櫛孔扇貝FTZ-F1基因的序列特征及表達(dá)分析

慕雪嬌，劉曉玲，贠 晗，崔龍波

（煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005）

FTZ-F1基因最初作為果蠅（Drosophila melanogaster）早期胚胎形成階段分化基因ftz的同源異形盒被發(fā)現(xiàn)［1］。在哺乳動物中，根據(jù)其功能和表達(dá)模式分為兩個亞族，一個亞族主要在胰腺、肝臟、腸和卵巢中表達(dá)，參與膽固醇和膽汁酸代謝的調(diào)控［2］，稱為肝臟受體激素／甲胎蛋白轉(zhuǎn)錄因子（LRH-1／FTF）或NR5A2［3］，另一個亞族主要在腎上腺皮質(zhì)、卵巢、精巢、胎盤、脂肪和腦中表達(dá)，是下丘腦-垂體-性腺軸和腎上腺皮質(zhì)內(nèi)分泌功能的重要調(diào)節(jié)因子，在性腺分化中發(fā)揮重要作用［4-5］，稱為類固醇生成因子-1／腎上腺4結(jié)合蛋白（SF-1／Ad4BP）［6］，SF-1在性腺中的表達(dá)呈現(xiàn)二態(tài)性，以小鼠（Mus musculus）為例，當(dāng)兩性出現(xiàn)形態(tài)學(xué)差異時(shí)，在雌性中表達(dá)會降低［7］，因此認(rèn)為其可能與性別決定有關(guān)［8］。

隨著研究深入，越來越多低等生物的FTZF1基因也逐漸被發(fā)現(xiàn)，但在低等生物中，F(xiàn)TZ-F1基因的亞家族分類、命名和表達(dá)并不完全與哺乳動物相同，相對于高等哺乳動物可明確分為兩個亞族而言（根據(jù)其功能和表達(dá)模式），低等生物FTZ-F1基因的表達(dá)和功能可能更加復(fù)雜和多樣。例如，YOSHIURA和SENTHILKUMARAN［9］對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）FTZ-F1基因的表達(dá)特征分析發(fā)現(xiàn)，相對于NR5A2亞家族，F(xiàn)TZ-F1基因表達(dá)模式更傾向于和SF-1聚為一類，認(rèn)為該FTZ-F1基因應(yīng)歸類到尼羅羅非魚SF-1亞家族；但郭變［10］對尼羅羅非魚的FTZ-F1基因進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因與SF-1亞家族并不能聚為一類，而應(yīng)屬于NR5A4亞族。斑馬魚（Danio rerio）中發(fā)現(xiàn)4種FTZ-F1基因，對其序列進(jìn)行比對分析后發(fā)現(xiàn)，斑馬魚ff1a和ff1基因可被歸類于NR5A2亞家族，但這兩種基因的表達(dá)模式和功能卻與哺乳動物NR5A2不相符［11］。郭變［10］對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）和大鱗副泥鰍（Paramisgarnus dabryanus）FTZ-F1基因的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ-F1基因在序列上與NR5A2亞家族的同源性高于SF-1，但其表達(dá)特征卻與高等脊椎動物的SF-1表達(dá)特征更相似，同時(shí)其又在肝臟中表達(dá)，說明也具有NR5A2的特性。上述研究表明，在低等生物中FTZ-F1基因的亞家族歸類要考慮該基因的序列分析和表達(dá)特征等多方面因素。

目前為止，F(xiàn)TZ-F1相關(guān)研究大都針對脊椎動物開展，無脊椎動物中研究相對較少。對刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）FTZ-F1在成蝦卵巢、睪丸、眼柄、表皮和新孵化的無節(jié)幼體中的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，其在以上組織中均有表達(dá)，認(rèn)為該基因在對蝦早期胚胎和幼體發(fā)育中發(fā)揮作用，在表皮中的表達(dá)表明該基因可能參與了蛻皮過程，但其他組織中的作用未進(jìn)行深入分析［12］。大型溞（Daphnia magna）中發(fā)現(xiàn)了兩種FTZ-F1亞型，收集雌雄胚胎進(jìn)行表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，在單細(xì)胞和原腸胚期，兩種亞型在雄性中的表達(dá)量都是雌性的兩倍，認(rèn)為該基因可能是大型溞環(huán)境性別決定機(jī)制中產(chǎn)生雄性個體所必需的［13］。在中華鱉（Pelodiscus sinensis）中發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贜R5A2，在心臟、肝臟、脾臟、腦、胃、肌肉、精巢、卵巢中均有表達(dá)，在肝臟和卵巢中表達(dá)量較高，推測其可能在中華鱉生殖功能和肝功能調(diào)控中有重要作用，在性腺分化初期表達(dá)量最高，隨后顯著下降，表明該基因可能參與中華鱉的性別分化過程［14］。對埃及伊蚊（Aedes aegypti）［15］及三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）［16］中該基因的研究主要集中在蛻皮方面，認(rèn)為該基因在蛻皮過程中發(fā)揮調(diào)控作用。軟體動物中僅見紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）、虎斑烏賊（Sepia pharaonis）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulate）等多數(shù)來源于基因組測序獲得的FTZ-F1亞家族基因序列，但尚未見表達(dá)相關(guān)研究。

