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    克隆杜洛克種公豬及其擴(kuò)繁后代的生產(chǎn)性能評(píng)價(jià)

    2021-08-10 08:08:22羅志文李?lèi)?ài)民呂培茹劉紅波鞠翠芳岳慧潔
    豬業(yè)科學(xué) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:杜洛克種豬公豬

    劉 建 ,鄒 輝 ,羅志文 ,李?lèi)?ài)民 ,呂培茹 ,劉紅波 ,鞠翠芳 ,岳慧潔 ,劉 燊 *,王 闖 ,3

    (1.江西正邦養(yǎng)殖有限公司,江西 南昌 330096;2.河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司,河南 鄭州 451475 ;3.江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江西 南昌 330096)

    動(dòng)物育種主要有三項(xiàng)內(nèi)容,一是純種選育,二是雜交利用,三是新品種培育[1],其中在豬的繁育體系中,最常見(jiàn)的是杜洛克、長(zhǎng)白、大白等的純種豬選育與“杜長(zhǎng)大”雜交模式。常規(guī)育種通過(guò)有性繁殖方式進(jìn)行,基因往下游傳遞的周期長(zhǎng)、資金成本高,培育效率低。豬體細(xì)胞核移植,又稱(chēng)克隆,是一種無(wú)性繁殖技術(shù),可以大規(guī)模復(fù)制生產(chǎn)性能優(yōu)秀的種豬,從而加快群體的擴(kuò)繁和遺傳改良進(jìn)程[2-3]。然而,豬的克隆技術(shù)還存在諸多問(wèn)題,例如整體效率偏低,出生易畸形,后期存活困難等,雖有不少單位在嘗試種公豬克隆技術(shù)應(yīng)用[4-5],但離生產(chǎn)上規(guī)?;瘧?yīng)用還有一定差距。此次試驗(yàn)將常規(guī)育種與克隆技術(shù)相結(jié)合,將克隆豬應(yīng)用于純種擴(kuò)繁,以評(píng)估克隆豬自身及其后代的生產(chǎn)性能,為克隆杜洛克種公豬在生豬產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    研究中,細(xì)胞建系、重構(gòu)胚生產(chǎn)等在河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司完成,胚胎移植、生產(chǎn)性能測(cè)定等在江西正邦養(yǎng)殖有限公司某原種豬場(chǎng)完成。

    1.1 試驗(yàn)材料

    供體豬是根據(jù)父系指數(shù)、達(dá)100 kg體重日齡、體型指標(biāo)等篩選得到的2頭性能優(yōu)秀的杜洛克公豬(DDZBBK517006801和DDZBBK516084606),胚胎移植受體母豬為純種長(zhǎng)白母豬,與配母豬為杜洛克擴(kuò)繁群母豬。

    根據(jù)父系指數(shù)、達(dá)100 kg體重日齡、體型等生產(chǎn)性能指標(biāo),選擇2頭杜洛克公豬(DDZBBK517006801和DDZBBK516084606)作為候選公豬,建立細(xì)胞系,其信息見(jiàn)表1。

    表1 供體杜洛克種公豬生產(chǎn)性能

    細(xì)胞建系試劑盒、胚胎培養(yǎng)與操作試劑盒等由河南創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司配置,相關(guān)試劑、藥品除特別注明外,均購(gòu)自Sigma公司。

    主要儀器和耗材有:體式顯微鏡(Nikon)、超低溫冰箱(中科都菱)、顯微操作儀(Nikon)、電融合儀(ECM-2001)、豬活體保定電子籠秤(TCS-300)、超聲測(cè)膘儀(My Lab Touch)等;12孔培養(yǎng)板、4孔培養(yǎng)板、15 mL/50 mL離心管等細(xì)胞培養(yǎng)耗材均為Corning公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 供體細(xì)胞分離培養(yǎng)

    采集供體豬耳部組織,4 ℃低溫將樣本帶回實(shí)驗(yàn)室,利用細(xì)胞建系試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)、凍存和擴(kuò)增傳代,待供體細(xì)胞達(dá)到80%匯合度后,抑制1~2 d內(nèi)使用,且供體細(xì)胞一般使用1~3代以?xún)?nèi)。

