云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌對甲霜靈敏感性測定

錢紅潔，劉 霞，郭 琳，張 哲，李貴吉，楊 俐，楊艷麗

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，昆明 650201 2.會澤縣駕車鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)技術推廣站，云南會澤 654218 3.大理市植保植檢站，云南大理 671003)

馬鈴薯晚疫病是由卵菌綱致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary]引起的毀滅性病害，一般年份可導致馬鈴薯減產(chǎn)10%～20%，發(fā)病重的年份可減產(chǎn)50%～70%，甚至絕收。防治馬鈴薯晚疫病的措施有種植抗病品種、種薯消毒、化學防治、生物防治、加強田間栽培管理以及預測預報等，其中最經(jīng)濟有效的是種植抗病品種。由于近年來各產(chǎn)區(qū)種薯的頻繁調(diào)運，加之晚疫病菌極易發(fā)生變異，特別是A2交配型出現(xiàn)以后，垂直抗性品種容易喪失抗性，當晚疫病大面積發(fā)生時主要依賴化學防治[1-2]。甲霜靈為苯基酰胺類殺菌劑，是防治晚疫病的有效藥劑之一，1977年在生產(chǎn)上推廣應用，該類藥劑對馬鈴薯晚疫病有很好的防治效果，具有保護兼治療的作用[3]。但長期大量施用該藥劑，易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[4]。1981年Davidse等[5]和Dowley等[6]首次報道在荷蘭和愛爾蘭發(fā)現(xiàn)甲霜靈抗性菌株，隨后全球各地區(qū)均有報道。在國內(nèi)，1998年李煒等[7]首先報道采自河北、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅等地的馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈敏感性情況。2010年以來，全國各省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)甲霜靈抗性菌株比例呈逐年上升趨勢[8-10]。2018年霍超等[11]報道云南省昆明市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)甲霜靈抗性菌株比例高達100%。但其采集地點和試驗樣本量有限，不能真實反映云南省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈敏感性的現(xiàn)狀，目前仍缺乏對云南省馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈敏感性情況的系統(tǒng)深入研究。本研究對2018-2020年采自云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌進行甲霜靈敏感性測定，明確其甲霜靈抗藥性水平，為科學防治馬鈴薯晚疫病提供依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試馬鈴薯晚疫病菌共301株，由2018-2020年采自云南省春作區(qū)的馬鈴薯晚疫病樣品分離純化所得(表1)。

供試菌株編號規(guī)則：地點+寄主品種+(海拔)+編號。

1.2 供試藥劑

98%甲霜靈原藥，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲亞砜(DMSO)，購自上海生工生物有限公司。

1.3 供試培養(yǎng)基

黑麥番茄培養(yǎng)基(1 L)：將番茄洗凈去皮用榨汁機打碎，加水1∶1稀釋，分裝至錐形瓶中，高壓滅菌鍋101 kPa、120 ℃滅菌30 min，待番茄汁冷卻后放入4 ℃冰箱中保存，備用。稱取50～60 g黑麥，加適量的水進行高溫滅菌30 min。將已滅菌的黑麥加水榨汁機打碎，加熱煮沸后過濾，取濾液850 mL，加入150 mL番茄汁，1.2 g CaCO3及瓊脂17 g，pH調(diào)為6.5～7.0，分裝至錐形瓶中，高壓滅菌2次。倒平板，備用。

含甲霜靈質(zhì)量濃度為5 μg/mL、100 μg/mL的黑麥番茄培養(yǎng)基：98%甲霜靈原藥用滅菌的二甲亞砜溶解后配成100 mg/mL的母液，按上述方法做好黑麥番茄培養(yǎng)基，滅菌后冷卻到50 ℃，取定量母液與黑麥番茄培養(yǎng)基混勻配成所需質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基，搖勻，倒平板，備用。

含二甲亞砜50 μL/L、1 mL/L的黑麥番茄培養(yǎng)基：按上述方法做好黑麥番茄培養(yǎng)基，滅菌后冷卻到50 ℃，取定量二甲亞砜與黑麥番茄培養(yǎng)基混勻配成所需體積分數(shù)的含藥培養(yǎng)基，搖勻，倒平板，備用。

1.4 甲霜靈敏感性測定

晚疫病菌甲霜靈敏感性測定采用菌落直徑法[12]。先用5 mm打孔器在含藥培養(yǎng)基上打孔，再切取相同直徑的待測菌株菌餅反貼于含藥平板中央，每個處理3次重復。20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d(對照菌落直徑大于50 mm)，第8天用十字交叉法量取菌落直徑。根據(jù)含藥平板菌落直徑與空白對照菌落直徑的比值測定供試菌株的甲霜靈敏感性。甲霜靈敏感性劃分標準為：含甲霜靈5、100 μg/mL平板菌落直徑<40%對照菌落直徑為敏感菌株(S)；含甲霜靈5 μg/mL平板菌落直徑≥40%對照菌落直徑且100 μg/mL平板菌落直 徑<40%對照菌落直徑為中抗(MR)；含甲霜靈5、100 μg/mL平板菌落直徑≥40%對照菌落直徑為高抗菌株(R)。

