基于生物信息學(xué)分析miR-655在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及功能探討

王曦 戈春城 童國勇 徐佳

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)，是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，占比約為90%[1]。OSCC具有浸潤性強(qiáng)、淋巴結(jié)易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，是導(dǎo)致患者5 年內(nèi)總的生存率不到50%的主要原因[2-3]。研究OSCC的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的分子靶點(diǎn)對OSCC的診斷及治療具有重要意義。目前隨著高通量基因測序技術(shù)在腫瘤中的應(yīng)用，已有研究探討了某些mRNA或miRNA分子對OSCC的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的影響[4-5]。

microRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)的非編碼RNA，長約20～25 個核苷酸，目前已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[6-7]。miR-655位于14號染色體的 q32.31位點(diǎn)，參與基因表達(dá)的調(diào)控,影響細(xì)胞增殖和生長等生物學(xué)過程。研究報道m(xù)iR-655具有抑制腫瘤的作用[8]，然而目前對miR-655在OSCC的研究國內(nèi)尚未見報道，因此本研究擬利用公開發(fā)表的的RNA-seq數(shù)據(jù)，探討miR-655在OSCC患者中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集

1.1.1 TCGA數(shù)據(jù)收集 從癌癥和腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)(https://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載342 例OSCC樣本及臨床數(shù)據(jù)(年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期、吸煙、飲酒史、總生存期)和44 例癌旁樣本，該miRNA數(shù)據(jù)集采用RNA-seq技術(shù)檢測基因表達(dá)。

1.1.2 OSCC患者樣本收集 2018 年01 月～2020 年01月經(jīng)恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院口腔科手術(shù)切除的40 例OSCC患者，術(shù)后病理科確診，收集癌組織及癌旁組織兩份標(biāo)本，入組患者未行放化療、靶向治療等治療方案，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究征得患者及家屬的知情同意，并獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑及儀器 正常人口腔上皮細(xì)胞HOK及OSCC細(xì)胞系(TSCCa、CAL-27、SCC-4、HN-6)(中科院上海細(xì)胞庫)；胎牛血清、脂質(zhì)體Lipofectamine2000、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master mix[寶生物工程(大連)有限公司]；Transwell小室和Matrigel膠(BD公司，美國)；細(xì)胞增殖試劑盒(CCK8)(上海碧云天生物科技有限公司)；miR-655模擬物(Mimics)和陰性對照(NC)(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 miR-655的表達(dá)水平 分析miR-655在342 例OSCC樣本及44 例癌旁樣本的表達(dá)水平。同時，TRIzol法提取總RNA,采用ND-1000行核酸定量，One Step PrimeScript?miRNAcDNA合成試劑盒，按步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，qRT-PCR條件為： 95 ℃預(yù)變性10 min，40 個循環(huán)(95 ℃ 10 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s)。miR-655上游引物：5' -TCCGAACATGGTTAA-3' ，下游引物：5' -GTGCAGGGTCCGAGG-3' ，以U6核小分子RNA為內(nèi)參，表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.2 數(shù)據(jù)篩選及分組 整理342 例OSCC樣本及其臨床數(shù)據(jù)，以 miR-655表達(dá)的中位值，將OSCC樣本分為miR-655高表達(dá)組(n=171)和低表達(dá)組(n=171)。比較miR-655表達(dá)與OSCC患者的臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1.2.3 qPCR檢測miR-655在OSCC細(xì)胞的表達(dá)及轉(zhuǎn)染 將正常人口腔上皮細(xì)胞HOK及OSCC細(xì)胞系(TSCCa、CAL-27、SCC-4、HN-6)加入到DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。每隔1～2 d更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時傳代，qRT-PCR檢測miR-655在OSCC細(xì)胞的表達(dá)。設(shè)立脂質(zhì)體向OSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-655 Mimics組、miR-655 NC組及脂質(zhì)體處理的空白對照組，按CCK8試劑盒說明，檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖水平。

