多孢木霉HZ-31菌株活性物質(zhì)的初步分離及除草活性研究

朱海霞，藺澤榮，馬永強(qiáng)

(青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院，青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

化學(xué)除草劑從應(yīng)用至今已有70多年的歷史，在提高農(nóng)作物產(chǎn)量方面起到不可低估的作用[1]。但從20世紀(jì)70年代中期以來(lái)，抗藥性雜草種類一直呈上升趨勢(shì)[2-3]。同時(shí)，隨著環(huán)境保護(hù)呼聲的日益提高，高毒性農(nóng)藥的大量使用對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境造成的負(fù)面影響已引起世界范圍的廣泛關(guān)注。為了保護(hù)人類生存環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，除草劑的研制與使用將嚴(yán)格受到環(huán)境和生態(tài)的制約[4]。利用雜草病原微生物代謝產(chǎn)物中的活性物質(zhì)作為先導(dǎo)化合物，開(kāi)發(fā)微生物源除草劑，是新型除草劑研究的重要方向[5]。利用微生物等新型生物研發(fā)新型除草劑已經(jīng)迫在眉睫。

已報(bào)道的具有一定除草活性并有望開(kāi)發(fā)成微生物除草劑的真菌代謝產(chǎn)物有100余種，涵蓋近20個(gè)屬[6]。Miwa等[7]通過(guò)發(fā)酵液分離提取技術(shù)，從海洋中的一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中獲得兩種具有抑制稗草生長(zhǎng)的活性化合物新小環(huán)內(nèi)酷類化合bacilosarcins A和B。Vikrant等[8]對(duì)莖點(diǎn)霉(Phomaherbarum)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從中分離到的3-硝基鄰苯二甲酸，對(duì)銀膠菊表現(xiàn)出很強(qiáng)的除草活性。這些研究都為新型微生物源除草劑的發(fā)掘和除草活性的先導(dǎo)化合物的探索奠定了基礎(chǔ)。

研究事實(shí)證明，具有除草活性微生物中蘊(yùn)含著大量的天然活性產(chǎn)物，對(duì)這些天然活性化合物構(gòu)效關(guān)系及其除草機(jī)制的持續(xù)研究，為新型除草劑研發(fā)開(kāi)辟了有效途徑。此外，盡管有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的微生物被發(fā)現(xiàn)和鑒定，但仍然有超過(guò)現(xiàn)有已知10倍以上的微生物尚未被研究。因此，從大量微生物中開(kāi)發(fā)生防除草產(chǎn)品潛力巨大[9-10]。

多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31菌株是近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的對(duì)青海農(nóng)田雜草藜(ChenopodiumalbumL.)、野燕麥(AvenafatuaL.)、密花香薷(ElsholtziadensaBenth)、萹蓄(PolygonumaviculareL.)、薄蒴草[Lepyrodiclisholosteoides(C.A. Mey.)]、酸模葉蓼(PolygonumlepathifoliumL.)等具有廣譜、高效除草活性的一種雜草病原真菌[11-12]。作物安全性結(jié)果表明，該菌株對(duì)青海省主栽作物——油菜嚴(yán)重致病[11]。為明確HZ-31菌株中除草活性物質(zhì)，本研究選用野燕麥和油菜作為靶標(biāo)雜草，利用該菌株的發(fā)酵液和發(fā)酵濾液進(jìn)行除草活性對(duì)比，并在此基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)4種有機(jī)溶劑萃取后，測(cè)定萃取物對(duì)雜草葉片的致病效果，確定檢測(cè)活性物質(zhì)最佳有機(jī)相，為進(jìn)一步研究其活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：多孢木霉HZ-31菌株由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存，同時(shí)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為CGMCC No.12867。

供試植物：藜、野燕麥、密花香薷、萹蓄、薄蒴草、酸模葉蓼、冬葵、油菜。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，配方為去皮馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.2 多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵培養(yǎng)及活性物質(zhì)生測(cè)

1.2.1 多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵液和發(fā)酵濾液的制備 將多孢木霉菌株的斜面菌種制備成菌懸液，以φ=2%的接種量接種于PDB培養(yǎng)液，置智能恒溫?fù)u床(ZWY-1102)23 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，獲得發(fā)酵液[12]。發(fā)酵液用4層紗布過(guò)濾，去除菌絲體及雜質(zhì)。于4 000 r/min離心30 min，獲得上清液。于4 ℃冰箱中靜置24 h后離心，去除沉淀物，獲得發(fā)酵濾液。

