SOX5在口腔鱗癌CAL27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用研究

王亞娥 孫李春 陳鐳雨 曾妍 鄭軍

832000, 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

性別決定區(qū)域Y盒蛋白5(SOX5)屬SOXD亞族的成員，研究發(fā)現(xiàn)SOX5的異常表達(dá)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括垂體瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、淋巴瘤、肝癌等[1]，且與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，對(duì)于腫瘤而言，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為對(duì)于腫瘤的發(fā)展發(fā)揮著不可或缺的作用。本研究通過干擾SOX5探討其對(duì)CAL27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，為口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的診治及預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

常規(guī)培養(yǎng)CAL27細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)提前一天將細(xì)胞接種至六孔板，按Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)照組轉(zhuǎn)染Si-NC,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染Si-SOX5。轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)

使用Trizol(Invitrogen,美國)提取細(xì)胞中總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，QuantiNava SYBR Green RT-PCR Kit試劑盒(QIAGEN,德國)進(jìn)行qRT-PCR。引物序列為：SOX5正向5' -AACAAGCACAGATCCCCATTG-3' 和反向5' -ACACCGTAAGTGCTCTGGATA-3'；GAPDH正向5' - GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' 和反向5' - ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3' 。

1.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

RIPA裂解緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)提取細(xì)胞中總蛋白，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。按所需分子量裁膜，封閉后分別與SOX5(博士德生物工程有限公司)和GAPDH抗體稀釋液4 ℃過夜孵育12 h左右，加入稀釋后酶標(biāo)羊抗兔IgG和酶標(biāo)羊抗小鼠IgG(DAKO，美國)常溫低速搖床孵育2 h。進(jìn)行發(fā)光檢測。

1.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)

調(diào)整細(xì)胞密度加入6 孔板(5 000 個(gè)細(xì)胞/孔)，每組重復(fù)3 孔，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，定期換液，出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)停止培養(yǎng)，冰甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，沖洗晾干后拍照，細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件計(jì)數(shù)克隆細(xì)胞數(shù)，以數(shù)目大于50 個(gè)的細(xì)胞克隆為有效克隆，計(jì)算克隆形成率(%)=細(xì)胞平均克隆數(shù)/接種細(xì)胞個(gè)數(shù)(5 000)×100%。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

待細(xì)胞融合度接近100%時(shí)進(jìn)行劃痕處理，0、24、48 h于40 倍鏡下觀察劃痕愈合情況(白光BF)，拍照保存。Image J計(jì)算劃痕上的遷移面積，計(jì)算得到劃痕愈合率，公式:劃痕愈合率(%)=(初始劃痕面積-24 h及48 h遷移后劃痕面積)/初始劃痕面積×100%。

1.6 Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲

DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到5×105個(gè)/mL，遷移時(shí)上室加入200 μl(1×105個(gè))細(xì)胞懸液，侵襲時(shí)向已鋪有稀釋Matrigel膠(BD，美國)的上室加入200 μl(3×105個(gè))細(xì)胞懸液，下室分別加入適量含有10%FBS及15%FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h、48 h，冰甲醇固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽擦去上室細(xì)胞、基質(zhì)膠等，洗凈晾干后，倒置于顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有資料采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行組間比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SiRNA干擾CAL27細(xì)胞中SOX5的表達(dá)

Western blot及qRT-PCR顯示，實(shí)驗(yàn)組CAL27細(xì)胞中SOX5表達(dá)減低，結(jié)果顯示干擾有效(圖 1)。

圖 1 CAL27細(xì)胞中蛋白及mRNA水平的表達(dá)

2.2 干擾SOX5表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞增殖能力的影響

平板克隆結(jié)果示，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組平均克隆形成率分別為1.37%和3.29%，實(shí)驗(yàn)組生長增殖能力較對(duì)照組降低明顯(P<0.01)(圖 2)。

圖 2 干擾SOX5表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 干擾SOX5表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞劃痕愈合能力的影響

劃痕結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合率較對(duì)照組下降(P<0.05)，且48 h時(shí)更為明顯(P<0.01)(圖 3)。

圖 3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)SOX5表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞劃痕愈合能力的影響

2.4 干擾SOX5表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

Transwell法遷移結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組遷移能力較對(duì)照組下降顯著(P<0.01)，侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組侵襲能力較對(duì)照組顯著下降(P<0.01)(圖 4)。

圖 4 干擾SOX5表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 (×100)

3 討 論

OSCC作為頜面部常見腫瘤類型之一，近年來的患病率呈現(xiàn)逐年升高態(tài)勢，其惡性程度高，且腫瘤容易出現(xiàn)局部侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，使得患者存活率較低，影響生活質(zhì)量[2]。對(duì)于早期OSCC的治療，主要的治療策略仍是手術(shù)切除，術(shù)后輔以放化療。然而OSCC的總體治療結(jié)果仍然不佳。近年來，越來越多學(xué)者將研究熱點(diǎn)集中于腫瘤的分子靶向治療，以期探索新的靶點(diǎn)能夠有助于OSCC的診斷及治療。

性別決定區(qū)域Y盒蛋白5(SOX5)具有HMG (high-mobility group) 結(jié)構(gòu)域,也具有coiled-coil結(jié)構(gòu)域,因而SOX5可以直接結(jié)合DNA或者蛋白，調(diào)節(jié)基因使其表達(dá)[3]。SOX5作為一種轉(zhuǎn)錄因子已被證明與各種癌癥的致癌功能有關(guān)，其在腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用并不一致，已有研究表明，SOX5既可以抑制腫瘤也可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。在肝癌中Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在SOX5低表達(dá)的細(xì)胞中過表達(dá)SOX5可以增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力,而在SOX5高表達(dá)的細(xì)胞敲除SOX5可以抑制細(xì)胞的侵襲力。在肺腺癌中SOX5高表達(dá)并且能促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[5]。在骨肉瘤及胃癌中SOX5能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞及胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[6-7]。在乳腺癌中SOX5可以調(diào)控Twist促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[8]。在侵襲性垂體瘤中,垂體瘤細(xì)胞系GH3在敲除SOX5后,細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力均受到抑制[9]。與以往有關(guān)SOX5在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致，平板克隆、劃痕及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)SOX5表達(dá)后，細(xì)胞生長增殖能力、劃痕愈合能力和遷移能力明顯減弱，在之后的實(shí)驗(yàn)中，本研究利用Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力，轉(zhuǎn)染Si-SOX5的細(xì)胞的侵襲能力亦明顯減弱。

綜上所述，以上結(jié)果提示，干擾SOX5可抑制OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這一研究結(jié)果將有望為OSCC的治療，提供新的生物治療靶向，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。