基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討龜鹿二仙膠對(duì)放化療后骨髓抑制的機(jī)制研究

王鑫虹

摘要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討龜鹿二仙膠（Gui-Lu-Er-Xian-Jiao，?GLEXJ）治療腫瘤放化療后骨髓抑制（bone?marrow?suppression，BMS）的作用機(jī)制。運(yùn)用TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫獲取活性成分和作用靶點(diǎn)，在GeneCard、DisGeNET等數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點(diǎn)，成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)映射后利用Cytoscape軟件和STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建GLEXJ“成分-靶點(diǎn)-疾病”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)，metescape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG富集分析。篩選得GLEXJ?86個(gè)活性成分，度值較高的化合物有槲皮素、山萘酚、豆甾醇、β-谷甾醇等，其作用于ESR1、RELA、EGFR、FOS、MAPK8、CCND1、NCOA2、NR3C1等89個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)主要富集在MAPK、TNF、PI3K-Akt等與BMS相關(guān)的通路上。GLEXJ治療BMS的作用體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，其機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、調(diào)控氧化應(yīng)激等多方面相關(guān)，本研究為后續(xù)研究提供一些思路和借鑒。

關(guān)鍵詞：骨髓抑制;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);龜鹿二仙膠;作用機(jī)制;

近年來我國(guó)腫瘤的發(fā)病率不斷攀升，而治療手段中的多數(shù)抗癌藥物和放、化療在滅殺腫瘤細(xì)胞同時(shí)會(huì)讓正常骨髓細(xì)胞受損，骨髓抑制是放、化療后常見的限制性毒性反應(yīng)，不但令患者身體狀況惡化，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重感染而增加死亡風(fēng)險(xiǎn)。中藥作為輔助用藥，以其療效確切、副作用小等特點(diǎn)，在減緩BMS方面表現(xiàn)出良好的前景。

龜鹿二仙膠（GLEXJ）由龜板、鹿角膠、人參和枸杞組成，具有補(bǔ)益肝腎、填精益髓、助陽益氣之功。有研究表明，GLEXJ能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化[1];能減少細(xì)胞周期的阻滯，逆轉(zhuǎn)化療所致的骨髓造血干細(xì)胞（HSCs）衰老[2]。然而GLEXJ成分較為復(fù)雜，其治療BMS的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步闡釋GLEXJ治療BMS可能的作用機(jī)制，同時(shí)為臨床更好地診治BMS提供了一些參考與新思路。

1?材料與方法

1.1?成分檢索及篩選靶點(diǎn)

運(yùn)用TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫檢索鹿角膠、龜板、人參、枸杞子的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)，根據(jù)口服生物利用度（0B）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18篩選各活性成分。利用PubChem數(shù)據(jù)庫得成分的SDF格式文件，導(dǎo)入至Swiss?Target?Prediction平臺(tái)，進(jìn)行反向藥效團(tuán)匹配預(yù)測(cè)化合物靶點(diǎn)，并設(shè)定“Probability>0.6”[6]的靶點(diǎn)作為關(guān)聯(lián)性較高的潛在靶點(diǎn)，經(jīng)規(guī)范、去重后得相應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2?疾病靶點(diǎn)的獲取及分子網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析

以“Bone?Marrow?Suppression”為關(guān)鍵詞，?在DisGeNET、DiGSeE、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得BMS相關(guān)基因，剔除重復(fù)靶點(diǎn)，獲取BMS相關(guān)的唯一靶點(diǎn)基因。利用Venny軟件獲取GLEXJ-BMS的交集靶點(diǎn)，通過Cytoscape軟件構(gòu)建GLEXJ“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，利用Network?analyzer功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行分析。利用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的自由度，介度中心性和接近中心性等參數(shù)值對(duì)獲得的映射網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選，獲取得分前十的核心蛋白。

1.3?GO功能富集及KEGG通路富集分析

利用metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過程、信號(hào)通路進(jìn)行分析，設(shè)置P≤0.01，獲得GO功能及KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果，利用?R語言繪制富集分析圖。

2?結(jié)果

2.1?化合物成分的獲取及篩選

通過TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫共獲GLEXJ藥物成分400個(gè)。經(jīng)OB≥30%、DL≥0.18篩選后得有效成分共86個(gè)，其中人參22個(gè)，枸杞子45個(gè)，龜板20個(gè)，鹿角膠2個(gè)。利用TCMSP和Swiss?Target?Prediction平臺(tái)共獲取647個(gè)蛋白靶點(diǎn)，其中人參靶點(diǎn)為256個(gè)，枸杞子靶點(diǎn)為364個(gè)，龜板靶點(diǎn)為27個(gè)，鹿角膠靶點(diǎn)為0個(gè)，當(dāng)中枸杞子成分槲皮素（quercetin）擁有154個(gè)潛在靶點(diǎn)。

2.2?疾病靶點(diǎn)的篩選及分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

在GeneCards、DisGeNET、DigSee數(shù)據(jù)庫得BMS相關(guān)靶點(diǎn)分別為6438個(gè)、39個(gè)、10個(gè)，3個(gè)數(shù)據(jù)庫的結(jié)果合并、去重后得到6?448個(gè)靶點(diǎn)基因。將647個(gè)成分靶點(diǎn)與6448個(gè)BMS靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得共同靶點(diǎn)89個(gè)，借助Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)”，其中度值最大的5個(gè)成分為槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黃豆黃素。將89個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至STRING數(shù)據(jù)庫，并利用?Cytoscape軟件進(jìn)行分析，從而獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖，圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示功能相關(guān)性，度值大小決定節(jié)點(diǎn)面積大小，節(jié)點(diǎn)面積越大表示蛋白在網(wǎng)絡(luò)中所起的作用越大。篩選相關(guān)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，其中居Degree值前十位的靶點(diǎn)依次為：ESR1、RELA、FOS、MAPK8、EGFR、CCND1、NR3C1、NCOA2、PRKCA、APP，這10個(gè)靶點(diǎn)被認(rèn)為是GLEXJ治療BMS的核心靶點(diǎn)。

2.3?GO功能分析及KEGG富集分析

將89個(gè)交集靶點(diǎn)應(yīng)用metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)富集分析，設(shè)置P≤0.01，依據(jù)P值篩選排名前20的GO-BP與KEGG富集結(jié)果，繪制富集分析圖。共得到GO富集條目1541個(gè)，其中，生物過程條目1?372個(gè)，主要涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)等;分子功能條目104個(gè)，主要涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等;細(xì)胞成分條目65個(gè)，主要涉及膜筏、膜微區(qū)等。共得139個(gè)KEGG富集條目，其中前20條信號(hào)通路依據(jù)KEGG?BRITE層次分類，與疾病通路相關(guān)有16條，信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)通路3條，1條與細(xì)胞過程相關(guān)通路。提示GLEXJ能通過多種疾病通路、信號(hào)通路及代謝通路對(duì)BMS發(fā)揮作用。