2 結果與分析

2.1 二甲亞砜對馬鈴薯晚疫病菌生長的影響

由表2可知，隨機選取來自迪慶州香格里拉市、大理州洱源縣、麗江市玉龍縣、曲靖市馬龍區(qū)和會澤縣的8個菌株進行二甲亞砜敏感性測定，結果表明：CK菌落直徑在5.00～5.70 cm，50 μL/L DMSO菌落直徑在4.93～5.70 cm， 1 mL/L DMSO菌落直徑在4.88～5.67 cm，不同濃度的二甲亞砜對這8個馬鈴薯晚疫病菌的菌落直徑?jīng)]有顯著性差異(P>0.05)，表明溶劑二甲亞砜不會影響晚疫病菌的生長，可以作為溶劑溶解98%甲霜靈原藥。

2.2 甲霜靈對馬鈴薯晚疫病菌生長的影響

由表3可知，選用與二甲亞砜敏感性測定相同的8個菌株進行甲霜靈敏感性測定，結果表明CK菌落直徑在5.00～5.70 cm，5 μg/mL甲霜靈菌落直徑在4.65～5.22 cm，100 μg/mL甲霜靈菌落直徑在0.63～4.25 cm；不同濃度的甲霜靈對這8個馬鈴薯晚疫病菌的菌落直徑有顯著性差異(P<0.05)，說明甲霜靈會影響晚疫病菌的生長，甲霜靈敏感性測定試驗具有可行性。

2.3 云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌對甲霜靈敏感性的測定

對2018-2020年云南省馬鈴薯春作區(qū)采集的301株晚疫病菌進行甲霜靈敏感性測定，結果表明：敏感性菌株所占比例較小，抗性菌株(高抗菌株和中抗菌株)占絕對優(yōu)勢。其中高抗菌株為230株，占總數(shù)的76.41%，中抗菌株為64株，占21.26%，敏感性菌株為7株，占2.33%(表4)。除2020年麗江市寧蒗縣檢測到7株敏感性菌株外，其余采集地點抗性菌株均已達100%，表明甲霜靈在這些區(qū)域已失效不能繼續(xù)使用。

表4 2018-2020年云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌甲霜靈敏感性Table 4 Sensitivity of metalaxyl to Phytophthora infestans in potato of spring cropping area of Yunnan province from 2018 to 2020

3 討論與結論

甲霜靈對馬鈴薯晚疫病有很好的防治效果，主要影響卵菌菌絲的生長以及吸器、孢子囊的形成[13]，在生產(chǎn)上一直被廣泛應用，但甲霜靈作用位點單一，長期使用該藥劑極易使晚疫病菌發(fā)生突變，產(chǎn)生抗藥性。近年來，全球馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的抗藥性日益嚴重[14]。趙志堅等[15]研究表明，2000-2003年云南省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈高抗、中抗和敏感菌株所占比例分別為13.2%、9.4%和77.4%。2003-2005年云南省馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈抗性菌株比例為 20.4%[16]。2015-2016年對云南省昆明市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)甲霜靈敏感性測定表明，高抗菌株占100%，未檢測到中抗和敏感性菌株[11]。上述研究均表明，甲霜靈抗性菌株在云南省已普遍存在，隨著甲霜靈在馬鈴薯晚疫病菌防治中的長期大量使用，抗性菌株逐年上升，致使甲霜靈防控效果顯著下降。

本研究結果顯示，2018-2020年云南省馬鈴薯春作區(qū)采集的301株菌株中76.41%表現(xiàn)高抗，21.26%表現(xiàn)中抗，2.33%表現(xiàn)敏感。所有采集地區(qū)均出現(xiàn)抗性菌株，這可能與當?shù)丶姿`施用情況密切相關，長期大量施用單一殺菌劑，導致病原菌產(chǎn)生選擇壓力，加快抗藥性群體的發(fā)展[15]；除在麗江市寧蒗縣檢測到7株甲霜靈敏感性菌株外，其余地區(qū)均未發(fā)現(xiàn)敏感性菌株，這可能是因為本試驗樣本容量有限，今后應擴大樣本容量，使實驗結果更接近實際情況。本研究只對云南省馬鈴薯春作區(qū)甲霜靈敏感性進行測定，冬作區(qū)甲霜靈敏感性情況待進一步研究。

雖然甲霜靈敏感性測定是馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性研究的重要組成部分，但從目前研究結果來看，甲霜靈抗藥性菌株在全國各地區(qū)已普遍存在，今后研究中除測定晚疫病菌對甲霜靈的敏感性外，還應對其他常用殺菌劑的敏感性進行測定，這樣才對實際生產(chǎn)更有指導意義。

2018-2020年云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌對甲霜靈敏感性已達97.67%，繼續(xù)使用甲霜靈防治馬鈴薯晚疫病其效果將下降，篩選和使用新型高效殺菌劑勢在必行。