海綿共附生放線菌Streptomyces parvulus MA1076的次級代謝產(chǎn)物研究

張夢雪，李歡歡，邵 峰，李宏基，吳文惠，孫 鵬

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 200433；3.空軍都江堰特勤療養(yǎng)中心，四川都江堰 611830）

放線菌在自然界中分布廣泛，與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，其次級代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種重要的生物活性［1－5］，目前報道的抗生素大約70%是放線菌產(chǎn)生的［6］。隨著人們對陸生放線菌的研究深入，挖掘結(jié)構(gòu)新穎的活性天然產(chǎn)物難度越來越大，尋找新的活性化合物成為藥物研究的重要目標(biāo)。20世紀(jì)60年代以來，人們將藥物研發(fā)的關(guān)注點轉(zhuǎn)向海洋微生物［7］，海洋微生物不僅資源豐富，特殊的生存環(huán)境（高壓、高鹽、低溫、低光照等）也賦予了其獨特的代謝途徑，進(jìn)而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特異、活性顯著的天然產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，大約27%種屬的海洋微生物具有抗菌活性［8］，其中來源于放線菌的活性代謝產(chǎn)物約占微生物來源的45%，結(jié)構(gòu)新穎的海洋放線菌代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)為藥物研發(fā)開辟了新途徑［9］。

海洋放線菌廣泛棲息于海洋動植物體表、體內(nèi)、海水及海底沉積物中［10］。尤其是具有獨特生理結(jié)構(gòu)的多孔動物海綿（Pseudoceratina sp.），其共附生放線菌一直是人們的研究重點。VALLIAPPAN等［11］通過分析3 003株海洋放線菌的16SrRNA序列，發(fā)現(xiàn)其中63%是海綿共附生放線菌；XIN等［12］從海綿共附生放線菌Streptomyces sp.LS298中分離到的化合物Quinomycin G具有明顯的抗腫瘤活性，對Jurkat細(xì)胞系（T細(xì)胞白血?。┯泻軓姷囊种谱饔茫↖C50值為0.414μmol·L－1）。因此，選擇海綿共附生放線菌進(jìn)行化學(xué)成分分析，篩選新型活性物質(zhì)，對新藥研發(fā)有重要意義。本文對海綿共附生放線菌Streptomyces parvulus MA1076進(jìn)行了菌株鑒定并對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海綿樣品于2012年8月采自于中國南海永興島，水深15～20 m，由中國科學(xué)院海洋研究所李錦和研究員鑒定，樣品標(biāo)本儲藏于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥化教研室（編號為GE3）。DNA提取使用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司）?；钚詼y試使用CellTiter-Glo?熒光活性檢測試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司）。

色譜填料包括Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（Pharmacia Biotech，Sweden），硅膠（100～200目和200～300目，煙臺黃務(wù)硅膠開發(fā)實驗廠）和GF254 TLC預(yù)制硅膠板（煙臺黃務(wù)硅膠開發(fā)實驗廠）。化學(xué)試劑包括乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇（均為分析純）和高效液相甲醇（色譜純），均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；顯色劑為10%硫酸香草醛溶液。

分離培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基（黃豆粉20.0 g，D-甘露醇20.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水1 L），種子培養(yǎng)基為TSB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨大豆肉湯30.0 g，去離子水1 L），發(fā)酵培養(yǎng)基為ISP2液體培養(yǎng)基（麥芽提取物10.0 g，酵母提取物4.0 g，胰蛋白胨4.0 g，去離子水1 L），細(xì)胞培養(yǎng)基為L Wnt-3A細(xì)胞專用培養(yǎng)基。

1.2 儀器設(shè)備

高壓滅菌鍋（松下健康醫(yī)療器械株式會社，MLS-3781L-PC型），微生物恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，SPX-150 B型），小型高速離心機(jī)（德國艾本德有限公司，5418型），PCR擴(kuò)增儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，T100型），NMR（Bruker，DRX600），LC-MS（Agilent，6224 TOFMS），多 標(biāo) 記 微 孔 板 檢 測 儀（PerkinElmer，EnVision型），高效液相色譜儀（Agilent，1200型）。