1.2.2 多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對(duì)野燕麥和油菜種子萌發(fā)的影響 采用培養(yǎng)皿濾紙發(fā)芽法進(jìn)行試驗(yàn)。選取飽滿完整的野燕麥和油菜種子，用無(wú)菌水沖洗消毒。在直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中鋪上濾紙，分別加入待測(cè)生防菌發(fā)酵液及發(fā)酵濾液5 mL，每皿置20粒種子進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，每處理重復(fù)3次，以無(wú)菌水發(fā)芽處理作為對(duì)照。25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，每天打開(kāi)蓋子通氣1 h，隔天每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)充相應(yīng)處理液5 mL，采用ISTA規(guī)定的方法于第3天進(jìn)行首次計(jì)數(shù)，之后每天1次，第7天進(jìn)行末次計(jì)數(shù)。

以種子發(fā)芽長(zhǎng)度超過(guò)種子本身長(zhǎng)度作為種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，種子萌發(fā)抑制率計(jì)算公式為。

發(fā)芽率=第7天正常發(fā)芽種子總數(shù)/測(cè)試種子總數(shù)×100%。

種子萌發(fā)抑制率=(對(duì)照種子萌發(fā)率-處理種子萌發(fā)率)/對(duì)照種子萌發(fā)率×100%。

1.3 不同有機(jī)溶劑萃取物活性測(cè)定

1.3.1 不同有機(jī)溶劑萃取 參照“1.2.1”中的方法獲得發(fā)酵濾液，采用正丁醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯4種不同極性有機(jī)溶劑對(duì)4 L多孢木霉發(fā)酵濾液分別進(jìn)行等體積萃取。振蕩充分混合，靜置過(guò)夜待分層后以分液漏斗將有機(jī)相與水相分開(kāi)。萃取3次，合并相同有機(jī)相。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (EYEL)，正丁醇相45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，石油醚相和氯仿相37 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，乙酸乙酯相 34 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，各萃取相旋蒸至有機(jī)溶劑全部揮發(fā)，粗提物濃縮獲得浸膏。各有機(jī)相浸膏用甲醇預(yù)溶后，再加入蒸餾水進(jìn)行溶解，配制成 5 mg/mL和3 mg/mL粗提物溶液，備用。

采用離體葉片接種法和種子萌發(fā)法測(cè)定除草活性，判斷其活性物質(zhì)的極性。采用離體葉片接種法和種子萌發(fā)法進(jìn)行活性追蹤，根據(jù)葉片受侵染狀況及種子萌發(fā)抑制率確定除草活性物質(zhì)極性組分。

1.3.2 離體葉片處理法測(cè)定除草活性 田間采集新鮮的野燕麥、冬葵、密花香薷、萹蓄、酸模葉蓼、薄朔草、藜雜草的葉片，置于自封袋后帶回室內(nèi)用流動(dòng)水沖洗，7種雜草葉片取各一片盛放在已滅菌并鋪有濾紙的大培養(yǎng)皿(φ=15 cm)中，采用針刺法將不同有機(jī)溶劑粗提物5 mg/mL溶液50 μL定量滴加在葉片上，以滴加甲醇的處理作為對(duì)照組。每處理重復(fù)3次。置于室溫自然光下，對(duì)7種供試雜草葉片受侵染狀況進(jìn)行不定期觀測(cè)，通過(guò)葉片發(fā)黃、失綠、枯萎等病害癥狀確定侵染程度。比較4種極性有機(jī)溶劑粗提物對(duì)不同雜草葉片的離體致病性。

1.3.3 種子萌發(fā)處理法測(cè)定除草活性 將種子整齊擺放于鋪有濾紙的種子培養(yǎng)皿中，每皿野燕麥種子4粒、油菜種子8粒，加入濃度為5 mg/mL的各有機(jī)相粗提物溶液各100 μL，為減少溶劑對(duì)種子萌發(fā)的影響，粗提物溶液滴加到濾紙上，待濾紙完全干后再均勻滴加0.5 mL滅菌水，每個(gè)處理5次重復(fù)，甲醇作為空白對(duì)照。25 ℃±1 ℃下黑暗培養(yǎng)，5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和抑制率。

