘧藥物的普遍應(yīng)用，瘧疾得到了很好地控制[2-5]。但是流行區(qū)人群普遍存在的混合感染，以及難以抵御瘧原蟲的再次感染，成為根除瘧疾的一大難點(diǎn)。瘧原蟲保護(hù)性免疫的研究證實(shí)，感染早期宿主建立Th1型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生IFN-γ和NO，巨噬細(xì)胞活化等免疫效應(yīng)，能夠控制感染早期瘧原血癥的增長(zhǎng)。感染后期向Th2型免疫應(yīng)答的過度，是宿主根除瘧原蟲的關(guān)鍵[6]?？贵w是獲得性免疫的主要組成成分，在保護(hù)機(jī)體抵抗瘧原蟲感染中起重要的作用。瘧原蟲感染宿主后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量針對(duì)瘧原蟲的特異性抗體，抗體水平、時(shí)間的維持，以及是否產(chǎn)生以拮抗瘧原蟲侵入為主要功能的抗體，可能是決定宿主抵抗瘧原蟲感染的根本原因[7]?？贵w也是再次免疫應(yīng)答的重要免疫分子，在抵抗瘧原蟲再次感染以及交叉感染中發(fā)揮重要作用[8-9]。流行區(qū)患者對(duì)瘧原蟲再次感染以及交叉感染抵御能力不足，可能與宿主產(chǎn)生的抗瘧原蟲特異性抗體的類型與種類有關(guān)。對(duì)宿主特異性抗體特點(diǎn)的研究，確定感染過程中蟲體作為重要微生物抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的差異，無疑為瘧疾感染保護(hù)性免疫應(yīng)答的闡明提供重要的理論依據(jù)。本研究運(yùn)用兩種不同蟲株的鼠瘧原蟲(約氏瘧原蟲與伯氏瘧原蟲)分別感染BALB/c小鼠，通過氯喹和青蒿素聯(lián)合應(yīng)用治愈小鼠后，再次感染小鼠，構(gòu)建小鼠同種瘧原蟲感染的二次感染模型。獲得小鼠初次與再次免疫血清，比較抗體產(chǎn)生水平及特點(diǎn)，對(duì)免疫血清中優(yōu)勢(shì)抗體進(jìn)行抗原追蹤，確定誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)抗體的抗原特點(diǎn)，探討抗原對(duì)宿主建立保護(hù)性免疫的影響與意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠及蟲株 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華。約氏瘧原蟲 (Plasmodiumyoelii)(P.y17XL)、伯氏瘧原蟲 (Plasmodiumberghei)(P.bANKA) 由日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑及儀器 96孔酶標(biāo)板、包被液、終止液、5×SDS凝膠加樣緩沖液和Tween-20購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；HRP-Goat antimouse IgG購自AB clonal；甲醇和NaCl購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris、Glycine、SDS和BSA購自美國Genview公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和TMB顯色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Super Signal West Pico試驗(yàn)試劑盒和蛋白Marker購自Thermo；脫脂奶粉購自美國BD公司；酶標(biāo)儀購自BIO-RAD；ECL發(fā)光儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與感染 將BALB/c小鼠按照隨機(jī)原則分為3組。第1組小鼠不做處理，為正常對(duì)照組(Control)；第2組小鼠經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL寄生的紅細(xì)胞；第3組小鼠經(jīng)腹腔感染1×106P.bANKA寄生的紅細(xì)胞。小鼠感染后第5天，進(jìn)行氯喹加青蒿素灌胃治療，感染后不同時(shí)間采取小鼠尾靜脈血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。待鏡檢不能查到感染紅細(xì)胞，計(jì)時(shí)35 d后對(duì)治愈小鼠再次感染同種瘧原蟲，構(gòu)建鼠瘧二次感染模型。感染過程中定期尾靜脈采血，獲得免疫血清。

