高糖條件下Exendin-4對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖分化的影響

石曉娜 周麟 張悅 陳莉媛 羅靜雯 鄭新城 林東

糖尿病是口腔種植修復(fù)的高風(fēng)險因素。由于高血糖損害成骨細胞功能，減少骨轉(zhuǎn)化，影響種植體周圍骨結(jié)合[1-3], 因此糖尿病是牙種植修復(fù)的一個難題。

腸促胰素類藥物是2型糖尿病的一種常用治療藥物，主要包括胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物和二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑。有研究發(fā)現(xiàn)腸促胰素類藥物不僅有控制血糖的作用，還能通過促進骨形成，抑制骨吸收兩方面影響糖尿病患者的骨代謝[4-6]。有研究表明GLP-1能通過增強Wnt/β-catenin通路促進成骨細胞的增殖分化，亦能與脂肪間充質(zhì)干細胞上的GLP-1受體結(jié)合誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，從而促進骨形成[7]。

艾塞那肽(Exenatide)主要成分為Exendin-4。Exendin-4是一種從北美希拉巨蜥唾液中發(fā)現(xiàn)的長效GLP-1受體激動劑。它和GLP-1具有相似的生理功能，能調(diào)節(jié)血糖,保護胰島β細胞[8]。本實驗以大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)為研究對象,觀察Exendin-4對高糖條件下BMSCs增殖分化的影響，以進一步探討Exendin-4對2型糖尿病骨代謝及種植體周圍骨結(jié)合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

(200±20) g 雄性SD大鼠(福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)；Exendin-4(Sigma公司， 美國)；高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司， 美國)；ALP活性檢測試劑盒、CCK-8溶液、Western及IP細胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Gibco公司， 美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng) 180～220 g健康雄性 SD大鼠，脫頸處死，無菌條件下剝離股骨，收集骨髓細胞于10%FBS， 1%青鏈霉素雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基中并接種于培養(yǎng)皿，放置在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 3 d后換液，培養(yǎng)7 d后，細胞貼壁生長，呈較均勻梭形，長滿90%左右，進行傳代培養(yǎng)。選取生長良好的P4～P6細胞制成細胞懸液后分組培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗。實驗分組：以BMSCs為實驗對象，分為對照組(對照組，低糖DMEM培養(yǎng)基含糖5.6 mmol/L)；高糖組(HT組，高糖DMEM培養(yǎng)基 含糖25 mmol/L)；高糖聯(lián)合不同濃度Exendin-4干預(yù)組(HG+E1組 Exendin-4 1 nmol/L，HG+E5組Exendin-4 5 nmol/L， HG+E10組Exendin-4 10 nmol/L，HG+E15組Exendin-4 15 nmol/L)。

1.2.2 大鼠BMSCs的增殖實驗 BMSCs分組接種于24 孔板， 2×104/孔，每組設(shè)3 個平行孔。培養(yǎng)1、 3、 7 d后，棄去舊培養(yǎng)基，每孔中加入500 μL的新鮮培養(yǎng)基， 50 μL的CCK-8溶液。置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。每孔吸取200 μL反應(yīng)液至96 孔板中。在450 nm利用酶標儀檢測其吸光度值,觀察細胞的增殖情況。

1.2.3 細胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性檢測 BMSCs分組接種于24 孔板， 2×104/孔， 每組設(shè)3 個平行孔。培養(yǎng)7 d后，棄細胞上清液，PBS沖洗3次，加入100 μL裂解液1%的Triton X-100，進行4個凍融循環(huán)裂解細胞。ALP活性檢測試劑盒測定裂解液中ALP活性，在405 nm測其吸光度值。

1.2.4 細胞外基質(zhì)礦化檢測 BMSCs分組接種于24 孔板，2×104/孔，每組設(shè)3 個平行孔。培養(yǎng)14 d后，棄細胞上清液，PBS沖洗3 次后，75%的酒精固定1 h， 40 mmol/L的茜素紅(pH=4.2)細胞外基質(zhì)染色10 min。去離子水漂洗試樣5次直至不再脫色，體式顯微鏡照相。10%氯化十六烷基吡啶(溶劑為PBS緩沖液)溶解試樣表面染料，在630 nm測其吸光度進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用 GraphPad Prism7和SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析。2 組之間定量數(shù)值比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，檢驗水準 α=0.05，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs細胞培養(yǎng)

分離得到的骨髓細胞呈圓形, 大小不一，含少許雜細胞， 72 h后換液可見細胞貼壁生長， 5～6 d后細胞增殖迅速， 10～12 d時細胞達90%融合,細胞呈梭形。傳代培養(yǎng)后，細胞狀態(tài)漸趨穩(wěn)定，取生長狀態(tài)較好的P4代細胞進行實驗(圖 1)。

圖 1 BMSCs倒置顯微鏡下形態(tài)

2.2 Exendin-4 對BMSCs增殖的影響

培養(yǎng)1、 7 d時，與對照組相比,HT組BMSCs的增殖能力均受到明顯抑制(P<0.05)。與HT組相比，Exendin-4在短時間干預(yù)(1～3 d)時，未見其對高糖條件下BMSCs增殖的影響，而長時間干預(yù)(7 d)時，低濃度(1 nmol/L)Exendin-4可略增加高糖培養(yǎng)的BMSCs增殖，但無統(tǒng)計學(xué)意義，而高濃度(15 nmol/L)Exendin-4 在3、 7 d時均對BMSCs增殖有顯著抑制作用(P<0.05)(圖 2)。

