UPLC-MS／MS法同時(shí)測定參術(shù)散中的4種成分

鄭 東，陳雪梅，白晨龍，李 煌

（1.廈門市中醫(yī)院，福建 廈門361001；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

參術(shù)散是廈門中醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑（閩藥制字Z04202028），具有補(bǔ)脾胃、益肺氣的功效，臨床上主要用于氣短咳嗽、脾胃虛弱、食少便溏及消瘦乏力等［1］。該處方是在八珍糕的基礎(chǔ)上，結(jié)合閩南人的體質(zhì)特點(diǎn)遣方用藥［2］。目前在臨床中發(fā)現(xiàn)其對脾虛濕盛型糖尿病、腫瘤放化療后、消化系統(tǒng)疾病和老年?duì)I養(yǎng)不良患者效果確切。本制劑藥味眾多，主要 含 有 萜 苷 類［3］、黃 酮 類［4］、酚 酸 類［5］和 多 糖 類［6-7］等，目前，該院內(nèi)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡單，尚未見對制劑的化學(xué)成分同時(shí)定量的方法及相關(guān)研究。近年來，隨著2020版《中華人共和國藥典》的頒布，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求越來越高，同時(shí)測定中藥復(fù)方制劑中的多種成分含量，有利于對制劑進(jìn)行更好的質(zhì)量控制，提升用藥安全性和有效性。本實(shí)驗(yàn)首次建立UPLC-MS／MS法同時(shí)測定參術(shù)散中綠原酸、甘草苷、黨參炔苷和甘草酸銨4種成分含量的方法，并采用電噴霧電離源（ESI）、正負(fù)離子掃描方式以及多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，該方法快速、準(zhǔn)確，可為該制劑質(zhì)量控制提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器SCIEX QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜（SCI EX公司）；Nexera X2超高效液相色譜儀（日本島津公司）；TDL-40B低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XS105DU型十萬分之一分析天平（美國梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；乙腈、甲酸、乙酸銨（色譜純，德國Merck公司），Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司），其余試劑為分析純。

1.2 試藥 參術(shù)散（廈門市中醫(yī)院制備，批號(hào)：171027、181214、190515，規(guī)格50 g）。對照品甘草苷（111610-201005）、甘草酸銨（110731-201720）和綠原酸（110753-200413）購自中國藥品生物制品檢定院，齊墩果酸（HAO820KA14）和黨參炔苷（MUST-1706 2207）購自成都曼斯特生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 選用Shim-pack XR-ODSⅢ（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）色譜柱，流動(dòng)相以0.1%甲酸5 mmol／L乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0～2.0 min，10%B→90%B；2.0～5.0 min，90%B；5.0～5.5 min，90%B→10%B；5.0～8.0 min，10%B；流速0.30 mL／min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧（ESI）離子源，在正負(fù)離子模式下掃描，毛細(xì)管電壓為4.5 kV，脫溶劑溫度500℃、氣流為氮?dú)?00 L／h，錐孔氣流：氮?dú)?50 L／h，離子源溫度：550℃，二級(jí)錐孔萃取電壓：3.00 V，碰撞氣體：氬氣，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，4種成分各自的質(zhì)譜分析參數(shù)如表1所示。在上述的色譜質(zhì)譜條件下檢測，得到4個(gè)成分的MRM圖，如圖1所示。

表1 4種成分的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)

圖1 對照品UPLC-MS／MS色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 稱取2.0 g參術(shù)散樣品至具塞的錐形瓶中，加入100 mL 60%乙醇水溶液，于80℃水浴2 h，冷卻后補(bǔ)足重量，過濾，取25 mL濾液至150 mL平底燒瓶中，至45℃水浴旋蒸至干，加入5 mL 0.1%甲酸-10%甲醇水溶液，渦旋溶解，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，10 000 r／min離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得參術(shù)散供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液 精密稱定綠原酸、甘草苷、黨參炔苷和甘草酸銨的對照品，加入甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.310、1.250、1.000、1.060 mg／mL的單一對照品儲(chǔ)備液；分別精密量取上述對照品儲(chǔ)備液適量，置同一容量瓶中，加入20%甲醇水至刻度，即得4個(gè)化合物質(zhì)量濃度均為10 μg／mL的混合對照品儲(chǔ)備液，其他不同質(zhì)量濃度的對照品混合溶液由混合對照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，即得。