    1.2.2 卵母細(xì)胞收集和體外成熟

    豬卵巢采集于當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng),摘取新鮮卵巢并立即置于盛有33~35 ℃生理鹽水的保溫瓶中,3 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室,用10 mL注射器(12號(hào)針頭)抽吸大約3~7 mL的卵泡液。在顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞并于Washcome medium P1.0液中洗3次,之后在卵母細(xì)胞成熟液Matcome medium P1.0中洗2次并置于4孔培養(yǎng)板中,于38.5 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱體外成熟42~45 h。顯微鏡下挑選成熟好的胞質(zhì)均勻且含有第一極體的卵母細(xì)胞備用。

    1.2.3 重構(gòu)胚構(gòu)建以及體外發(fā)育測(cè)試

    在Mancome medium P1.0顯微操作液中用固定針固定MⅡ期卵母細(xì)胞,用15~18 μm去核針吸取極體附近的胞質(zhì),而后,利用活細(xì)胞熒光染料Hochest33342進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下挑選成功去核的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì);在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞大小均勻,折光性好、細(xì)胞表面光滑的供體細(xì)胞進(jìn)行透明帶下注射完成胚胎體外構(gòu)建。將構(gòu)建好的重構(gòu)胚置于融合液Fusioncome medium P1.0中,用電融合儀ECM2001進(jìn)行電融合、激活(場(chǎng)強(qiáng)為100 V/mm,3次脈沖,脈沖時(shí)間為30 μs)。之后將融合、激活后的重構(gòu)胚轉(zhuǎn)移到添加細(xì)胞松弛素的Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液中,CO2培養(yǎng)箱(38.5 ℃、5%CO2)培養(yǎng)3 h,此后再移入Blacome medium P1.0胚胎培養(yǎng)液,克隆胚胎體外培養(yǎng)到0.5~2 d運(yùn)輸?shù)截i場(chǎng)進(jìn)行胚胎移植。

    1.2.4 克隆胚胎體內(nèi)移植以及克隆豬生產(chǎn)

    選擇斷奶3~5 d的代孕母豬,并在代孕母豬發(fā)情高峰期開(kāi)始后2 d內(nèi)進(jìn)行胚胎移植,手術(shù)前1 d下午停喂,手術(shù)當(dāng)天將構(gòu)建完成的克隆胚胎置Transcome medium P1.0胚胎移植液中,在12 h內(nèi)將克隆胚胎從輸卵管傘部緩慢注入輸卵管。每頭份克隆胚胎數(shù)量在150~180枚左右,胚齡約為0.5~2 d。術(shù)后受體母豬單欄飼養(yǎng),連續(xù)5 d注射抗生素以防炎癥發(fā)生,移植后密切觀察愈后情況。分別于胚胎移植后的21~28 d進(jìn)行第一次孕檢、49~56 d進(jìn)行第二次孕檢。114 d后,記錄代孕豬分娩頭數(shù)和產(chǎn)仔數(shù)。

    1.2.5 精液采集與配種

    種豬飼養(yǎng)至8月齡利用假畜臺(tái)進(jìn)行調(diào)教,調(diào)教成功后手工采精。采集的精液樣品立即運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,參照《豬人工授精技術(shù)規(guī)程(NY/T 636-2002)》進(jìn)行,配種參照江西正邦養(yǎng)殖有限公司《母豬配種技術(shù)規(guī)范》企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

    1.2.6 生產(chǎn)性能測(cè)定

    種豬生產(chǎn)性能測(cè)定按照《種豬生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)規(guī)程(NY/T 822-2019)》的規(guī)定,活體背膘厚測(cè)定個(gè)體重應(yīng)為(100±5)kg;測(cè)定時(shí),使用保定器或籠秤將待測(cè)個(gè)體站立保定于保定器或籠秤中并保持背腰相對(duì)平直。

    1.3 數(shù)據(jù)分析處理

    采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析(Duncan法),以P<0.05作為顯著性差異,P<0.01作為極顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

