龍珠果莖段離體培養(yǎng)和組培苗耐鹽性分析

劉艷艷, 司燦, 何春梅, 俞振明, 段俊*

龍珠果莖段離體培養(yǎng)和組培苗耐鹽性分析

劉艷艷1,2, 司燦2, 何春梅2, 俞振明2, 段俊2*

(1. 廣州花卉研究中心, 廣州 510360; 2. 中國科學(xué)院華南植物園, 廣東省應(yīng)用植物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院華南農(nóng)業(yè)植物分子分析與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510650)

為建立龍珠果()的快繁再生體系，以實(shí)生苗莖段為外植體，研究了植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽誘導(dǎo)、壯苗生根的影響，同時(shí)對(duì)組培苗的耐鹽性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)叢生芽并促進(jìn)芽的生長；MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)愈傷組織；1/2 MS+IBA 0.2mg/L培養(yǎng)基適合小芽壯苗生根。組培苗移栽至泥炭土∶蛭石∶珍珠巖(2∶1∶1)的基質(zhì)中，成活率可達(dá)92.6%，且植株生長良好。0～200 mmol/L NaCl處理的組培苗生長不受影響；超過200 mmol/L NaCl處理，植株出現(xiàn)矮化、葉片萎蔫、變黃等現(xiàn)象。隨NaCl濃度升高，葉片的SOD活性逐漸升高，POD、CAT和APX活性則呈先升高后降低的趨勢(shì)。這為龍珠果的種苗繁育、海濱生態(tài)修復(fù)提供了技術(shù)支持。

龍珠果；莖段；叢生芽；愈傷組織；鹽脅迫

龍珠果()，別名香花果、天仙果、野仙桃等，為西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬草質(zhì)藤本植物。原產(chǎn)于西印度群島，在我國主要分布于廣東、海南、福建和臺(tái)灣等地，生長于荒山草坡、灌叢或近海邊沙灘[1]。龍珠果花朵秀麗，顏色多變；果實(shí)外形美觀，香甜可食[2]。

龍珠果莖桿和葉片中含有黃酮類化合物，主要成分為牡荊素、異牡荊素、葒草素，異葒草素等[3]。龍珠果具有清熱解毒、清肺止咳的作用，可用于治療肺熱咳嗽、小便混濁、癰瘡腫毒、外傷性眼角膜炎、淋巴結(jié)炎等癥[4–5]。果實(shí)可用作催吐劑，煎煮后可用于治療哮喘；葉片外敷可治療創(chuàng)傷，干燥葉片泡茶有助于提高睡眠質(zhì)量；根可用于調(diào)經(jīng)，對(duì)治療過度興奮和暴躁有作用[6]。

龍珠果的自然繁殖方式是種子繁殖，但種子萌發(fā)率低、繁殖周期長。關(guān)于龍珠果組織培養(yǎng)技術(shù), 國內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文以龍珠果帶節(jié)莖段為外植體，通過調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，探討適合叢生芽誘導(dǎo)、壯苗生根、煉苗移栽等階段的培養(yǎng)基，為龍珠果直接器官發(fā)生體系的建立提供試驗(yàn)依據(jù)。龍珠果作為一種海濱植物，多生長于高鹽環(huán)境，組培苗的耐鹽程度是其能否在海濱環(huán)境成活的重要指標(biāo)，通過對(duì)2月齡組培苗進(jìn)行鹽脅迫處理,探討其對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)程度。

1 材料和方法

1.1 材料

龍珠果()種子發(fā)芽后種植在中國科學(xué)院華南植物園生物技術(shù)育種實(shí)驗(yàn)室。3個(gè)月后苗高約12 cm，選取生長健壯、長勢(shì)基本一致的植株，截取帶節(jié)的莖段用于組織培養(yǎng)。取移栽至基質(zhì)中生長2個(gè)月長勢(shì)基本一致的組培苗用于鹽脅迫試驗(yàn)。

1.2 組織培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基[7]，pH 5.7。培養(yǎng)條件: (25± 2)℃、光照強(qiáng)度32.57mol/(m2·s)、12 h光照/12 h黑暗。將清洗過的龍珠果莖段置于超凈工作臺(tái)上, 用75%酒精浸泡約30 s，無菌水清洗2～3次，然后用0.1% HgCl2浸泡5 min，最后無菌水沖洗4～5次。將消毒過的莖段切成約2 cm帶節(jié)點(diǎn)小段，插入在已滅菌的培養(yǎng)基中。