2.3 UPLC-MS／MS定量方法學(xué)考察

2.3.1 線性和范圍 取“2.2.2”項(xiàng)下各對照品儲(chǔ)備液適量，用20%甲醇稀釋配制系列梯度濃度的對照品混合溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜、質(zhì)譜條件，進(jìn)樣分析。以定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對照品溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），并以信噪比（S／N）＝10為定量下限（LOQ），結(jié)果見表2。

表2 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量下限

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取0.10 μg／mL的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行峰面積測定（測定條件同“2.1”項(xiàng)下），測定結(jié)果顯示，綠原酸、甘草苷、黨參炔苷和甘草酸銨4種成分的峰面積RSD分別為1.9%、0.98%、1.5%、2.2%，表明研究所用儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取參術(shù)散樣品（批號(hào)：190515），分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，共記錄6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的圖譜。結(jié)果顯示，樣品中綠原酸、甘草苷、黨參炔苷和甘草酸銨4個(gè)峰保留時(shí)間的RSD分別為1.01%、0.98%、1.65%、1.14%，均小于3.0%，峰面積的RSD分別為1.23%、1.57%、1.08%、0.92%，均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對穩(wěn)定，能滿足定量分析要求。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取參術(shù)散樣品（批號(hào)：190515），取參術(shù)散樣品（批號(hào)：190515）進(jìn)樣測定，制備方法同“2.2.1”項(xiàng)下，條件同“2.1”項(xiàng)下，結(jié)果綠原酸、甘草苷、黨參炔苷和甘草酸銨的平均含量分別 為16.10、19.75、155.00、52.40 μg／g，RSD分 別 為1.7%、1.4%、2.6%、2.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份參術(shù)散樣品（批號(hào)：190515），每份約1.0 g，分別加入折算質(zhì)量為本底量100%的混合對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試溶液，進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，記錄峰面積并計(jì)算各成分的加樣回收率。結(jié)果顯示，4種成分的回收率為91.05%～100.38%，平均回收率為94.40%～99.45%，RSD為1.04%～2.82%（n＝6），表明該方法的準(zhǔn)確度較好（見表3）。

表3 4種成分的回收率及RSD（n＝6）

2.3.6 各批次成分含量測定 精密稱取參術(shù)散樣品（每批樣品取2份），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下條件測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，3批參術(shù)散的4個(gè)化學(xué)成分含量雖然有一定的差異，但總體上差異不大，且3批樣品生產(chǎn)年份（分別為2017、2018和2019年）也不同，說明該制劑質(zhì)量比較穩(wěn)定的。

表4 各批次成分含量測定結(jié)果（n＝2） μg／g

3 討 論

3.1 參術(shù)散組方 參術(shù)散原方出自《太平惠民和劑局方》，有益氣健脾、滲濕止瀉功效，主治脾虛濕盛證。在本研究中，參術(shù)散是由黨參、茯苓、白術(shù)等共計(jì)11味中藥組成［8］，其中，黨參、白術(shù)、茯苓三者為君藥，并配伍山藥、蓮子，以助君藥發(fā)揮益氣健脾、滲濕止瀉之功效；白扁豆、薏苡仁二者為臣藥，增強(qiáng)其健脾化濕作用；佐藥砂仁醒脾和胃、行氣化滯；甘草健脾和中、調(diào)和諸藥，桔梗則宣肺利氣、通調(diào)水道，兩者共為佐使。全方補(bǔ)中氣、滲濕濁、行氣滯，使脾氣健運(yùn)，濕邪得去，則諸癥自除。與《中華人民共和國藥典》所收載的參苓白術(shù)散［9］的處方成分有所不同，該院內(nèi)制劑用黨參替換了人參，保證臨床藥效的同時(shí)降低了成本［10］；另外，還新增一味陳皮，可加強(qiáng)理氣化痰之功效?，F(xiàn)該制劑作為廈門中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，療效明確，相關(guān)研究主要是臨床方面的，質(zhì)量控制方面較少，故本研究建立同時(shí)測定參術(shù)散成分含量的UPLC-MS／MS方法有助于控制其質(zhì)量。

