HIF-1α RNAi對口腔鱗癌生長以及血管生成影響的研究

岑興 廖楚航 費偉 周昊

實體腫瘤生長的微環(huán)境通常是乏氧環(huán)境，這有利于細胞因子的釋放促進血管生成從而導(dǎo)致腫瘤的進程加快[1]。乏氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是乏氧環(huán)境中重要的信號傳導(dǎo)分子,它可以調(diào)控基因的表達產(chǎn)生一系列生物學效應(yīng)促進腫瘤發(fā)展，包括血管生成、細胞增殖、凋亡、糖酵解和pH調(diào)節(jié)[2]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn)HIF-1α的異常表達，包括口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)[3-4]。

在本研究中，通過實時定量PCR(RT-PCR)、Western blot檢測了OSCC臨床標本中HIF-1α的mRNA和蛋白表達情況，使用RNA干擾(RNA interference,RNAi)下調(diào)HIF-1α在OSCC動物模型中的表達，觀察腫瘤生長情況，檢測HIF-1α和VEGF的表達水平，同時檢測了腫瘤細胞的凋亡情況和微血管密度(microvascular density,MVD)。初步探尋HIF-1α在OSCC發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 腫瘤標本的檢測

實驗組標本來自四川省人民醫(yī)院頜面外科2019 年01 月～2019 年06 月手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織(12 例)，年齡60～82 歲，所有患者病理證實均為OSCC；對照組為術(shù)中冰凍病理結(jié)果證實無腫瘤細胞浸潤的正常組織。所有患者均簽署知情同意書,本研究獲得四川省人民醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 RT-PCR 檢測

取保存的腫瘤組織樣本12 例，分別磨碎后加入Trizol(50 mg 組織加入1 ml)抽提RNA，并用RevertAidTM試劑盒(Thermo，USA)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時熒光定量RT-PCR(ABI Prism 7700，USA)。

1.3 Western blot檢測

使用蛋白提取試劑盒(北京索萊寶)提取腫瘤組織蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce，USA)測定蛋白濃度。蛋白變性后，冷卻上樣，凝膠電泳半干法轉(zhuǎn)入PVDF膜后置于封閉緩沖液(搖床振蕩1 h)，分別加入目標基因一抗(1∶10 000，cell signaling technology，USA) ，4 ℃過夜，TBS/T洗滌后孵育二抗，ECL顯影條帶并進行灰度分析(Bio-Rad，USA) 。

1.4 IHC檢測

免疫組化染色過程按試劑盒所附說明進行，石蠟標本4 μm連續(xù)切片, 常規(guī)脫蠟;抗原修復(fù); 加入HIF-1α抗體(北京中杉金橋)后，孵育1 h;加入二抗，孵育20 min;加入DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明封片，電子顯微鏡下觀察采圖。

1.5 HIF-1α特異siRNA慢病毒載體的構(gòu)建

表達HIF-1α特異siRNA慢病毒載體由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成包裝。

1.6 腫瘤模型建立以及RNAi體內(nèi)實驗

口腔鱗狀細胞癌細胞株 Tca8113 購自四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室; 基本實驗步驟如下; 細胞株從液氮冰存中復(fù)蘇，培養(yǎng)于RPMI 培養(yǎng)液(15%滅活小牛血清，青霉素200 U/ml，鏈霉素200 U/ml)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱。收集對數(shù)生長期細胞，制備濃度為 1 ×107/ml 細胞懸液，皮下接種于30 只裸鼠背部，每個部位接種約0.1 ml。待腫瘤體積達到100 mm3，分別瘤內(nèi)注射相同體積(0.1 ml)的生理鹽水(Mock組)，表達非特異性siRNA的質(zhì)粒(pUc組)和表達HIF-1α特異siRNA的質(zhì)粒(pU組)，每組10 只。每5天注射1 次，共注射4 次。從第5天開始，每5天用游標卡尺測量腫瘤體積，利用公式腫瘤體積=長徑×(短徑)2×1/2計算。最后1 次測量腫瘤體積后采用頸椎脫位法處死裸鼠，完整分離組織；一半組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋；另一半立即存放于液氮罐中，后轉(zhuǎn)存于-70 ℃冰箱，備后續(xù)檢測。

1.7 HIF-1α表達檢測

利用RT-PCR、Western blot和IHC檢測裸鼠瘤體內(nèi)HIF-1α的表達變化，方法同1.2-1.4。

1.8 腫瘤細胞凋亡的測定

按照TUNEL試劑(碧云天，上海元業(yè)興生物科技有限公司)盒說明，對腫瘤組織中凋亡細胞進行測定。

1.9 VEGF的檢測和微血管計數(shù)

利用Western blot檢測VEGF的表達變化情況。CD34染色后，選擇2 個血管化程度較高的區(qū)域進行微血管計數(shù)，采用低光度數(shù)(×10物鏡)進行計數(shù)。最終的MVD值為每個高血管化區(qū)域(總面積：2.65 mm2)的3 個評價高倍視野(×25物鏡)的平均值。具有清晰管腔或明確線形血管形狀的血管被考慮用于計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤標本中HIF-1α的表達

結(jié)果顯示在OSCC患者腫瘤標本中HIF-1α的mRNA和蛋白的表達明顯高于對照組(P<0.05)(圖 1)。

圖 1 腫瘤組織和正常組織中HIF-1α的mRNA和蛋白的表達

2.2 HIF-1α抑制效果的檢測

PCR和Western blot結(jié)果顯示在注射了表達HIF-1α特異siRNA的移植瘤模型中，HIF-1α的mRNA和蛋白的表達明顯比對照組降低(P<0.05)(圖 2A)。