    2 結(jié)果

    2.1 耳組織成纖維細(xì)胞系建立

    解凍的豬耳組織采取酶消化法分離出原代細(xì)胞,分離的細(xì)胞培養(yǎng)3 d可見(jiàn)爬出小三角形、梭形細(xì)胞,6~8 d呈梭形、三角形的細(xì)胞呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng),為典型的成纖維狀,第6~8天細(xì)胞匯合度80%以上進(jìn)行傳代,經(jīng)過(guò)消化傳代1次后即可得到富集的成纖維細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

    圖1 杜洛克耳組織細(xì)胞建系

    2.2 重構(gòu)胚生產(chǎn)與胚胎移植

    重構(gòu)胚體外培養(yǎng)1~2 d后,并在胚胎移植前對(duì)克隆胚胎進(jìn)行鏡檢,可見(jiàn)部分胚胎已經(jīng)卵裂,如圖2。挑選形態(tài)和發(fā)育較好的胚胎進(jìn)行移植,自然發(fā)情第1天或第2天的母豬用作受體(以出現(xiàn)壓背靜立反射為發(fā)情的第0天),移植方法為手術(shù)法輸卵管深部移植。胚胎移植后28 d,進(jìn)行超聲波妊娠檢測(cè)。

    圖2 杜洛克耳細(xì)胞作為核供體生產(chǎn)的重構(gòu)胚

    2.3 供核種公豬的生產(chǎn)性能分析

    供核公豬DDZBBK516084606分別由3頭母豬代孕(LLZBBK616004011、LLZBBK617002109和LLZBBK617003411),共產(chǎn)公仔豬20頭,其中有6頭公豬用于調(diào)教配種;供核公豬DDZBBK517006801分別由4頭母豬代孕(LLCNKG1150L3121、LLZBBK617001605、LLZBBK617001609和LLZBBK617003306),共產(chǎn)公仔豬19頭,其中有4頭公豬用于調(diào)教配種。詳見(jiàn)表2。采集克隆仔豬尾組織與供核公豬、受體母豬等進(jìn)行盲樣處理,并經(jīng)過(guò)50 K基因芯片鑒定親緣關(guān)系,證明克隆豬與供核公豬基因型一致,與受體母豬無(wú)親緣關(guān)系。

    表2 克隆種公豬及后代的存活 頭

    存活的10頭公豬進(jìn)行性狀分析,克隆豬初生重1.57±0.38 kg、斷奶重6.85±1.51 kg、校正體重100 kg日齡157.07±6.54 d,校正背膘厚8.84±1.82 mm,左乳頭數(shù)6.40±0.69個(gè),右乳頭數(shù)6.20±0.42個(gè),與同時(shí)期的普通杜洛克公豬均無(wú)顯著性差異(表3)。與其供核公豬相比,校正100 kg體重日齡的天數(shù)相差較大(157.07±6.54 d Vs 132.8、138.8 d)。

    表3 克隆公豬與同期普通杜洛克公豬性狀比較

    2.4 克隆豬后代的生產(chǎn)性能

    10頭克隆公豬調(diào)教完成后,2頭用于正常生產(chǎn),8頭出現(xiàn)少精、密度稀、活力差等現(xiàn)象被淘汰。配種后,獲得的59頭克隆公豬后代,其初生重1.61±0.33 kg、斷奶重7.65±1.65 kg、校正100 kg體重日齡159.26±8.27 d,校正背膘厚9.41±1.47 mm,與同時(shí)期的普通公豬后代均無(wú)顯著性差異。后代按性別分組,克隆公豬與普通公豬所產(chǎn)的公豬和母豬,其相關(guān)性能指標(biāo)也無(wú)顯著性區(qū)別。僅在右乳頭數(shù)指標(biāo)上,克隆公豬后代(6.34±0.48個(gè))顯著低于普通公豬后代(6.60±0.66個(gè))。詳見(jiàn)表4。