1.2.4 轉(zhuǎn)染Mimics后OSCC細(xì)胞的遷移及侵襲能 取對數(shù)生長期及狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染Mimics人OSCC細(xì)胞，設(shè)為miR-655 Mimics組、miR-655 NC組及脂質(zhì)體處理的空白對照組，胰酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸，備用。低溫環(huán)境下在24 孔板中預(yù)先加入500 μL的含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入Transwell小室，在上室面接入100 μL(1×105/mL)細(xì)胞懸液，置于37 ℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉簽將上室未遷移的細(xì)胞擦干凈，遷移至下室的細(xì)胞予以甲醛固定25 min，0.1%結(jié)晶紫染色，室溫放置20 min，光學(xué)顯微鏡計算細(xì)胞數(shù)目，隨機(jī)5 個視野計數(shù)。侵襲實驗，預(yù)先采用，Matrigel膠預(yù)先在4 ℃冰箱過夜融化，用培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋，包被Transwell小室，余步驟同遷移實驗。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-655在OSCC中的表達(dá)水平

342 例 OSCC組miR-655的表達(dá)量為(1.81±0.05)，44 例癌旁組的表達(dá)量為(2.43±0.18)(t=1.141，P<0.001)(圖 1A)；qRT-PCR測定miR-655在40 例OSCC患者中，癌及癌旁組織標(biāo)本的表達(dá)。結(jié)果示：癌和癌旁組織中的miR-655的表達(dá)分別為1.94±0.12和2.68±0.21(t=3.077，P=0.003)，miR-655在癌組織中低表達(dá)，驗證了TCGA分析結(jié)果(圖 1B)。

圖 1 miR-655在OSCC和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 miR-655與OSCC患者臨床特征的相關(guān)性

342 例OSCC患者，miR-655高、低表達(dá)組與患者的年齡(P=0.102)、性別(P=0.567)、腫瘤分期(P=0.526)、吸煙史(P=1.000)和飲酒史(P=0.642)均無顯著差異。兩組與患者的腫瘤分級存在相關(guān)(P=0.044)，提示miR-655的表達(dá)與OSCC腫瘤分級有關(guān)(表 1)。

表 1 miR-655表達(dá)與OSCC患者臨床特征的關(guān)系

2.3 miR-655與OSCC患者預(yù)后的關(guān)系

342 例OSCC患者隨訪時間為0.36～182.6 月(中位隨訪時間為21.3 月)。分析高、低表達(dá)組患者的總生存期，miR-655高表達(dá)患者總生存率優(yōu)于低表達(dá)組(Log-rankP=1.19E-02)(圖 2)。Cox回歸分析提示：miR-655表達(dá)(HR：0.59，95% CI：0.53～0.95，P=0.020)、腫瘤分期和年齡是OSCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素(表 2)。

圖 2 miR-655表達(dá)與OSCC患者總生存率的關(guān)系

表 2 OSCC預(yù)后因素的Cox回歸分析

2.4 PCR檢測miR-655在OSCC細(xì)胞的表達(dá)及轉(zhuǎn)染

qRT-PCR檢測miR-655在OSCC細(xì)胞的表達(dá)水平，結(jié)果示：miR-655在OSCC細(xì)胞中表達(dá)與人口腔上皮細(xì)胞HOK比較表達(dá)下調(diào)，其中CAL-27細(xì)胞表達(dá)水平明顯降低(t=5.074，P<0.001)，本研究選擇該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實驗(圖 3A)。脂質(zhì)體向CAL-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染，設(shè)立miR-655 Mimics組、miR-655 NC組及脂質(zhì)體處理的空白對照組，按CCK8檢測結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染后第2天，miR-655 Mimics組CAL-27細(xì)胞的增殖能力較空白組和NC組顯著下降(P<0.001)(圖 3B)。

圖 3 miR-655在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)及其轉(zhuǎn)染后的增殖影響

2.5 miR-655對OSCC細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

Transwell遷移及侵襲實驗結(jié)果提示，與空白組及NC相比，轉(zhuǎn)染Mimics的CAL-27細(xì)胞的遷移及侵襲能力減弱(圖 4)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。表明過表達(dá)miR-655可以明顯抑制CAL-27細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