2.3 腫瘤生長的變化

腫瘤大體圖片示pU組瘤體的組明顯低于大小Mock組和pUc組(圖2 A)；生長曲線結(jié)果顯示pU組的生長趨勢明顯慢于其他組(P<0.05)(圖 2B)。

圖 2 荷瘤裸鼠腫瘤增長

2.4 HIF-1α的抑制效果

PCR、Western blot和IHC結(jié)果均顯示在pU組中HIF-1α的表達水平相對于Mock組和pUc組明顯降低(P<0.05)(圖 3)。

圖 3 3 組樣本中HIF-1α的mRNA、蛋白表達

2.5 腫瘤組織凋亡的變化

TUNEL結(jié)果顯示在pU組中，凋亡細胞的數(shù)量明顯要高于其他組(P<0.05)(圖 4)。

圖 4 3組腫瘤組織樣本中細胞凋亡(TUNEL)

2.6 VEGF表達和微血管密度變化

Western blot結(jié)果顯示在pU組中VEGF的表達顯著低于對照組(圖 5A)；同時，微血管密度(MVD)統(tǒng)計結(jié)果顯示，pU組中的MVD明顯低于對照組(P<0.05)(圖 5B)。

圖 5 腫瘤組織中VEGF的表達及MVD

3 討 論

癌癥目前被認為是由于基因的突變和異常表達導(dǎo)致的，這些基因的改變賦予細胞許多特定功能，如細胞增殖、生存、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，基因靶向治療可能成為控制癌癥進展的一種有效的方法。

實體腫瘤的生長很大程度上依賴于血管生成，腫瘤組織表現(xiàn)出比健康組織更低的氧合水平[1]。缺氧觸發(fā)了血管生成機制，HIF-1在這個過程中起了重要的作用，HIF-1是一種由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，當腫瘤細胞暴露在缺氧中時，它被穩(wěn)定和激活，促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因涉及腫瘤生物學的許多方面，包括血管生成、無氧能量代謝、細胞增殖、細胞侵襲和凋亡[5-6]。同時，多種腫瘤抑制蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表達失調(diào)的結(jié)果也使HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性增加。已在多種人類腫瘤中檢測到HIF-1α濃度升高，其表達水平與惡性程度和生存預(yù)后相關(guān)[3-4]。實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在OSCC患者的腫瘤組織中HIF-1α的表達明顯高于正常組織。

以往的研究揭示了HIF-1α參與腫瘤發(fā)展過程的生物學機制：首先，p53或VHL的丟失通過干擾其泛素化和蛋白酶體降解來增加HIF-1α蛋白的表達[7]；隨之，HIF-1α進入細胞核并與存在于促進對缺氧的生理反應(yīng)的各種基因中的HRE結(jié)合，包括上調(diào)VEGF，以及糖酵解酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白[8]，這些基因的上調(diào)通過增加腫瘤細胞中葡萄糖的供應(yīng)和代謝來促進腫瘤的生長[9]，而VEGF由于其血管生成特性發(fā)揮了核心作用。Miele等[10]發(fā)現(xiàn)p42/p44MAPK通路在胰島素樣生長因子-1誘導(dǎo)的HIF-1α活化和VEGF中起重要作用。Lauhner等[11]的研究報道了HER2信號通過HIF-1a誘導(dǎo)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄激活，這種激活依賴于PI3K和AKT的活性。在乏氧條件下，髁突軟骨細胞中HIF-1α和VEGF的表達成正相關(guān)[12]；另外，在人類導(dǎo)管原位癌和浸潤性乳腺癌中HIF-1α過表達與HER2、VEGF表達及MVD顯著相關(guān)[13]，HIF-1α功能喪失可抑制腫瘤血管生成，而HIF-1α功能增強可促進腫瘤血管生成[14]。與此相一致，研究結(jié)果表明，在體內(nèi)外RNAi下調(diào)HIF-1α的表達時，VEGF的表達明顯受到抑制，并且在口腔鱗癌移植瘤中也同時發(fā)生了顯著的MVD抑制。因此，可以推測針對HIF-1α的RNAi可能通過下調(diào)血管生成因子(如VEGF)來阻止口腔腫瘤血管生成，從而阻止腫瘤的進程。

另一方面HIF-1α在癌癥的發(fā)展過程中還具有促進增殖和抗凋亡的作用。HIF-1α被證明在低氧誘導(dǎo)的胰腺癌細胞凋亡方面具有保護作用[15]。Yoshida等[16]發(fā)現(xiàn)HIF-1α可防止垂體腺瘤HP75細胞缺氧誘導(dǎo)的凋亡。Mizuno等[17]報道了RNAi介導(dǎo)的HIF-1α下調(diào)顯著抑制了肝膽和胰腺癌細胞的生長。另外，HIF-1α的一些靶基因也參與增殖因子和抗凋亡因子的形成，如VEGF、胰島素樣生長因子-2、血小板衍生生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β，這些因子與其受體結(jié)合激活信號傳遞[18]。IAP-2是一種抗凋亡蛋白，也被認為是HIF-1α介導(dǎo)的候選因子[19]。實驗結(jié)果也表明，在HIF-1α被抑制之后，腫瘤在體內(nèi)生長也受到抑制，凋亡細胞明顯增多，HIF-1α可能在刺激癌細胞增殖和抑制凋亡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，RNAi下調(diào)HIF-1α的表達抑制了口腔鱗癌進展的許多關(guān)鍵步驟。為臨床上采用靶向HIF-1α技術(shù)治療OSCC，特別是防治癌細胞存活和血管生成方面提供了重要的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。