    表4 克隆公豬后代與同期普通杜洛克公豬后代性狀比較

    3 討論

    自1997年體細(xì)胞克隆羊“多莉”成功之后,2000年P(guān)olejaeva等首例體細(xì)胞克隆豬[6],同年Onishi等和Betthauser等也相繼得到了體細(xì)胞克隆豬[7-8]。豬克隆技術(shù)誕生后,在人類(lèi)疾病模型、抗病豬新品種培育、地方豬品種保護(hù)等方面具有巨大的應(yīng)用前景[9]。與常規(guī)選育、全基因組選育技術(shù)相結(jié)合,豬克隆技術(shù)可對(duì)優(yōu)秀種豬進(jìn)行無(wú)性復(fù)制擴(kuò)繁,從而可規(guī)?;瘮U(kuò)繁生產(chǎn)高生產(chǎn)性能種豬,延伸優(yōu)秀種豬的利用時(shí)間和空間,縮短育種年限,加快遺傳進(jìn)展和提高養(yǎng)殖效益,凸顯其巨大的應(yīng)用潛力,此次試驗(yàn)基于種公豬的克隆技術(shù)生產(chǎn)克隆豬,并應(yīng)用于實(shí)際規(guī)?;纳a(chǎn)中,具有很強(qiáng)的前沿性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

    然而,截止到目前生產(chǎn)克隆豬的總體效率不到3%,導(dǎo)致了制作克隆豬的成本高,嚴(yán)重束縛著克隆種豬的應(yīng)用推廣[10]。為提高克隆豬效率,羅學(xué)明等認(rèn)為可以選擇早裂的胚胎進(jìn)行移植,因?yàn)槌醮温蚜褧r(shí)間可以作為豬克隆胚胎發(fā)育潛能的標(biāo)識(shí)[11];薛振華等優(yōu)化胚胎移植時(shí)間,認(rèn)為最佳移植時(shí)期是受體母豬處于排卵期,并獲得了88.89%的情期受胎率(28 d)和68.75%的妊娠分娩率[12]。逯心玉等比較了2頭克隆公豬與供核公豬的情期受胎率、與配母豬繁殖性能(窩產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、斷奶活仔數(shù)等)、后代仔豬生產(chǎn)性能(初生重、斷奶重、平均日增重等)等指標(biāo),顯示其不存在顯著性差異,克隆可以作為種公豬快速擴(kuò)繁手段,印證了“克隆豬具有正常的繁殖性能,且保留了供體優(yōu)秀的遺傳性能,可以作為優(yōu)秀種公豬進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用”觀點(diǎn)[4]。

    此次研究選擇2頭100 kg體重日齡140 d以?xún)?nèi)的杜洛克公豬為核供體豬,探討其優(yōu)秀生產(chǎn)性能可否通過(guò)克隆進(jìn)行傳遞。試驗(yàn)中,獲得10頭調(diào)教成功的克隆公豬,其100 kg體重日齡157.07±6.54 d,明顯低于核供體公豬,與同期杜洛克公豬100 kg體重日齡(156.20±5.23 d)無(wú)顯著性差異。克隆公豬后代,初生重1.61±0.33 kg、斷奶重7.56±1.65 kg、校正100 kg體重日齡159.26±8.27 d,校正背膘厚9.41±1.47 mm,也與同時(shí)期普通杜洛克公豬后代無(wú)顯著性差異。同時(shí),背膘厚等性狀上,克隆公豬后代與同時(shí)期的其他杜洛克后代比較,各項(xiàng)性狀值均無(wú)顯著差異。上述結(jié)果說(shuō)明,優(yōu)秀的生產(chǎn)性能并沒(méi)有通過(guò)克隆傳遞給后代,其中原因可能核供體豬選擇不夠準(zhǔn)確,也可能是克隆過(guò)程影響了生產(chǎn)性能發(fā)揮。

    研究建立了種豬克隆快速擴(kuò)繁技術(shù)平臺(tái),但常規(guī)選育的克隆公豬及其后代生產(chǎn)性能與普通公豬及其后代無(wú)顯著差異,需要進(jìn)一步提高選擇準(zhǔn)確性、提高克隆效率及其存活率,才能滿(mǎn)足克隆應(yīng)用于終端公豬生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)要求。

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