1.2.2 ELISA方法檢測(cè)初次感染和再次感染血清中抗瘧原蟲特異性抗體水平 分別用P.y17XL、P.bANKA抗原5 μg/mL包被酶標(biāo)板100 μL/孔，37 ℃過夜，洗板后5% BSA 300 μL/孔 37 ℃封閉1 h，洗板后加入相應(yīng)的抗血清(1∶200稀釋)100 μL/孔，37 ℃，2 h，PBST洗板后加入HRP羊抗鼠IgG (1∶5 000稀釋)100 μL/孔，37 ℃，1 h，充分洗板加入TMB 200 μL/孔避光30 min后加終止液50 μL/孔，酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)吸光度。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)不同鼠瘧模型免疫血清反應(yīng)模式 10%SDS凝膠中分別加入P.y17XL、P.bANKA蛋白50 μg/孔，電泳50 V，30 min，70 V，2 h，將凝膠安裝至“三明治”裝置后，轉(zhuǎn)膜60 V，2 h，封閉液室溫?fù)u床封閉2 h，TBST洗膜3次后加入相應(yīng)的抗血清(1∶100稀釋)，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜3次后加入HRP羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)，室溫?fù)u床2 h，TBST充分洗膜后，利用HRP-ECL原理發(fā)光。

1.2.4 MSP-1重組蛋白制備 將測(cè)序正確的MSP1-pET28a重組質(zhì)粒在Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。倒置平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取含重組質(zhì)粒的單菌落于3 mL的LB液體培養(yǎng)基(卡那抗性)中，37 ℃搖床培養(yǎng)后，取100 μL菌液接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)后，將100 mL菌液加入到2 000 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至OD600約0.6，降低培養(yǎng)溫度到30 ℃，加入適量的IPTG(0.5 mmol)繼續(xù)震蕩培養(yǎng)3～4 h。8 000 r/min離心3 min收集菌體，重懸于50 mL預(yù)冷NTA-0緩沖液中，冰浴30 min。超聲破碎菌體，參數(shù)設(shè)置為功率200 W、工作3 s、暫停4 s、時(shí)間25～30 min。16 000 r/min,4 ℃離心50 min，收集上清及沉淀。上清蛋白溶液用0.22 μm過濾器過濾備用：準(zhǔn)備Ni-NTA柱以1 mL/min的流速上樣上清蛋白溶液，以NTA-0緩沖液(pH 8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250檢測(cè)液不變色)；分別以20、60、200和500 mmol咪唑洗脫，分段收集洗脫液至G250檢測(cè)液不變色；以3倍柱體積去離子水洗滌柱料，以20%乙醇封柱；對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.5 質(zhì)譜鑒定(LC/MS/MS or Q-E) 將伯氏瘧原蟲全蟲蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,將55 kD目的條帶切下交由華大公司使用Easy-nLC 1 200液相系統(tǒng)、高pH分離液相色譜儀等進(jìn)行了質(zhì)譜驗(yàn)證。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad PRISM TM對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。2組比較用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，3組以上數(shù)據(jù)運(yùn)用one-way ANOVA檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.y 17XL、P.b ANKA初次感染和再次感染小鼠原蟲血癥和生存率

P.y17XL初次感染后第3天小鼠原蟲血癥逐步升高，至第6天原蟲血癥達(dá)到50%。P.y17XL再次感染治愈小鼠，小鼠外周血中無瘧原蟲感染的紅細(xì)胞(圖1A)。P.bANKA初次感染后第3天小鼠原蟲血癥開始增高，至第12天原蟲血癥達(dá)到60%。P.bANKA再次感染小鼠后第4天外周血中可見瘧原蟲感染的紅細(xì)胞，感染后第5至8天原蟲血癥低于P.bANKA初次感染組(P<0.05)。P.bANKA再次感染后第9至10天原蟲血癥下降，第10至15天原蟲血癥增高并維持在50%～60%(圖1B)。P.y17XL初次感染后第5天小鼠開始出現(xiàn)死亡，至第7天時(shí)全部死亡。P.y17XL再次感染后小鼠全部存活(圖1C)。P.bANKA初次感染后第8天小鼠開始出現(xiàn)死亡，至第12天小鼠全部死亡。P.bANKA再次感染后第11天小鼠開始出現(xiàn)死亡，至第15天小鼠全部死亡(圖1D)。

2.2 加強(qiáng)免疫應(yīng)答的存在

小鼠治愈后再次感染P.bANKA獲得的二次免疫血清與P.bANKA全蟲抗原具有較好的免疫反應(yīng)性，與未感染小鼠血清、一次免疫血清都具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。P.y17XL初次感染小鼠后獲得的一次免疫血清與P.y17XL全蟲抗原有較好的免疫反應(yīng)，和未感染小鼠血清相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，小鼠治愈后再次感染P.y17XL獲得的二次免疫血清不僅同未感染小鼠血清相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，同初次感染血清相比也有顯著差異(P<0.01)。

2.3 免疫血清與全蟲抗原反應(yīng)的免疫條帶特點(diǎn)