將濾紙平鋪在經(jīng)滅菌處理的玻璃培養(yǎng)皿中，野燕麥種子20粒，油菜種子20粒，分別加入各有機(jī)相濃度3 mg/mL粗提物溶液各100 μL，待濾紙完全干后再均勻滴加3 mL滅菌水，每個(gè)處理3次重復(fù)，甲醇作為空白對(duì)照。25 ℃±1 ℃下黑暗培養(yǎng)，5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孢木霉HZ-31發(fā)酵培養(yǎng)及活性物質(zhì)生測(cè)

由表1可以看出，HZ-31菌株發(fā)酵液對(duì)野燕麥和油菜的種子萌發(fā)抑制率分別為70.00%和86.67%，HZ-31菌株發(fā)酵濾液對(duì)野燕麥和油菜的種子萌發(fā)抑制率分別為80.00%和91.67%。對(duì)胚根、胚芽生長(zhǎng)抑制作用明顯(圖1)。菌株發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理后，野燕麥和油菜的種子發(fā)芽率和萌發(fā)抑制率差異顯著，二者的胚芽和胚根抑制率無(wú)顯著差異。說(shuō)明活性物質(zhì)存在于發(fā)酵濾液和發(fā)酵液中，且發(fā)酵濾液中活性高于發(fā)酵液。

表1 HZ-31菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液處理下野燕麥和油菜種子萌發(fā)Table 1 Seed germination of A.fatua and B.napus treated with fermentation broth and filtrate of strain HZ-31

2.2 不同有機(jī)溶劑萃取物除草活性分析

離體葉片接種法除草活性：用5 mg/mL的乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚、氯仿相分別處理7種雜草葉片，粗提物溶液處理1 d后，雜草葉片出現(xiàn)黃化，部分葉面變褐(圖2)。正丁醇粗提物對(duì)密花香薷、酸模葉蓼、冬葵離體葉片具有強(qiáng)烈的致病性，侵染后的病斑面積占整個(gè)葉面積的60%以上。對(duì)野燕麥、萹蓄、薄蒴草有中度侵染，病斑面積占整個(gè)葉面積的16%～59%。對(duì)藜有輕度侵染。乙酸乙酯相粗提物對(duì)藜和萹蓄葉片有輕微的致病性，對(duì)其余5種雜草葉片表現(xiàn)出中度侵染。石油醚相粗提物對(duì)藜、萹蓄和酸模葉蓼葉片有輕微的致病性，對(duì)其余4種雜草葉片表現(xiàn)出中度侵染。氯仿相粗提物對(duì)密花香薷和薄蒴草葉片有輕度侵染，對(duì)野燕麥和冬葵葉片有中度侵染(表 2)。結(jié)果表明不同有機(jī)相致病效果由強(qiáng)到弱表現(xiàn)為正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚>氯仿相。確定最佳活性組分在正丁醇相中。

表2 4種極性有機(jī)溶劑粗提物對(duì)不同雜草離體葉片的致病性(處理后1 d)Table 2 Pathogenicity of four organic solvent extracts on different weeds in vitro(1 d after treatment)

正丁醇相處理1 d后，雜草葉片超過(guò)1/3葉面積出現(xiàn)黃化并產(chǎn)生病斑，處理3 d后，超過(guò)1/2葉面積失綠變褐，處理5 d后4/5葉片失綠，整個(gè)葉片枯黃萎蔫，其上產(chǎn)生白色霉層(圖2)。

種子萌發(fā)法除草活性：4種有機(jī)溶劑萃取相粗提物5 mg/mL溶液對(duì)野燕麥和油菜種子萌發(fā)均有強(qiáng)烈的抑制作用，除乙酸乙酯外，其余處理完全抑制胚芽、胚根生長(zhǎng)，發(fā)芽抑制率為100%，無(wú)顯著性差異(表 3)。

表3 4種有機(jī)相粗提物對(duì)野燕麥、油菜種子的抑制Table 3 Inhibition of four kinds of organic fraction crude extracts on seeds of A.fatua and B.napus

