下調(diào)LINC00667靶向調(diào)控miR-34a抑制口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的體外研究

彭國(guó)棟 裴磊

口腔癌是頭頸部惡性腫瘤中的一大類(lèi)，口腔癌中有約90%為口腔鱗癌，其發(fā)生涉及煙草、酒精刺激、病毒感染、免疫異常等多個(gè)因素[1]?？谇击[癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多基因共同作用的結(jié)果，其具體的發(fā)生機(jī)制還不明確[2]。積極尋找有效的分子標(biāo)記物對(duì)于口腔鱗癌的治療意義重大[3]。LncRNA是長(zhǎng)度大于200 bp的非編碼RNA，其可以在轉(zhuǎn)錄后、翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與多個(gè)細(xì)胞生理和病理過(guò)程[4]。很多研究表明，LncRNA與人類(lèi)多種疾病有關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、腦出血等，LncRNA可能是疾病治療的分子靶點(diǎn)[5-7]。LINC00667是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)控腫瘤進(jìn)展作用的調(diào)節(jié)因子，其在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮促進(jìn)作用[8]。LINC00667在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)LINC00667抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。LncRNA作用機(jī)制與miRNA有關(guān)，其可以通過(guò)調(diào)控miRNA的表達(dá)參與多個(gè)生理過(guò)程[10]。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LINC00667和miR-34a存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。miR-34a在口腔鱗癌中發(fā)揮抑制作用，其能夠下調(diào)腫瘤細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)探討下調(diào)LINC00667靶向調(diào)控miR-34a對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為靶向分子治療口腔鱗癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

cyclin D1抗體、p27抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27(廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司)；C-Caspase-3抗體(北京百奧萊博科技有限公司)；mimics control、miR-34a mimics、miR-34a inhibitor、inhibitor control(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；口腔鱗癌細(xì)胞SCC15(南京科佰生物科技有限公司)；口腔鱗癌細(xì)胞OSC-4(上海弘順生物科技有限公司)；shRNA control、LINC00667 shRNA(上?；鶢栴D生物有限公司)；正?？谇簧掀ぜ?xì)胞HOK(上海榕柏生物技術(shù)有限公司); Light Cycler 480熒光定量PCR儀(Roche公司，美國(guó))；Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國(guó))；FACS caliber流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))。

1.2 口腔鱗癌細(xì)胞中LINC00667表達(dá)的檢測(cè)

收集正常口腔上皮細(xì)胞HOK和口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27、SCC15、OSC-4，按試劑盒說(shuō)明，Realtime PCR方法檢測(cè)各細(xì)胞系中LINC00667的表達(dá)，內(nèi)參設(shè)置為GAPDH，按照2-△△Ct法計(jì)算LINC00667表達(dá)水平。

1.3 CAL-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將CAL-27細(xì)胞分為Control、sh-NC、sh-LINC-00667組，sh-NC、sh-LINC00667組，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明分別轉(zhuǎn)染shRNA control、LINC00667 shRNA，Control組為沒(méi)有進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27。收集轉(zhuǎn)染48 h以后的各組細(xì)胞，利用Realtime PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中LINC00667表達(dá)水平。

1.3.1 CAL-27細(xì)胞增殖檢測(cè) 在96 孔板中接種口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞，按照Control、sh-NC、sh-LINC-00667組分組方法處理培養(yǎng)48 h。常規(guī)MTT法檢測(cè)，以A值表示細(xì)胞增殖活性。

1.3.2 CAL-27細(xì)胞周期檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，常規(guī)PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

1.3.3 CAL-27細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集各組細(xì)胞Annexin V-FITC方法染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.4 CAL-27細(xì)胞中cyclin D1、p27、C-Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，Western blot方法檢測(cè)3 種目標(biāo)蛋白表達(dá)。GAPDH作為參照，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。cyclin D1、p27一抗按照1∶1 000稀釋?zhuān)珻-Caspase-3按照1∶600稀釋。