P.y17XL再次感染小鼠獲得的二次免疫血清與P.y17XL全蟲抗原反應(yīng)后在分子量40 kD附近出現(xiàn)主要反應(yīng)條帶。P.bANKA再感染獲得的二次免疫血清與P.bANKA全蟲抗原反應(yīng)后在35～55 kDa范圍內(nèi)出現(xiàn)了3條主要反應(yīng)條帶(圖3A)。MSP-1與AMA-1是目前研究瘧原蟲紅內(nèi)期的領(lǐng)軍蟲體抗原，通過全蟲抗原與抗MSP-1和抗AMA-1抗體反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，P.y17XL感染小鼠獲得的免疫血清同抗MSP-1抗體具有相似的反應(yīng)條帶，提示P.y17XL感染小鼠刺激免疫系統(tǒng)后誘導(dǎo)了大量針對(duì)MSP-1的抗體，而P.bANKA感染小鼠誘導(dǎo)的免疫血清反應(yīng)模式同P.y17XL截然不同，對(duì)這3條主要反應(yīng)條帶55、40以及35 kD進(jìn)行灰度值測(cè)定，比較3條條帶的反應(yīng)強(qiáng)度，但未見有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)，提示P.bANKA具有多種蟲體抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)特異性抗體的特點(diǎn)，40 kD附近條帶可能為抗MSP-1反應(yīng)條帶，但抗MSP-1抗體不是P.bANKA免疫血清中的優(yōu)勢(shì)抗體。

圖1 P.y 17XL、P.b ANKA初次感染和再次感染小鼠瘧原血癥和生存率Fig.1 Parasitemia and survival rate of mice infected with P.y 17XL and P.b ANKA in primary and secondary infection A：P.y 17XL初次感染和再次感染的瘧原蟲血癥;B：P.b ANKA初次感染和再次感染的原蟲血癥;C：P.y 17XL初次感染和再次感染的生存率;D：P.b ANKA初次感染和再次感染的生存率;*：P<0.05 A：The parasitemia of mice infected with P.y 17XL in primary and secondary infections;B：The parasitemia of mice infected with P.b ANKA in primary and secondary infections;C：The survival of mice infected with P.y 17XL in primary and secondary infections;D：The survival of mice infected with P.b ANKA in primary and secondary infections；*：P<0.05

圖2 ELISA檢測(cè)特異性抗體水平Fig.2 ELISA detect specific antibody levels **：與未感組比P<0.01；##：與初感組比P<0.01 **: compared with the uninfluenced group P<0.01 ; ##: compared with the uninfected group P<0.01

圖3 Western Blot檢測(cè)血清中優(yōu)勢(shì)抗體Fig.3 Western Blot detects dominant antibodies in serum A：Western Blot條帶，1: P.y 17XL再感血清與P.y 17XL抗原反應(yīng), 2: P.b ANKA再感血清與P.b ANKA抗原反應(yīng), 3: 兔抗MSP-1抗體與P.y 17XL抗原反應(yīng), 4:兔抗AMA-I抗體與P.y 17XL抗原反應(yīng)；B：灰度值測(cè)量 A：Western Blot bands, 1: P.y 17XL re-infection serum reacts with P.y 17XL antigen, 2: P.b ANKA re-infection serum reacts with P.b ANKA antigen, 3: Rabbit anti-MSP-1 antibody reacts with P.y 17XL antigen, 4: Rabbit anti-AMA-1 antibody reacts with P.y 17XL antigen；B： Dominant band gray value

2.4 P.y 17XL、P.b ANKA與同種MSP-1重組蛋白的反應(yīng)

MSP-1抗原分布于瘧原蟲裂殖子表面，在瘧原蟲裂殖子黏附紅細(xì)胞，侵入紅細(xì)胞等生理功能中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。P.y17XL與P.bANKA感染血清與相應(yīng)的MSP-1重組蛋白反應(yīng)，同時(shí)用未感染血清做對(duì)照發(fā)現(xiàn)同種瘧原蟲感染血清與相應(yīng)重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。3組血清與PyMSP-1重組蛋白反應(yīng)，以P.y17XL感染血清反應(yīng)最強(qiáng)(P<0.01)(圖4A)；而與PbMSP-1重組蛋白反應(yīng)，以P.bANKA感染血清最強(qiáng)(P<0.01)(圖4B)，提示瘧原蟲感染過程中，蟲體MSP-1抗原能夠刺激宿主產(chǎn)生相應(yīng)特異性抗體。