櫛孔扇貝是一種雌雄異體且性別穩(wěn)定的雙殼貝類，是我國北方沿海重要的經(jīng)濟(jì)貝類［17］。櫛孔扇貝的性別和性腺分化相關(guān)基因研究對于掌握其性別形成的機(jī)理具有理論意義。本研究通過對櫛孔扇貝FTZ-F1基因序列特征、組織表達(dá)特征、性腺發(fā)育周期表達(dá)特征的檢測和分析，一方面為研究FTZ-F1基因在櫛孔扇貝性腺分化和發(fā)育中發(fā)揮的作用提供基礎(chǔ)資料，另一方面為了解FTZ-F1基因在軟體動物中的表達(dá)模式研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

櫛孔扇貝購自煙臺大學(xué)附近海鮮市場，于實(shí)驗(yàn)室的過濾海水中暫養(yǎng)1 d，選取活力旺盛的扇貝進(jìn)行取樣。取各發(fā)育時(shí)期的性腺，一部分用Bouin’s液固定，后通過組織切片進(jìn)行發(fā)育時(shí)期鑒定［18］，另一部分存于－80℃冰箱，用于RNA提?。贿x取發(fā)育同步的雌雄個體各組織（含性腺、鰓、肝胰臟、腎臟、外套膜、閉殼?。┯谝旱兴賰龊蟠嬗冢?0℃冰箱，以備RNA提取。以上樣本取樣個體數(shù)各為3個。

1.2 總RNA提取與cDNA的合成

異硫氰酸胍法提取各組織RNA［19］，相關(guān)試劑購自上海生工生物公司。提取的RNA經(jīng)NanoDrop ND-2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度與OD值檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性。檢驗(yàn)合格的RNA按Evo M-MLV試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并保存于－20℃冰箱備用，實(shí)驗(yàn)所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 FTZ-F1基因序列獲得與分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)①本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)FTZF1基因擴(kuò)增引物（表1）。以櫛孔扇貝性腺cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR程序如下：94℃5 min、（94℃50 s，48℃45 s，72℃1 min 50 s）×38個循環(huán)；72℃10 min，獲得的產(chǎn)物送華大基因測序。對測得序列進(jìn)行分析：利用Clustal X和DNAman軟件進(jìn)行同源序列比對；利用Clustal X和MEGA4軟件，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用Swiss-Model同源建模服務(wù)器，預(yù)測FTZ-F1蛋白三維結(jié)構(gòu)。

1.4 各組織的RT-PCR

每個組織分別取3個不同個體的對應(yīng)RNA樣，按比例混合后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。FTZ-F1的RTPCR引物為P3／P4，β-actin作為內(nèi)參基因，其引物為A3／A4。不同組織中cDNA作為模板，以A3／A4為引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：94℃2 min、（94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s）×23個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，根據(jù)各組織條帶亮度重新調(diào)整模板量，直到檢測出各組織模板擴(kuò)增出的內(nèi)參基因PCR條帶亮度相似，以上述確定的模板量進(jìn)行FTZ-F1片段擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物后電泳檢測拍照。