植物生長調(diào)節(jié)劑組合的影響 將帶節(jié)莖段接種于添加不同質(zhì)量濃度的6-BA (0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L)與IBA (0.05、0.1、0.2、0.3 mg/L)或NAA (0.05、0.1、0.2、0.3 mg/L)組合的MS培養(yǎng)基中, 以不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基為對(duì)照。每處理接種5瓶，每瓶15個(gè)莖段。40 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率、芽分化率、愈傷組織誘導(dǎo)率等。叢生芽誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出芽或芽點(diǎn)的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù)×100%，芽分化率(%)=分化出芽的數(shù)量/芽點(diǎn)的總數(shù)×100%，愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出愈傷組織的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù)×100%。

壯苗生根 將誘導(dǎo)出的叢生芽分離，接種于含不同質(zhì)量濃度的NAA (0.05、0.1、0.2 mg/L)和IBA (0.05、0.1、0.2 mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，以1/2MS培養(yǎng)基為對(duì)照。每處理接種8瓶，每瓶3個(gè)小芽。40 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根長、根粗等。生根率(%)=誘導(dǎo)出根的芽數(shù)量/接種芽的總數(shù)×100%。

煉苗移栽 組培苗長至8～12 cm高時(shí)，選擇長勢(shì)旺盛、葉片較多且根系發(fā)育良好的組培苗，打開瓶蓋，轉(zhuǎn)移到自然條件下煉苗1周。小心從組培瓶中取出幼苗，用自來水將根部沖洗干凈，移栽至泥炭土∶蛭石∶珍珠巖為2∶1∶1的基質(zhì)中，共移栽121株。基質(zhì)澆透水，同時(shí)提高空氣濕度，保持適當(dāng)通風(fēng)，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。移栽成活率(%)=成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)×100%。

1.3 鹽脅迫試驗(yàn)

組培苗移栽2個(gè)月后，隔天用不同濃度的NaCl溶液澆灌，共設(shè)6個(gè)處理：0、100、200、400、600、800 mmol/L，以0 mmol/L NaCl為對(duì)照，每處理5株。5 d后每處理分別稱取0.5 g功能葉片(從上向下第二片)，凍存于-80℃冰箱中，3次重復(fù)。

SOD、POD、CAT和APX活性測(cè)定 取出葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入少量的石英砂和5 mL 0.05 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.8，1% PVP, 0.1 mmol/L EDTA)，在冰上迅速研磨成均一渾濁的懸浮液，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中。在4℃，7 104×離心10 min，取上清液，4℃放置。SOD活性采用核黃素-NBT法[8]測(cè)定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[9–10]測(cè)定；CAT活性采用紫外分光光度計(jì)法[11]測(cè)定; APX酶活性采用抗壞血酸氧化法[12]測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)，顯著性分析采用SPSS 22.0中的鄧肯氏多重檢測(cè)法(Dun- can’s multiple range test, DMRT), 以<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果和分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑的影響

莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基后定期觀察，約15 d在節(jié)點(diǎn)處開始長出芽點(diǎn)或小芽，隨后莖段兩端慢慢變黃，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率、芽分化率、愈傷組織誘導(dǎo)率等指標(biāo)(表1和圖1: A)。

培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA,誘導(dǎo)的叢生芽中有14.6%芽長可達(dá)4 cm；隨6-BA、IBA濃度的升高，叢生芽誘導(dǎo)率沒有顯著變化，芽分化率下降，小芽(1 cm長)比例增加。當(dāng)6-BA濃度為3.0 mg/L、IBA濃度為0.3 mg/L時(shí)，芽分化率為2.3%，誘導(dǎo)出的都是小芽。這表明6-BA與IBA組合能誘導(dǎo)出叢生芽或芽點(diǎn)，且隨濃度升高芽分化率降低，小芽比例升高。

培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，叢生芽誘導(dǎo)率為98.7%，4 cm大芽達(dá)9.9%；隨著6-BA、NAA濃度的升高，叢生芽誘導(dǎo)率和芽分化率顯著下降，小芽比例明顯增加，從莖段誘導(dǎo)出有白色愈傷層的淺綠色愈傷組織(圖1: B)，且愈傷組織的數(shù)量隨6-BA、NAA濃度的升高而增多。當(dāng)6- BA濃度為3.0 mg/L、NAA濃度為0.3 mg/L時(shí), 叢生芽誘導(dǎo)率下降為40%，誘導(dǎo)出的全是1 cm小芽，愈傷組織誘導(dǎo)率為59.5%。這表明較低濃度的6-BA與NAA組合有利于莖段誘導(dǎo)叢生芽和芽的分化,較高濃度的6-BA與NAA組合有利于莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

圖1 龍珠果莖段的離體培養(yǎng)和植株再生。A: 叢生芽誘導(dǎo); B: 愈傷組織誘導(dǎo); C: 小芽; D: 生根; E: 移栽30 d; F: 移栽90 d。