1.4 靶基因預(yù)測(cè)及鑒定

利用生物信息學(xué)軟件Starbase分析LINC00667的靶基因，以熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。分別把WT、MUT與mimics control、miR-34a mimics共轉(zhuǎn)染到CAL-27細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，利用熒光素酶活性測(cè)定試劑盒分析細(xì)胞熒光素酶活性的變化。WT為含有LINC00667結(jié)合位點(diǎn)的野生型熒光素酶報(bào)告載體，MUT為含有突變之后LINC00667結(jié)合位點(diǎn)的突變型熒光素酶報(bào)告載體。收集轉(zhuǎn)染48 h以后的Control、sh-NC、sh-LINC00667組細(xì)胞，利用Realtime PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平，內(nèi)參為U6。

1.5 miR-34a inhibitor對(duì)下調(diào)LINC00667影響口腔鱗癌細(xì)胞作用檢測(cè)

CAL-27細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor、LINC00667 shRNA和inhibitor control、LINC00667 shRNA，命名為sh-LINC00667+Anti-miR-34a和sh-LINC-00667+Anti-miR-NC組，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期，Annexin V-FITC方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡， Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中cyclin D1、p27、C-Caspase-3蛋白表達(dá)，Realtime PCR方法檢測(cè)miR-34a表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 口腔鱗癌細(xì)胞中LINC00667相對(duì)高表達(dá)

口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27、SCC15、OSC-4中LINC00667表達(dá)水平均高于正?？谇簧掀ぜ?xì)胞HOK(P<0.05)，OSC-4、SCC15中LINC00667表達(dá)水平均低于CAL-27(P<0.05)(表 1)?？谇击[癌細(xì)胞中LINC00667相對(duì)高表達(dá)，選取表達(dá)水平最高的CAL-27用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表 1 各細(xì)胞系中LINC00667表達(dá)水平

2.2 下調(diào)LINC00667對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡影響

與Control、sh-NC組比較，sh-LINC00667組CAL-27細(xì)胞中LINC00667水平降低，細(xì)胞增殖活性下降，細(xì)胞G0/G1期比例升高，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中cyclin D1蛋白表達(dá)減少，p27、C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖 1,表 2)。下調(diào)LINC00667抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖并阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖 1 LINC00667 shRNA對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中cyclin D1、p27、C-Caspase-3蛋白表達(dá)影響

表 2 LINC00667 shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)CAL-27細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)特性的影響

2.3 LINC00667和miR-34a為靶向關(guān)系

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)LINC00667和miR-34a存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且miR-34a mimics和WT共轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞熒光素酶活性降低(圖 2,表 3)。LINC00667和miR-34a為靶向關(guān)系。

圖 2 LINC00667和miR-34a結(jié)合位點(diǎn)

表 3 熒光素酶活性

2.4 下調(diào)LINC00667促進(jìn)miR-34a表達(dá)

與Control、sh-NC組比較，sh-LINC00667組CAL-27中miR-34a水平升高(P<0.05)(表 4)。下調(diào)LINC00667促進(jìn)miR-34a表達(dá)。

表 4 下調(diào)LINC00667后CAL-27細(xì)胞中miR-34a水平

2.5 miR-34a inhibitor對(duì)下調(diào)LINC00667影響口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27增殖、周期和凋亡的作用

與sh-LINC00667+Anti-miR-NC組比較，sh-LINC00667+Anti-miR-34a組口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27中miR-34a水平降低，細(xì)胞增殖活性升高，細(xì)胞G0/G1期比例降低，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞中p27、C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，cyclin D1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖 3,表 5)。

圖 3 miR-34a inhibitor對(duì)下調(diào)LINC00667影響CAL-27細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中cyclin D1、p27、C-Caspase-3蛋白表達(dá)影響

表 5 miR-34a inhibitor和LINC00667 shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)CAL-27細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)特性的影響