4種有機(jī)相粗提物溶液對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用表明，3 mg/mL濃度下正丁醇相粗提物能完全抑制野燕麥和油菜種子的萌發(fā)，而該濃度下乙酸乙酯相粗提物對(duì)野燕麥種子發(fā)芽抑制率為 16.67%，對(duì)油菜種子發(fā)芽抑制率為53.70%。石油醚相和氯仿相粗提物對(duì)野燕麥種子發(fā)芽抑制率分別為25.92%和29.63%，對(duì)油菜種子發(fā)芽抑制率分別為62.97%和42.59%(表 3)。乙酸乙酯相、石油醚相氯仿相之間抑制率不存在顯著差異，正丁醇相與其他3種有機(jī)溶劑相相比差異顯著，因此，粗提物活性測(cè)定以離體葉片生測(cè)法和種子萌發(fā)結(jié)果為依據(jù)，確定最佳活性組分在正丁醇 相中。

3 討論與結(jié)論

萃取為從液相中提取分離有效成分的最常用手段。該方法是利用溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶液相中溶解度的差異，將目的化合物從液體混合物中分離開(kāi)來(lái)[13-14]。針對(duì)HZ-31菌株代謝產(chǎn)物中有效成分在兩相體系中的溶解的情況進(jìn)行分析，挑選出可以用于萃取的溶劑。本研究選取正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿這4種有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取試驗(yàn)，進(jìn)而判斷其活性物質(zhì)的極性。

多孢木霉菌株在高溫高濕條件下發(fā)病, 通過(guò)侵染植物引起腐爛,但是關(guān)于其產(chǎn)生的除草活性物質(zhì)，目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)HZ-31菌株發(fā)酵濾液對(duì)野燕麥和油菜的種子萌發(fā)抑制率分別為80.00%和91.67%，對(duì)胚根、胚芽生長(zhǎng)抑制作用顯著，且發(fā)酵濾液活性高于發(fā)酵液。不同有機(jī)溶劑萃取物對(duì)7種雜草葉片的致病效果由強(qiáng)到弱表現(xiàn)為：正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚>氯仿相。5 mg/mL正丁醇粗提物對(duì)密花香薷、酸模葉蓼、冬葵離體葉片具有強(qiáng)烈的致病性，處理5 d后4/5葉片失綠，整個(gè)葉片枯黃萎蔫。4種有機(jī)溶劑萃取相粗提物5 mg/mL溶液對(duì)野燕麥和油菜種子萌發(fā)均有強(qiáng)烈的抑制作用，3 mg/mL濃度下正丁醇相粗提物能完全抑制野燕麥和油菜種子的萌發(fā)。因此，粗提物活性測(cè)定以離體葉片生測(cè)法和種子萌發(fā)結(jié)果為依據(jù)，確定最佳活性組分在正丁醇相中。

利用雜草病原微生物代謝產(chǎn)物中的活性物質(zhì)作為先導(dǎo)化合物，開(kāi)發(fā)微生物源除草劑，是新型除草劑研究的重要方向[5]。篩選、利用和開(kāi)發(fā)該類代謝產(chǎn)物，是目前雜草生防領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Javaid等[14]報(bào)道哈茨木霉(T.harzianumRifai)、擬康氏木霉(T.pseudokoningiiRifai)、里氏木霉(T.reeseiSimmons)、綠色木霉(T.viridePers)的粗提物對(duì)麥田雜草小子虉草(PhalarisminorL.)、齒果酸模(RumexdentatusL.)有較好的抑制活性；Cimmino等[15]發(fā)現(xiàn)擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsissp.)產(chǎn)生的毒素可以防治澳大利亞馬紅花(Carthamuslanatus)等。這些研究都為發(fā)掘新型天然產(chǎn)物農(nóng)藥和尋找具有除草活性的先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ)。

微生物發(fā)酵產(chǎn)物常常是伴有許多化合物的混合體，有效活性物質(zhì)可能只是其中的一種或幾種，因此，分離純化是能夠?qū)⒛康漠a(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性質(zhì)研究的前提[16]。本研究通過(guò)離體葉片生測(cè)法和種子萌發(fā)法對(duì)多孢木霉HZ-31菌株活性物質(zhì)進(jìn)行了初步分離，并對(duì)除草活性進(jìn)行了研究，下一步有望通過(guò)薄層層析、柱層析、高效液相色譜HPLC方法等分離分析技術(shù)對(duì)多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵液中的除草活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，逐步明確發(fā)酵液中除草作用的成分，并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。