因此，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基有利于龍珠果莖段誘導(dǎo)叢生芽并促進(jìn)芽的生長, 而MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基有利于莖段誘導(dǎo)愈傷組織。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)壯苗生根的影響

將大小均勻一致的叢生芽(圖1: C)轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基后定期觀察，約15 d根開始形成，培養(yǎng)40 d后對(duì)根的生長情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析(表2)。

培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L NAA, 生根率為100%, 29.2%的根長達(dá)5 cm，根細(xì)，植株生長正常；當(dāng)NAA為0.2 mg/L時(shí)，生根率為83.3%，10.0%的根長達(dá)5 cm，根略粗，植株葉片較黃。這表明低濃度NAA有利于誘導(dǎo)分化芽長根，但根細(xì)長；高濃度NAA對(duì)根的誘導(dǎo)有抑制作用，但根較粗，葉片較黃。

培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L IBA，生根率為54.2%，38.5%的根長達(dá)5 cm，根略粗，植株正常生長；當(dāng)IBA為0.2 mg/L時(shí)，生根率為95.8%，73.9%的根長達(dá)5 cm，根略粗，葉片較綠(圖1: D)。這表明, 低濃度IBA誘導(dǎo)生根的效果較差，根短粗；而高濃度IBA有利于誘導(dǎo)生根，根長且粗，植株葉片較綠。

當(dāng)NAA與IBA配合使用時(shí)，隨濃度升高，生根率反而下降，但根較粗，植株葉片較黃。因此, 培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.2 mg/L適合龍珠果小芽的壯苗生根培養(yǎng)。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)壯苗生根的影響

2.3 煉苗移栽

待組培瓶苗長到8～12 cm高時(shí)，打開瓶蓋置于自然條件下煉苗，7 d后將組培苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至泥炭土∶蛭石∶珍珠巖為2∶1∶1的基質(zhì)中。移栽后定期補(bǔ)充水分，30 d后(圖1: E)龍珠果成活率達(dá)92.6%，90 d后植株長勢(shì)良好(圖1: F)。

2.4 鹽脅迫的影響

鹽脅迫對(duì)龍珠果組培苗的生長總體表現(xiàn)為抑制作用，隨NaCl濃度的升高，植株出現(xiàn)矮化現(xiàn)象, 葉片逐漸萎蔫卷曲，顏色變黃(圖2: A)。隨NaCl濃度的升高，株高逐漸降低(圖2: B)。當(dāng)NaCl濃度< 200 mmol/L時(shí)，株高與對(duì)照的差異不顯著(>0.05)；NaCl濃度>400 mmol/L時(shí)，株高顯著低于對(duì)照(<0.05)。表明龍珠果組培苗能適應(yīng)200 mmol/L以下的NaCl脅迫。

圖2 鹽脅迫下龍珠果組培苗的表型(A)和株高(B)變化。n=3; 柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)(DMRT)。

從圖3可見，龍珠果組培苗葉片的SOD活性隨NaCl濃度升高呈逐漸升高的變化趨勢(shì)，當(dāng)NaCl濃度大于400 mmol/L時(shí)，SOD活性顯著升高(<0.05)。NaCl濃度為0～400 mmol/L時(shí)，POD活性較低，當(dāng)NaCl濃度大于400 mmol/L時(shí)，POD活性顯著升高(<0.05)。CAT活性隨NaCl濃度升高呈先升后降的變化趨勢(shì)，0～200 mmol/LNaCl處理時(shí)，CAT活性逐漸升高，以200 mmol/L NaCl處理的最高，隨后(200～800 mmol/L NaCl) CAT活性逐漸降低。APX活性隨NaCl濃度升高呈先升后降的變化趨勢(shì)，低濃度NaCl (0～400 mmol/L)處理的APX活性總體升高，以400 mmol/L NaCl處理的最高，隨后(400-800 mmol/L NaCl) APX活性逐漸降低。

圖3 鹽脅迫下龍珠果葉片的SOD、POD、CAT和APX活性

3 結(jié)論和討論

6-BA與NAA或IBA組合誘導(dǎo)莖段產(chǎn)生叢生芽在很多植物中都有報(bào)道[13–15]，本試驗(yàn)結(jié)果表明,6-BA與NAA組合誘導(dǎo)龍珠果莖段產(chǎn)生叢生芽的效果較好，且較低濃度的6-BA與NAA組合有利于莖段誘導(dǎo)叢生芽和芽的生長；較高濃度的6-BA與IBA組合不能使龍珠果莖段產(chǎn)生愈傷組織，而較高濃度的6-BA與NAA組合誘導(dǎo)莖段產(chǎn)生愈傷組織的效果較好，推測(cè)NAA在龍珠果莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織過程中占據(jù)主導(dǎo)地位，且NAA濃度的升高有利于龍珠果莖段形成愈傷組織。辜夕容等[16]的研究表明，NAA濃度增高有利于香樟()莖段誘導(dǎo)出愈傷組織，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。由于愈傷組織數(shù)量有限，本試驗(yàn)沒有進(jìn)行愈傷組織增殖、分化的研究，還有待今后深入研究。