圖 2 Exendin-4對高糖誘導(dǎo)的BMSCs增殖的影響

2.3 Exendin-4 對BMSCs ALP活性的影響

ALP活性檢測結(jié)果(圖 3)顯示：與對照組相比，HT組BMSCs 的ALP活性無明顯改變(P>0.05);與HT組相比，HG+E1組BMSCs ALP活性顯著增高(P<0.01)，HG+E5、HG+E10、HG+E15組BMSCs ALP活性與HT組相比有增高，但未見統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 3 Exendin-4對BMSCs ALP活性的影響

2.4 Exendin-4 對BMSCs向成骨細胞分化時鈣沉積量的影響

培養(yǎng)14 d后，對細胞進行茜素紅染色(圖 4)后觀察見：對照組礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)較少，HT、HG+E1、HG+E5、HG+E10、HG+E15組均出現(xiàn)成骨細胞礦化結(jié)節(jié)；半定量檢測(圖 5)結(jié)果顯示：15 nmol/L的Exendin-4可顯著抑制高糖培養(yǎng)下BMSCs的鈣沉積量(P<0.01)。

圖 4 BMSCs 不同濃度Exendin-4干預(yù)14 d茜素紅染色(×40)

圖 5 BMSCs茜素紅染色半定量分析

3 討 論

隨著人們生活條件不斷提高，糖尿病的患病率也迅速提高。據(jù)2010流行病學(xué)調(diào)查，我國成年人糖尿病患病率為11.6%，糖尿病前期患病率為50.1%[9]。糖尿病是影響牙種植修復(fù)的一個高風(fēng)險因素，其高糖環(huán)境不利于骨髓間充質(zhì)干細胞發(fā)揮功能，減少成骨轉(zhuǎn)化，影響種植體周圍骨結(jié)合。GLP-1類藥物是一類在臨床上廣泛應(yīng)用的降糖藥物。有研究發(fā)現(xiàn)GLP-1激動劑可促進骨形成，抑制骨吸收，增強骨材料性能[10]。 Pereira等[11]發(fā)現(xiàn)Exendin-4可以改善糖尿病大鼠骨增量。

種植體周圍骨結(jié)合的關(guān)鍵是骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。成骨細胞的分化過程包括增殖、細胞外基質(zhì)礦化、成熟等[12]。堿性磷酸酶來源于成骨細胞的分泌，其活性代表了成骨細胞的礦化能力，是成骨細胞分化成熟的早期標準之一[13]。成骨細胞可形成礦化結(jié)節(jié)，礦化結(jié)節(jié)若經(jīng)茜素紅染色呈紅色,說明體外培養(yǎng)的BMSCs有分化為成骨細胞的趨勢[14]。因此為探討高糖條件下 Exendin-4 能否促進 BMSCS的增殖、成骨分化，增加骨形成，本研究對BMSCs細胞進行了CCK-8增殖實驗以及對細胞堿性磷酸酶和礦化結(jié)節(jié)兩種成骨標志物進行了檢測。

有多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Exendin-4可促進BMSCs增殖分化，且其促進作用隨Exendin-4濃度增加而增強[15-17]。而本實驗通過檢測細胞增殖發(fā)現(xiàn)：細胞培養(yǎng)1、 3 d時，高糖條件下，Exendin-4對BMSCs的增殖能力無明顯促進作用。此結(jié)果與Paola等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)的Exendin-4短期干預(yù)(24、 48、 72 h)不影響MSC的增殖相似[18]。 7 d時，低濃度(1 nmol/L)Exendin-4可略增高高糖下BMSCs的增殖能力，但未見統(tǒng)計學(xué)意義，可能需要進一步延長干預(yù)時間，而高濃度Exendin-4 (15 nmol/L)對高糖條件下BMSCs的增殖能力有明顯的抑制作用。ALP檢測結(jié)果示高糖條件下， Exendin-4 1～15 nmol/L干預(yù)下BMSCs均有向成骨細胞分化的趨勢，具有成骨活性，其中，Exendin-4 1 nmol/L時其對BMSCs的成骨分化效應(yīng)最佳；茜素紅染色半定量分析示14 d時，各組細胞基質(zhì)均出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，Exendin-4 15 nmol/L對BMSCs成骨分化成熟有抑制作用。

綜上研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過較長時間的高糖培養(yǎng)和Exendin-4干預(yù)，高濃度(15 nmol/L)Exendin-4可抑制細胞增殖與分化成熟,而低濃度的Exendin-4對BMSCs的增殖能力雖無明顯促進作用但可促其成骨細胞標志物ALP分泌增加。此結(jié)果說明在較長時間低濃度Exendin-4干預(yù)下BMSCs ALP濃度的升高并非由細胞數(shù)量增多所致，而可能通過低濃度Exendin-4促進細胞成骨相關(guān)通路而使分泌增加。有研究發(fā)現(xiàn)Exendin-4能通過Wnt/β-catenin、Hedgehog/Gli1、PKA-STAT3通路、RANKL/RANK/OPG 系統(tǒng)等途徑促進BMSCs增殖分化[19-20]。因此要明確低濃度Exendin-4促進細胞ALP分泌增加的途徑，還需后續(xù)實驗探索其機制。此外，除ALP外，OCN也是骨細胞成熟的重要評價指標之一，而RUNX是成骨分化過程中的必要因子，它能調(diào)控OCN轉(zhuǎn)錄因子的表達，增加RUNX2基因的表達，就能夠增強BMSCs向成骨細胞的誘導(dǎo)[21-23]。所以為進一步完善實驗，本課題還需通過定量檢測OCN、RUNX2基因?qū)?yīng)的mRNA進行研究。