1.5 性腺周期的qRT-PCR

分別取增殖期、生長期、成熟期的雌雄性腺，提取RNA后分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR特異引物為P3／P4（表1），內(nèi)參基因β-actin引物為A3／A4。每個發(fā)育時(shí)期性腺設(shè)置3個樣品重復(fù)，每個樣本設(shè)置2個技術(shù)重復(fù)，使用ABI7500型熒光定量PCR儀檢測，程序如下95℃10 min、（95℃15 s，60℃1 min，72℃30 s）×40個循環(huán)。設(shè)生長期精巢目的基因表達(dá)量為1，采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。以SPSS軟件包中one-way ANOVA進(jìn)行顯著性分析，最小顯著差法（least significant difference，LSD）多重檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（P＜0.05為顯著水平），用Origin85軟件進(jìn)行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫛孔扇貝的性腺發(fā)育周期組織切片

組織切片結(jié)果如圖1所示，在圖1-a和圖1-d中可以觀察到精巢和卵巢的濾泡壁上僅形成了一層或者兩層生殖細(xì)胞，表明此時(shí)扇貝的性腺已進(jìn)入增殖期；在圖1-b和圖1-e中已經(jīng)能夠觀察到明顯的濾泡腔，并且在濾泡壁上已經(jīng)形成多層生殖細(xì)胞，表明此時(shí)扇貝的性腺已經(jīng)進(jìn)入生長期；在圖1-c和圖1-f中精巢和卵巢的濾泡腔內(nèi)已經(jīng)充滿生殖細(xì)胞，精巢出現(xiàn)大量精子，卵巢中成熟卵被擠壓，呈不規(guī)則形狀，表明此時(shí)扇貝性腺已經(jīng)進(jìn)入成熟期［18］。

圖1 櫛孔扇貝不同發(fā)育時(shí)期的性腺組織學(xué)觀察Fig.1 Histological observation on gonads of Chlamys farreri in different developmental phases

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

如圖2所示，無脊椎動物的FTZ-F1蛋白聚為一類、脊椎動物的FTZ-F1蛋白聚為一類；櫛孔扇貝FTZ-F1蛋白首先與紫貽貝的NR5A2聚類，再與太平洋牡蠣的SF-1及葡萄牙牡蠣的FTZ-F1聚類，之后與虎斑烏賊NR5A2聚類，所顯示的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與物種的分類地位基本一致。但低等生物中關(guān)于FTZ-F1基因的研究較少，不能通過聚類分析明確櫛孔扇貝在同源性上與SF-1還是NR5A2更為接近。

圖2 不同物種SF-1、NR5A2、FTZ-F1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree of SF-1，NR5A2，F(xiàn)TZ-F1 protein from different species

2.3 目的基因序列特征分析

如圖3所示，櫛孔扇貝FTZ-F1基因CDS長1 668 bp，編碼555個氨基酸，含有DBD和LBD（LBD區(qū)域里含有一個激活功能域AF-2），F(xiàn)TZF1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測也顯示了這兩個保守區(qū)（圖4）。不同物種多序列比對結(jié)果如圖5所示，在櫛孔扇貝中該蛋白的保守區(qū)與其他物種的保守區(qū)較為一致，并也含有FTZ-F1家族特有的FTZ-F1盒。

圖3 櫛孔扇貝FTZ-F1基因CDS序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 CDSsequence and deduced amino acid sequence of FTZ-F1 gene of Chlamys farreri

圖5 不同物種的FTZ-F1同源蛋白序列對比Fig.5 Sequence comparison of FTZ-F1 homologous proteins from different species

2.4 FTZ-F1基因的組織表達(dá)結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示（圖6，圖7），F(xiàn)TZ-F1基因在櫛孔扇貝的多個組織中廣泛表達(dá)，在雌性個體中，該基因在閉殼肌、腎、鰓中表達(dá)比較明顯，在外套膜、肝胰腺和卵巢中表達(dá)相對較弱；在雄性個體中，該基因在精巢、閉殼肌、肝臟和腎中表達(dá)較強(qiáng)，在外套膜和鰓中表達(dá)相對較弱。

圖6 FTZ-F1的mRNA在雌性櫛孔扇貝組織中的半定量表達(dá)Fig.6 Semi-quantitative expression of FTZ-F1 mRNA in the tissues of female Chlamys farreri

圖7 FTZ-F1的mRNA在雄性櫛孔扇貝組織中的半定量表達(dá)Fig 7 Semi-quantitative expression of FTZ-F1 mRNA in the tissues of male Chlamys farreri