圖4 P.y 17XL、P.b ANKA與同種MSP-1重組蛋白的反應(yīng)Fig.4 Reaction of P.y 17XL and P.b ANKA with the same strain recombinant protein of MSP-1 A：PyMSP-1重組蛋白包板；B：PbMSP-1重組蛋白包板；**: P<0.01 A：PyMSP-1 coating；B：PbMSP-1 coating；**: P<0.01

2.5 P.b ANKA 55 kD蛋白鑒定

P.bANKA再次感染小鼠獲得的二次免疫血清與蟲體蛋白反應(yīng)在55 kD出現(xiàn)主要反應(yīng)條帶，通過質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白鑒定，發(fā)現(xiàn)滿足評(píng)分較高，在瘧原蟲紅內(nèi)期表達(dá)且具有分泌信號(hào)肽或跨膜肽段的抗原有PbANKA_0702800、PbANKA_020920、PbANKA_110220，具有較高可能性刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體(表1)。

表1 伯氏瘧原蟲55 kD蛋白候選抗原預(yù)測(cè)表

3 討 論

瘧疾與結(jié)核病、艾滋病被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為優(yōu)先防御的三大感染性疾病[10-12]。瘧原蟲發(fā)育過程經(jīng)歷肝內(nèi)期、紅內(nèi)期與蚊內(nèi)期三個(gè)階段，宿主對(duì)紅內(nèi)期瘧原蟲產(chǎn)生的特異性抗體在降低瘧原蟲血癥和抵御重癥瘧疾發(fā)揮重要作用[13-15]。瘧疾流行區(qū)患者的反復(fù)感染以及交叉感染一直都是目前根治瘧疾的重點(diǎn)與難點(diǎn)。在流行區(qū)，交叉反應(yīng)可能在保護(hù)宿主和阻止瘧疾傳播中起重要作用。少數(shù)研究報(bào)道了產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)的交叉反應(yīng)性，但是人們對(duì)交叉反應(yīng)的程度，特別是密切相關(guān)的物種知之甚少。有研究調(diào)查顯示流行區(qū)間日瘧原蟲血液階段抗原特異性抗體對(duì)諾氏瘧原蟲寄生蟲的種間反應(yīng)性和生長(zhǎng)具有抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自免疫動(dòng)物和人類瘧疾患者的針對(duì)間日瘧原蟲抗原的抗體IgG抑制了諾氏瘧原蟲侵襲紅細(xì)胞。在血液階段，抗間日瘧原蟲與諾氏瘧原蟲的抗體之間存在廣泛的交叉反應(yīng)性，并且這些抗體可以有效抑制體外侵襲，從而突出了流行地區(qū)的潛在交叉保護(hù)免疫力[16-18]?？贵w是再次免疫應(yīng)答的重要產(chǎn)物，在瘧疾重復(fù)感染中有重要的作用[19]；由于共同抗原的存在，抗體與不同瘧原蟲蟲株存在一定的交叉反應(yīng)，抗體對(duì)瘧原蟲混合感染以及不同蟲株的感染具有一定的保護(hù)性作用[20]。

本研究對(duì)瘧原蟲同種蟲株建立的再感染模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示瘧原蟲免疫血清與瘧原蟲抗原具有較好的免疫反應(yīng)性，再次應(yīng)答具有顯著的加強(qiáng)效應(yīng)。免疫血清與MSP-1具有較好的反應(yīng)性。免疫血清與瘧原蟲抗原的反應(yīng)模式顯示，P.y17XL主要產(chǎn)生抗MSP-1為主的抗體，這種抗體在宿主抵抗瘧原蟲再感染中發(fā)揮保護(hù)性作用，宿主可完全抵抗同蟲株瘧原蟲再感染。P.bANKA除了產(chǎn)生抗MSP-1抗體之外，免疫血清中還具有其他抗瘧原蟲抗體，因此有效抵抗瘧原蟲的保護(hù)性抗體水平降低，宿主不能抵抗P.bANKA的再次感染，這也可能是P.bANKA再感染模型瘧原蟲血癥稍微降低以及生存期得到較短延長(zhǎng)的原因?？贵w在瘧原蟲再感染的保護(hù)性免疫中起至關(guān)重要的作用；對(duì)流行區(qū)患者抗體模式的驗(yàn)證以及誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生有效抗體無疑為構(gòu)建瘧疾疫苗提供有效的實(shí)驗(yàn)性數(shù)據(jù)。