1.3 微生物的分離和培養(yǎng)

1.3.1 菌株的分離

無菌水沖洗海綿樣品2～3遍，用無菌剪刀剪碎，無菌水重懸，接種環(huán)蘸取重懸液劃線于MS固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，3～5 d后長出菌落，挑取生長形態(tài)與放線菌相似的菌落，接種至MS固體培養(yǎng)基上二次分離培養(yǎng)，挑選單菌落用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d后，用20%的甘油凍存于－20℃冰箱。

1.3.2 16SrDNA菌株鑒定

?。?0℃凍存的保種管接種于含有5 mL TSB培養(yǎng)基的試管中，28℃、220 r·min－1進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液2 mL，使用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒，提取出鏈霉菌基因組DNA，采 用 鏈 霉 菌 通 用 引 物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為25μL反應(yīng)體系（12.5μL PCR預(yù)混液，11μL水，0.5μL引物，0.5μL DNA模板），擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA測序，測序結(jié)果提交GenBank，并在NCBI網(wǎng)站上分析比對，相似序列用MEGA-7軟件根據(jù)neighbor-joining（NJ）方法對菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行種屬鑒定。

1.4 MA1076菌株中化合物分離純化

1.4.1 菌株發(fā)酵培養(yǎng)

配制50 mL TSB液體培養(yǎng)基6瓶，121℃高溫滅菌30 min，接入MA1076菌株，28℃、220 r·min－1進(jìn)行種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，48 h后得到種子液。取種子液5 mL接種到裝有200 mL ISP2培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中，28℃、220 r·min－1搖床培養(yǎng)7 d，總發(fā)酵體積10 L。

1.4.2 菌株化合物的提取分離

發(fā)酵液加入10 L乙酸乙酯，超聲破菌，提取3次，濃縮后得粗浸膏4.1 g。粗浸膏進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫（體積比依次為100∶0、100∶1、50∶1、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、0∶100），得到8個組分（M1～M8）。將M7組分過Sephadex LH-20凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，體積比2∶1）及HPLC（80%甲醇，流速1.5 mL·min－1）得到化合物1（28 mg，tR＝31 min），將M5組分過Sephadex LH-20凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，體積比2∶1）及HPLC（60%甲醇，流速1.5 mL·min－1）得到化合物2（16 mg，tR＝19 min）和化合物6（7 mg，tR＝21 min），將M6組分過Sephadex LH-20凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，體積比2∶1）及HPLC（60%甲醇，流速1.5 mL·min－1）得到化合物3（4 mg，tR＝20 min）、化合物4（5 mg，tR＝21 min）和化合物5（3 mg，tR＝24 min）。

1.5 化合物活性測試

吸取50μL細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加細(xì)胞培養(yǎng)基至50 mL，顛倒混勻，置于冰上。使用Multidrop自動分液器將細(xì)胞懸液以每孔45 μL均勻加入96孔板（注意設(shè)定第1列和第12列不加），細(xì)胞接種完畢后，置于37℃培養(yǎng)。細(xì)胞接種24 h后，對細(xì)胞96孔板進(jìn)行加藥（化合物1）處理，每孔5μL，其中第2列和第11列為DMSO對照組。加藥完畢后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。細(xì)胞加藥72 h后，使用CellTiter-Glo試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。使用Multidrop自動分液器將CellTiter-Glo試劑以每孔50μL均勻加入96孔板（注意設(shè)定第1列和第12列不加），避光，置于水平搖床15 min，使用EnVision多標(biāo)記微孔板檢測儀進(jìn)行結(jié)果檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果