2.5 FTZ-F1基因性腺周期qRT-PCR結(jié)果

如圖8所示，F(xiàn)TZ-F1基因在卵巢的整個性腺發(fā)育時(shí)期表達(dá)量并沒有顯著變化，維持在一個相對穩(wěn)定的水平；而在精巢的性腺發(fā)育時(shí)期，F(xiàn)TZF1基因在增殖期和生長期的表達(dá)量沒有顯著差異（P＞0.05），但成熟期的表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），不僅明顯高于其他時(shí)期的精巢，也高于整個性腺發(fā)育時(shí)期的卵巢。

圖8 FTZ-F1基因在櫛孔扇貝不同性腺發(fā)育周期中的定量表達(dá)Fig.8 Expression of FTZ-F1 mRNA detected by qRT-PCR in Chlamys farreri gonads during reproductive cycle

3 討論

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，櫛孔扇貝FTZ-F1蛋白先與紫貽貝的NR5A2聚類，再與太平洋牡蠣的SF-1蛋白及葡萄牙牡蠣的FTZ-F1蛋白聚類，之后與虎斑烏賊的NR5A2聚類。在物種分類中，櫛孔扇貝和紫貽貝、牡蠣都屬于雙殼綱，而與虎斑烏賊同屬于軟體動物門，這一結(jié)果與其分類地位吻合。但進(jìn)化樹中幾種軟體動物的FTZF1基因亞家族歸類并不統(tǒng)一，紫貽貝NR5A2（其基因組序列號為：PRJEB24883）、太平洋牡蠣SF-1（其基因組序列號為：NC＿047565.1）、虎斑烏賊的NR5A2（其基因組序列號為：PRJEB33343）均是通過基因組測序獲得，對應(yīng)的基因從功能和表達(dá)上究竟接近于SF1還是NR5A2尚無報(bào)道，葡萄牙牡蠣FTZ-F1也僅見基因序列，無相關(guān)深入研究，無法結(jié)合功能及表達(dá)特征進(jìn)行準(zhǔn)確歸類。

較之于高等哺乳動物而言，低等動物FTZF1基因的歸類可能更具有多樣性，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）FTZ-F1基因的研究發(fā)現(xiàn)，其同時(shí)具有NR5A2亞族和SF-1亞族的組織表達(dá)特征，但氨基酸比對結(jié)果卻不能歸類于兩個亞族中的任何一個［20］，郭變［10］對兩種不同泥鰍FTZF1基因的研究發(fā)現(xiàn)，其序列分析與NR5A2同源性較近，但表達(dá)上卻同時(shí)具有NR5A2和SF-1兩個亞族的特征，無法簡單將其歸類為NR5A2或SF-1亞家族，印證了對于這類家族基因的亞家族歸類不能僅簡單地通過序列分析進(jìn)行，需要結(jié)合表達(dá)特征進(jìn)行。本研究認(rèn)同上述研究結(jié)論，對櫛孔扇貝中該基因的命名結(jié)合序列分析及表達(dá)特征發(fā)現(xiàn)，不能將其簡單地歸為SF-1或NR5A2，而應(yīng)統(tǒng)稱為FTZ-F1基因。

分析櫛孔扇貝FTZ-F1基因序列，發(fā)現(xiàn)其長1 668 bp，含DBD和LBD保守區(qū)（LBD保守區(qū)內(nèi)存在激活功能域AF-2，主要作用為維持LBD的激活狀態(tài)）。這些保守區(qū)是典型的核受體功能結(jié)構(gòu)域，與脊椎動物中該基因的保守結(jié)構(gòu)域是一致的［21］，其中DBD保守區(qū)是整個蛋白結(jié)構(gòu)中保守性最強(qiáng)的，具有調(diào)節(jié)核受體與激素應(yīng)答元件之間相互作用的功能；而LBD保守區(qū)是一個參與配體結(jié)合、介導(dǎo)二聚化作用、結(jié)合熱擊蛋白、核定位以及反式激活的多功能結(jié)構(gòu)域［8，22］。