3.2 指標(biāo)成分的選擇 參術(shù)散中，黨參是一味君藥，而黨參炔苷是《中華人民共和國藥典》中黨參質(zhì)量評價(jià)的重要指標(biāo)［8］，許多研究也選擇其作為黨參指標(biāo)性成分［11-12］，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺以及抗氧化作用。另外，黨參、茯苓、白術(shù)中都含有綠原酸，其具 有 提 高 免 疫 力 的 作 用［13-15］，但 穩(wěn) 定 性 較 差［16］，需注意儲(chǔ)存條件。甘草補(bǔ)中益氣，能調(diào)和諸藥，含有甘草苷、甘草酸銨，具有潤肺止咳作用［17］，甘草苷還有抗?jié)冏饔茫?8］。因此，本研究以上述4種成分作為研究對象進(jìn)行初步考察，以期為參術(shù)散質(zhì)控提供參考。

3.3 色譜條件的選擇 在實(shí)驗(yàn)條件摸索中，我們分別考察Thermo C18（2.1 mm×150 mm，2 μm）、Shimpack XR-ODSⅢ色譜柱（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）、Thermo C18（2.1 mm×150 mm，2 μm）和Kinnetex C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）對參術(shù)散4個(gè)成分的分離效果，結(jié)果表明Shim-pack XR-ODSⅢ色譜柱（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）的分離度和靈敏度比其他色譜柱高。另外，在流動(dòng)相選擇中，考察了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的洗脫情況，發(fā)現(xiàn)前者洗脫能力弱，個(gè)別成分洗脫差；同時(shí)，為了提高離子響應(yīng)并改善峰型，又在流動(dòng)相中添加甲酸和乙酸銨，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%、乙酸銨水溶液濃度為5 mmol／L時(shí)，可達(dá)到提高靈敏度、改善峰型的作用。因此，0.1%甲酸5 mmol／L乙酸銨水溶液-乙腈為最佳，短時(shí)間內(nèi)（8 min）即可實(shí)現(xiàn)了參術(shù)散4個(gè)成分的分離定量，單針樣品所消耗的流動(dòng)相不足3 mL，明顯優(yōu)于高效液相色譜法。

3.4 質(zhì)譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)在探索離子掃描模式時(shí)，考察正、負(fù)離子模式下4種成分的響應(yīng)情況，結(jié)果顯示，甘草酸銨在正離子模式下響應(yīng)較高，而甘草苷、綠原酸、黨參炔苷則是負(fù)離子模式響應(yīng)較好，因此用正負(fù)離子掃描。通過優(yōu)化MRM條件，選擇定量最佳的離子對。施加一定的電壓使母離子發(fā)生碰撞后解離，從而獲得子離子，定性時(shí)選擇兩對高離子豐度、低基線噪聲的離子，定量則選擇最高離子豐度的離子對。通過優(yōu)化碰撞能量和源內(nèi)碎裂電壓，使所選的子離子達(dá)到最佳豐度及比例。

本實(shí)驗(yàn)研究了3批參術(shù)散，4種化合物含量雖存在一定差異，但波動(dòng)不大，說明該制劑質(zhì)量比較穩(wěn)定，但本研究僅測定了3批樣品，后續(xù)可擴(kuò)大樣本量，并對其他有效成分進(jìn)行更深入的研究。本實(shí)驗(yàn)建立的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，分析快速、準(zhǔn)確，可同時(shí)測定參術(shù)散4個(gè)成分含量，為綜合評價(jià)參術(shù)散質(zhì)量提供參考。