圖 4 miR-655轉(zhuǎn)染對CAL-27細(xì)胞細(xì)胞的遷移及侵襲能力的影響

3 討 論

OSCC是嚴(yán)重威脅人類健康的一類惡性腫瘤，由于OSCC早期難以診斷、進(jìn)展快，導(dǎo)致其預(yù)后情況較差[9-10]。目前OSCC的發(fā)病機(jī)制，可能是涉及多條通路、多個基因調(diào)控、環(huán)境等導(dǎo)致的多種復(fù)雜生物學(xué)過程。miRNA作為調(diào)控功能的非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中，可作為腫瘤的潛在診斷及治療的生物標(biāo)志物[11]。本研究通過挖掘OSCC高通量測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)miR-655在OSCC組織中呈低表達(dá)，并且高表達(dá)組miR-655的OSCC患者的腫瘤分級較好、預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組，提示miR-655在OSCC中的抑癌作用。

目前關(guān)于miR-655對OSCC的臨床表達(dá)及預(yù)后，國內(nèi)尚未見報道，但miR-655作為新報道的非編碼RNA，目前已有研究報道m(xù)iR-655在一些腫瘤中低表達(dá)，呈抑癌基因的作用。Gajera等[12]研究報道了miR-497-5p和miR-655的表達(dá)通過調(diào)節(jié)人類非綜合征型唇腭裂的候選基因來抑制細(xì)胞增殖，提供了關(guān)于miRNA在非綜合征型唇腭病因中的作用的可能機(jī)制，并提出了診斷非綜合征型唇腭的可能策略。Zha等[13]的研究報道，miR-655可能通過調(diào)控VEGF的表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲，因此miR-655/VEGF途徑可作為卵巢癌患者的新型治療靶點(diǎn)。Oshima 等[14]研究提示將靶向腫瘤的miR-655與奧沙利鉑通過納米粒子的共同傳遞，抑制了肝癌的生長，提示通過使用腫瘤特異性納米粒子共同遞送microRNA和常規(guī)細(xì)胞毒劑，可以潛在地治療轉(zhuǎn)移性肝癌。本研究采用大數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)miR-655在OSCC組織中呈低表達(dá)，并通過qRT-PCR驗證了miR-655在OSCC患者表達(dá)情況，與以上研究結(jié)果是相一致的，因此推測miR-655在OSCC具有抑制腫瘤的作用。在進(jìn)一步分析中，首次探討了miR-655與OSCC患者的腫瘤分級及預(yù)后相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-655高表達(dá)患者總生存率明顯優(yōu)于低表達(dá)組，與腫瘤分級負(fù)相關(guān)。Cox回歸分析提示miR-655表達(dá)水平是OSCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。有研究發(fā)現(xiàn)血漿中低水平的miR-655與淋巴浸潤和不良預(yù)后有關(guān)，血漿中miR-655水平的恢復(fù)可能抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的淋巴進(jìn)展，改善預(yù)后[15]。Zhao等[16]研究證實miR-655的低表達(dá)與肝癌患者的血管浸潤、腫瘤分級、淋巴進(jìn)展顯著有關(guān)，為肝癌的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=1.533, 95%CI:0.988-3.891;P=0.002)，可能為潛在的不利預(yù)后生物標(biāo)志物。這些研究支持本研究的結(jié)果，表明了miR-655在OSCC中可能的預(yù)測價值。

目前miR-655在OSCC的具體作用機(jī)制，尚未見報道，這也是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。本研究首次對miR-655在OSCC中可能的影響進(jìn)行了初步的功能探討，結(jié)果提示，miR-655在OSCC細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-655可以明顯抑制CAL-27細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，體外實驗證實了生物信息學(xué)分析的結(jié)果。相關(guān)研究證實miR-655通過直接靶向PAX6并抑制ERK和p38 MAPK信號通路來抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，以及通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌中的ADAM10和β-catenin途徑而發(fā)揮抑癌作用[17-18]。以上研究表明了miR-655在惡性腫瘤的可能作用機(jī)制，可能與磷酸化/去磷酸化調(diào)控及信號傳導(dǎo)分子的表達(dá)或活性抑制相關(guān)，進(jìn)一步支持miR-655在OSCC中具有較大的生物學(xué)意義。

綜上所述，本研究結(jié)果提示miR-655在OSCC組織中呈低表達(dá)，與腫瘤病理分級有關(guān)，可作為其預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物，為OSCC的治療提供新的靶點(diǎn)，其作用機(jī)制可能與miR-655影響OSCC的增殖、遷移及侵襲能力有關(guān)。