菌株DNA測序結(jié)果提交NCBI，利用GenBank生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（https：／／pubmed.ncbi.nlm.nih.gov／）進(jìn)行序列的相似性比較分析，選取比對結(jié)果中相似性較高的菌株，在MEGA-7軟件中根據(jù)neighbor-joining（NJ）方法對菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）?；蛐蛄型葱员葘Ψ治霭l(fā)現(xiàn)，菌株MA1076與Streptomyces屬parvulus種相似性最高，相似度為99.93%，鑒定菌株MA1076為Streptomyces parvulus（表1）。

圖1 基于菌株MA1076的16S r DNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed on basis of 16Sr DNA of strain MA1076

表1 16S r DNA序列與NCBI中已知序列的比對結(jié)果Tab.1 16Sr DNA sequence blast with known sequences in NCBI

2.2 放線菌MA1076化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

從菌株MA1076中分離出的化合物，分別采用ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR波譜學(xué)方法鑒定了其中6個化合物，結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 化合物1～6的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structures of compounds 1～6

化合物1：橙紅色粉末，ESI-MS m／z：1 255.4［M＋H］＋，分子式C62H86N12O16，不飽和度為20。在1H-NMR中，δH8.17（1H，d，J＝5.4 Hz），δH8.01（1H，d，J＝5.6 Hz），δH7.72（1H，d，J＝6.6 Hz），δH7.62（1H，d，J＝7.8 Hz）處有4個N-H的氫信號，在δH2.90（3H，s）和δH2.93（3H，s）處有兩個N-CH3信號峰，在13C-NMR中，δC166～174范圍內(nèi)出現(xiàn)12個羰基碳信號。其苯氧環(huán)部分NMR數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：2.14（3H，s，H-4Me），2.46（3H，s，H-6Me），7.34（1H，d，J＝7.7 Hz，H-7），7.59（1H，d，J＝7.7 Hz，H-8）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：7.9（C-12），15.2（C-11），101.8（C-1），113.7（C-4），125.9（C-8），127.8（C-6），129.2（C-9a），130.4（C-7），132.7（C-9），140.6（C-5a），145.2（C-4a），146.0（C-10a），147.7（C-2），166.7（C-13），168.7（C-14），179.2（C-3）。環(huán)肽部分NMR數(shù)據(jù)見表2。以上數(shù)據(jù)與宋現(xiàn)芹等［13］報道的數(shù)據(jù)相符，確定該化合物為放線菌素D。

表2 化合物1的核磁數(shù)據(jù)Tab.2 NMR data of compound 1

化合物2：白色粉末，ESI-MS m／z：576.8［M＋H］＋，分子式C35H60O6，不飽和度為6。1H-NMR中顯示有6個甲基信號δH0.65（3H，s，H-18）、δH0.76-0.83（9H，m，H-26，H-27，H-29）、δH0.89（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21）、δH0.95（3H，s，H-19），13C-NMR中δC121.2（C-6）和δC140.5（C-5）顯示含有雙鍵結(jié)構(gòu)，根據(jù)不飽和度推斷結(jié)構(gòu)中含有5個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。其NMR數(shù)據(jù)歸屬如下：1HNMR（600 MHz，DMSO）δH：0.65（3H，s，H-18），0.76～0.83（9H，m，H-26，H-27，H-29），0.89（3H，d，J＝6.6 Hz，H-21），0.95（3H，s，H-19），3.64～3.75（2H，m，H-2′，H-5′），3.85～3.92（1H，m，H-3），4.21～4.32（2H，t，J＝7.8 Hz，H-3′，H-4′），4.43～4.46（2H，m，H-6′），4.86（1H，d，H-1′），5.35（1H，s，H-6）；13C-NMR（150 MHz，DMSO）δC：11.7（C-18），11.8（C-29），18.7（C-21），19.0（C-27），19.1（C-19），19.7（C-26），20.6（C-11），22.7（C-28），23.9（C-15），25.5（C-23），27.8（C-16），28.8（C-25），29.3（C-2），31.4（C-8），31.5（C-7），33.4（C-22），35.5（C-20），36.3（C-10），36.9（C-1），38.4（C-12），41.9（C-13），45.2（C-24），49.7（C-9），55.5（C-17），56.2（C-14），61.1（C-6′），70.2（C-4′），73.5（C-2′），76.8（C-5′），76.8（C-3），77.0（C-3′），100.8（C-1′），121.2（C-6），140.5（C-5）。以上數(shù)據(jù)與韻小娟等［14］報道的數(shù)據(jù)相符，確定該化合物為daucosterol。