植株受到鹽脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，抗氧化酶系統(tǒng)只能清除已經(jīng)產(chǎn)生的活性氧，無法減少活性氧的生成，屬于被動(dòng)應(yīng)答機(jī)制，一旦活性氧產(chǎn)生大于抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力，植物會(huì)出現(xiàn)一系列不良癥狀，最明顯的表現(xiàn)是生長受到抑制，甚至死亡[17–18]。本研究結(jié)果表明，0～200 mmol/L NaCl對(duì)龍珠果組培苗生長沒有影響；200～800 mmol/L NaCl使植株變矮，葉片變黃萎蔫，這可能是較高濃度鹽使細(xì)胞液泡積累較多的無機(jī)離子，水勢(shì)降低, 同時(shí)根系吸收不到充分的水分和礦質(zhì)元素，進(jìn)而影響植株生長。

SOD能促進(jìn)超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，并傳遞H2O2給下游酶；POD能與SOD聯(lián)合作用，將SOD催化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2分解清除；CAT是SOD的下游保護(hù)酶，能夠進(jìn)一步催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O；APX也是SOD的下游保護(hù)酶，是葉綠體內(nèi)解毒過氧化氫的關(guān)鍵酶，能夠以抗壞血酸為底物，催化H2O2生成H2O[19–20]。張乃群等[21]對(duì)野生大豆()幼苗的研究表明，隨NaCl濃度的升高，POD和CAT活性呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相似。

本文首次以海濱植物龍珠果為研究對(duì)象，以不同NaCl濃度模擬海濱附近生長環(huán)境，并通過4種抗氧化酶活性的變化探討龍珠果組培苗對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)程度。結(jié)果表明，SOD活性隨NaCl濃度升高逐漸升高，POD、CAT和APX活性整體呈先升高后下降的變化趨勢(shì)。0～200 mmol/L NaCl使葉片的SOD、POD、CAT和APX活性均呈現(xiàn)不同程度的升高，說明這4種酶協(xié)同發(fā)揮保護(hù)作用；當(dāng)NaCl濃度大于400 mmol/L時(shí)，CAT和APX活性下降明顯，說明鹽濃度已超過龍珠果植株的耐鹽閾值，生長受到嚴(yán)重抑制。綜合來看，作為一種海濱植物，龍珠果對(duì)鹽脅迫具有一定的耐受能力，200 mmol/L以下的NaCl對(duì)其生長影響不大，耐鹽閾值為400 mmol/L，SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶共同構(gòu)筑了龍珠果抵御鹽脅迫的保護(hù)系統(tǒng)。

本研究成功建立了龍珠果莖段叢生芽誘導(dǎo)和植株再生體系，探究了組培苗對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)程度，為龍珠果種苗繁育和移栽提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持，對(duì)海濱生態(tài)環(huán)境綠化和修復(fù)具有重要意義。

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Stem Cultureofand Salt Tolerance of Seedlings

LIU Yan-yan1,2, SI Can2, HE Chun-mei2, YU Zhen-ming2, DUAN Jun2*

(1. Guangzhou Flowering Research Center,Guangzhou 510360, China; 2. Guangzhou Provincial key laboratory of Applied Botany, Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China)

In order to establish a rapid regeneration system of, the effect of plant growth regulators on adventitious bud induction, rooting were studied by using stems as explants, as well as the salt tolerance of seedlings. The results showed that the induction and growth of adventitious buds were suitable on MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L medium; the callus induction was appropriate on MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L medium; and the rooting of plantlets was available on 1/2MS+IBA 0.2mg/L medium. The survival rate of plantlets could up to 92.6% after transplanted on matrix (peat∶vermiculite∶perlite=2∶1∶1). The growth ofseedlings was not affected under 0-200 mmol/L NaCl, while plants appeared dwarfing, leaf wilting, and yellow under more than 200 mmol/L NaCl stress. The SOD activity in leaves increased with increment of NaCl concentration, while POD, CAT and APX activities increased at first, and then decreased.These would provide technical support for the breeding ofand the restoration of seashore ecology.

; Stem; Cluster shoot; Callus; Salt stress

10.11926/jtsb.4323

2020–10–21

2021–01–25

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2015KJCX040)資助

This work was supported by the Project for Forestry Science and Technology Innovation in Guangdong (Grant No. 2015KJCX040).

劉艷艷(1992～ ), 女, 碩士。E-mail: 1970291025@qq.com

E-mail:duanj@scib.ac.cn