FTZ-F1中，NR5A2最初從小鼠肝臟中被鑒定出來，稱為肝受體類似物［10］，在哺乳動物成體中主要在肝臟、腸道及卵巢等組織中表達(dá)，特別是在卵巢中高表達(dá)［23］，NR5A2在低等生物中的表達(dá)研究較少，已有的文獻(xiàn)顯示，其在魚類、中華鱉等物種的各組織中廣泛表達(dá)［5，14］；SF-1最初來源于鼠腎上腺皮質(zhì)瘤Y1細(xì)胞cDNA文庫和牛腎上腺蛋白提取物［24－25］，小鼠中，主要在腎上腺和性腺表達(dá)［26］。SF-1可調(diào)節(jié)小鼠雄性表型發(fā)育所需的睪酮分泌量［27］，雌雄胚胎分化后呈性別二態(tài)性表達(dá)，在睪丸中表達(dá)相對較高［26］；低等生物如紅點(diǎn)鮭（Salvelinus alpinus）、斑馬魚中，SF-1在腦、下丘腦、頭腎、肝臟和精卵巢等組織中廣泛表達(dá)［28－29］；尼羅羅非魚中，該基因在XY個體中的表達(dá)高于XX［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ-F1在櫛孔扇貝的性腺和肝臟中都有表達(dá)，表明該基因組織表達(dá)既有SF-1亞族特征也有NR5A2亞族特征，該基因在櫛孔扇貝的精巢中表達(dá)較強(qiáng)，認(rèn)為其表達(dá)特征更偏向于SF-1亞族，除了性腺和肝臟組織，其他組織中也存在該基因的表達(dá)，推測其在櫛孔扇貝中的作用較為廣泛。本研究發(fā)現(xiàn)，雌雄個體的組織表達(dá)特征存在差異，F(xiàn)TZ-F1在雌性扇貝的閉殼肌、腎、鰓組織中表達(dá)量較高；在雄性的精巢、閉殼肌、肝臟和腎組織中表達(dá)較為明顯。趙若男［31］利用熒光定量PCR檢測了多疣壁虎（Gekko japonicus）SF-1在雌雄成體不同組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在雌雄個體組織中表達(dá)也存在差異，且精巢中表達(dá)量顯著高于卵巢；雄性個體中，SF-1精巢中表達(dá)量最高，其次是心肌、骨骼肌和腦，肝臟和腎臟中的表達(dá)量較低，雌性個體中，SF-1在心肌中的表達(dá)量最高，其他各組織中有一定表達(dá)。黃河鯉（Cyprinus carpio）SF-1的表達(dá)研究也發(fā)現(xiàn)，該基因在雌雄個體的組織表達(dá)特征不同［32］。郭變對于兩種泥鰍中FTZ-F1的研究也發(fā)現(xiàn)，各組織中的表達(dá)有雌雄差異［10］。本研究中，F(xiàn)TZ-F1的組織表達(dá)也存在著雌雄差異，但目前為止造成雌雄組織差別表達(dá)的原因尚不明確，還有待于進(jìn)一步探究。

櫛孔扇貝的性腺發(fā)育周期主要包括增殖期、生長期和成熟期（圖1），通過對性腺發(fā)育周期中FTZ-F1表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因在成熟期精巢中的表達(dá)量最高，顯著高于其他時(shí)期的性腺，這種在雄性性腺中的表達(dá)特征偏向于SF-1亞族。對雄性金魚（Carassius auratus）中SF-1的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)［33］，該基因在成熟雄性金魚睪丸中的表達(dá)水平高于未成熟金魚的。有研究者通過共轉(zhuǎn)染方法研究發(fā)現(xiàn)，人FTZ-F1中的SF-1亞族能與佛波酯協(xié)同激活3β-HSD的表達(dá)，進(jìn)而影響睪酮合成［34］，提示SF-1與睪丸的內(nèi)分泌功能間接相關(guān)［27］，可能在睪丸發(fā)育過程中發(fā)揮作用［35］。祝輝等［27］利用反義轉(zhuǎn)染的方法，體外抑制了SF-1蛋白在小鼠睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)睪酮合成關(guān)鍵酶P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）的mRNA水平及睪酮的分泌量顯著下降，認(rèn)為SF-1可以調(diào)節(jié)睪酮的分泌。有研究顯示［17］，在櫛孔扇貝性腺發(fā)育周期中，睪酮的含量隨著配子發(fā)生而升高，在成熟期達(dá)到高峰。FTZ-F1在櫛孔扇貝成熟期精巢的較高表達(dá)，或許與成熟期精巢中睪酮含量顯著升高有一定的關(guān)系，推測FTZ-F1或通過參與睪酮生成影響了櫛孔扇貝的精巢發(fā)育，其具體的作用機(jī)制還需要深入研究。