化合物3：白色粉末，ESI-MS m／z：209.5［MH］-，分子式C11H18N2O2，不飽和度為4。在1HNMR的高場區(qū)有δH0.94（3H，d，J＝6.0 Hz）和δH0.96（3H，d，J＝6.6 Hz）兩個甲基峰，13C-NMR低場區(qū)的δC172.8和δC168.9兩個信號表明此處是兩個羰基碳。其NMR數(shù)據(jù)歸屬如下：1HNMR（600 MHz，CD3OD）δH：0.95（3H，d，J＝6.0 Hz），1.01（3H，d，J＝6.6 Hz），2.01～2.04（1H，m），1.51～1.56（1H，m），1.93～1.97（1H，m），4.27（1H，t，J＝7.1 Hz），4.13（1H，br.s），1.88～1.99（1H，m），2.30～2.34（1H，m），1.88～1.95，（1H，m），1.99～2.06（1H，m），3.52～3.55（2H，m）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：22.2（C-13），23.3（C-12），23.6（C-4），25.8（C-11），29.1（C-5），39.4（C-10），46.5（C-3），54.7（C-9），60.3（C-6），168.9（C-7），172.8（C-1）。以上數(shù)據(jù)與YANG等［15］報道的數(shù)據(jù)相符，確定該化合物為cyclo-（（S）-Pro-（R）-Leu）。

化合物4：白色粉末，ESI-MS m／z：243.1［M＋H］＋，分子式為C10H14N2O5，不飽和度為5。1HNMR中僅在δH1.85（3H，s）處有一個甲基峰信號，13C-NMR中在δC62.8，δC72.2、δC86.3、δC88.8處有4個連氧的碳信號。其NMR數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：1.85（3H，s，H-7），2.22（2H，m，H-2′），3.71（1H，d，J＝6.0，H-5′a），3.78（1H，d，J＝6.0，H-5′b），3.89（1H，m，H-4′），4.39（1H，m，H-3′），6.27（1H，dd，J＝6.0 Hz，H-1′），7.80（1H，s，H-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：12.4（C-7），41.2（C-2′），62.8（C-5′），72.2（C-3′），86.3（C-1′），88.8（C-4′），111.5（C-5），138.2（C-6），152.4（C-2），166.4（C-4）。以上數(shù)據(jù)與黃勝陽等［16］報道的數(shù)據(jù)相符，確定該化合物為thymidine。

化合物5：淡黃色固體，ESI-MS m／z：285.1［M＋H］＋，分子式為C12H16N2O6，不飽和度為6。其NMR數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：1.87（3H，s，H-7），2.08（3H，s，CH3COO），2.33（2H，m，H-2′），3.79（2H，m，H-5′），4.06（1H，m，H-4′），5.30（1H，m，H-3′），6.27（1H，dd，J＝6.1 Hz，H-1′），7.83（1H，s，H-6）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：12.4（C-7），20.9（CH3COO），38.4（C-2′），63.0（C-5′），76.4（C-3′），86.2（C-4′），86.7（C-1′），111.9（C-5），137.9（C-6），152.4（C-2），166.4（C-4），172.2（C-1）。以上數(shù)據(jù)與GOUDOU等［17］報道的數(shù)據(jù)相符，確定該化合物為3′-O-acetylthymidine。