3 討 論

LncRNA具有十分強(qiáng)大的調(diào)控潛力，LncRNA能夠從DNA甲基化、基因組印記、mRNA降解、蛋白質(zhì)定位等多個(gè)層面發(fā)揮作用，其與神經(jīng)退行性疾病、心血管系統(tǒng)疾病、腫瘤等發(fā)生有關(guān)，參與胚胎發(fā)育、能量代謝、細(xì)胞分化，LncRNA目前已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00667與腫瘤進(jìn)程有關(guān)，LINC00667在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，LINC00667促進(jìn)肺癌細(xì)胞惡性增殖[13]。下調(diào)LINC00667誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，降低結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖速度[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LINC00667在口腔鱗癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，并且下調(diào)LINC00667抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖能力，這說(shuō)明LINC00667在口腔鱗癌中可能發(fā)揮類(lèi)似癌基因的作用，這與以前的研究結(jié)果一致，均提示LINC00667可能具有促進(jìn)腫瘤的作用。

細(xì)胞周期有序進(jìn)展是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，而細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡動(dòng)態(tài)平衡是機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持的關(guān)鍵[14]。細(xì)胞周期是指從上一次細(xì)胞分裂結(jié)束到本次細(xì)胞分裂結(jié)束的整個(gè)過(guò)程，其包括分裂期和分裂間期，細(xì)胞周期是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，受到多個(gè)基因的共同調(diào)控作用[15]。G0/G1向S期進(jìn)展是細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)鍵點(diǎn)之一，cyclin D1可以促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，cyclin D1也被認(rèn)為是細(xì)胞周期進(jìn)程加快的標(biāo)志[16]。另外，cyclin D1也是目前發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中表達(dá)上調(diào)的促腫瘤因子[17]。p27是細(xì)胞周期的抑制因子，其表達(dá)水平升高，細(xì)胞周期被阻滯[18]。Caspase蛋白家族含有多個(gè)蛋白成員，這些蛋白成員以沒(méi)有活性的形式在細(xì)胞內(nèi)存在，只有被活化后才可以發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能[19]。Caspase-3是Caspase蛋白家族中的凋亡執(zhí)行因子，其在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于下游，Caspase-3被激活后可以不可逆的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)LINC00667后的口腔鱗癌細(xì)胞G0/G1期比例升高，cyclin D1蛋白表達(dá)減少，p27、C-Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，這提示下調(diào)LINC00667阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這進(jìn)一步證明了LINC00667可能是一種癌基因。

目前對(duì)LncRNA的作用機(jī)制的研究較多，但尚未完全闡明，目前研究較多的是LncRNA通過(guò)與miRNA結(jié)合影響miRNA的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生理功能，并且LncRNA和miRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)的方式結(jié)合，因此同一個(gè)LncRNA可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)miRNA，而同一個(gè)miRNA能夠同時(shí)被多個(gè)LncRNA調(diào)控[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LINC00667能夠靶向促進(jìn)miR-34a的表達(dá)。miR-34a位于1p36.22染色體上，其在大多數(shù)器官中均有表達(dá)。有研究已經(jīng)證明，miR-34a在宮頸癌、乳腺癌、口腔鱗癌等多個(gè)腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，miR-34a在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮抑制作用[11,22-23]。本實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)miR-34a具有逆轉(zhuǎn)下調(diào)LINC00667對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡作用的功效，這說(shuō)明下調(diào)LINC00667通過(guò)靶向miR-34a發(fā)揮作用。

綜上，LINC00667可能是一個(gè)口腔鱗癌促進(jìn)因子，下調(diào)其表達(dá)體外抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制與靶向miR-34a有關(guān)。目前尚未研究LINC00667調(diào)控miR-34a的下游靶向機(jī)制，尚未在多株口腔鱗癌以及體內(nèi)驗(yàn)證LINC00667的作用，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)這些內(nèi)容進(jìn)行探討。本次實(shí)驗(yàn)為靶向分子治療口腔鱗癌提供了思路，為研究口腔鱗癌的分子發(fā)生機(jī)制提供了部分資料。