化合物6：淡黃色固體，ESI-MS m／z：161.9［M＋H］＋，分子式為C9H7NO2，不飽和度為7。其NMR數(shù)據(jù)歸屬如下：1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：7.15～7.20（2H，m，H-6，7），7.42（1H，m，H-5），7.94（1H，s，H-2），8.06（1H，m，H-4）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：108.8（C-3），112.9（C-4），122.0（C-6），122.4（C-7），123.6（C-5），127.5（C-8），133.4（C-2），138.2（C-9），169.4（C-10）。以上數(shù)據(jù)與郭文娟和郭順星［18］報道的數(shù)據(jù)相符，確定該化合物為3-羧基吲哚。

2.3 化合物活性測試

測試6個化合物對兩株胰腺癌細(xì)胞系（pc-12和bc-16）的細(xì)胞增殖抑制活性，結(jié)果顯示，化合物1對兩株胰腺癌細(xì)胞均有明顯的增殖抑制活性（圖3），化合物2～6無明顯的細(xì)胞增殖抑制活性。

圖3 化合物1細(xì)胞增殖抑制活性結(jié)果Fig.3 Cell proliferation inhibitory activity of compound 1

3 討論

本文從海綿Pseudoceratina sp.共附生放線菌Streptomyces parvulus MA1076中分離得到6個已知化合物，除化合物1和2外，其他均為首次從放線菌中分離得到。化合物1最早分離自Streptomyces parvulus NBRC13193，且已用于藥物生產(chǎn)，是臨床常用的抗腫瘤藥之一，其能夠與DNA結(jié)合產(chǎn)生抗腫瘤作用，用于小兒腎母細(xì)胞瘤、侵襲性葡萄胎、絨毛膜上皮細(xì)胞癌以及橫紋肌肉瘤等惡性腫瘤的治療［19］，體外活性測試發(fā)現(xiàn)，其對胰腺癌細(xì)胞有顯著的增殖抑制活性，后續(xù)可以通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步探討該化合物的活性?；衔?是一種廣泛存在于植物中的甾醇，曾先后從內(nèi)生真菌Rhizopus oryzae KSD-815和鏈霉菌Streptomyces cavourensis YBQ59的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到［3，20］?；衔?具有廣泛的生物學(xué)活性，其對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌以及白血病等腫瘤細(xì)胞具有一定程度的抗增殖作用，在體內(nèi)外實驗中有良好的抗氧化作用，另外還有抗病毒、抗炎、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖等作用［21－25］。化合物3曾從海綿中分離得到［26］?；衔?、5為核苷類化合物，其中化合物5對肝癌細(xì)胞有中等強度的抗增殖作用［27］?；衔?除了具有抗HIV活性外［21］，還對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌有抑制活性［28］。

近年來大規(guī)模的基因組測序結(jié)果顯示，大部分放線菌都包含30個以上生物合成基因簇，相對于放線菌龐大的生物合成基因簇，本文對菌株MA1076次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究僅分離得到6個已知化合物。后期可以通過使用不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，或者高鹽、低光照等多種發(fā)酵條件，并擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模，以獲得更多結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的化合物?；蛘咄ㄟ^全基因組測序預(yù)測次級代謝產(chǎn)物，利用生物信息學(xué)分析基因簇中調(diào)控基因的作用，激活正調(diào)控或敲除負(fù)調(diào)控因子促使沉默基因表達(dá)；也可通過插入強啟動子、沉默基因過表達(dá)、異源表達(dá)等遺傳學(xué)手段激活其沉默基因，從而獲得更多結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物。

隨著對海綿及其共附生微生物研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識到海綿中不少化合物可能是其共附生微生物產(chǎn)生的，這些活性代謝物在海綿的生理代謝和生存防御中起著至關(guān)重要的作用，對海綿共附生放線菌的研究將豐富海洋天然產(chǎn)物的多樣性，為海洋藥物的研發(fā)提供科學(xué)基礎(chǔ)。