傣百解醇提取物不同極性部位體外抗氧化和抑菌活性研究

李曉花 段志航 趙彩云 金玲鈺 曾綺雯 張麗霞

摘要：目的 研究傣百解醇提物不同極性萃取物對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的清除率，及對(duì)大腸桿菌（EC.）和綠膿假單胞菌（Pa.）的抑菌活性。方法 采用95%乙醇回流提取傣百解根，減壓濃縮以水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部位（DBJ-1）、正丁醇部位（DBJ-2）和水部位（DBJ-3）;采用經(jīng)典體外抗氧化活性試驗(yàn)，以抗壞血酸（Vc）作為陽性對(duì)照，考察傣百解醇提物不同極性部位對(duì)DPPH·和·OH的清除率;采用濾紙片法測(cè)定提取物的抑菌圈，二倍稀釋法測(cè)定提取物及陽性藥物的最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果 傣百解醇提物不同極性萃取物均具有的抗氧化和抑菌活性，排序?yàn)镈BJ-2>DBJ-1>DBJ-3，抗氧化活性和抑菌效果隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。DBJ-2對(duì)DPPH·和·OH的IC50分別為0.75 mg/mL和0.98 mg/mL;對(duì)EC.和Pa.的抑菌圈（2.79±0.10）cm和（1.89±0.06）cm，最小抑菌濃度（MIC）為0.195 mg/mL和0.781 mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為1.563 mg/mL和6.25 mg/mL。結(jié)論 傣百解醇提取物不同極性部位均具有一定的抗氧化和抑菌活性，正丁醇萃取部位效果最強(qiáng)，為該植物的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：傣百解;提取物;抗氧化;抑菌

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2021）06-0069-05

傣百解為蘿藦科牛奶菜屬植物通光散Marsdenia tenacissima（Roxh.）Moon，傣名“雅解先打”，意為解百毒的藥，具有清火解毒、消腫止痛的功效，臨床用于咽喉腫痛、口舌生瘡、療瘍斑疹、肺熱咳嗽、胃脘痛、尿痛、解藥食毒;還可用于清除因飲食不潔、用藥不當(dāng)而致的各種不良反應(yīng)，在西雙版納、德宏等地，及東南亞國家老撾、緬甸等傣族居住地區(qū)使用廣泛[1-2]。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，傣百解民間用于多種腫瘤疾病、皮膚病的治療，并具有解酒保肝作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示：傣百解具有抗腫瘤，調(diào)節(jié)脂肪肝等藥理活性和抗病毒;文獻(xiàn)報(bào)道，傣百解中含有生物堿、脂肪酸、酯類、莽草酸、糖等成分，主要活性成分為C21甾體皂苷類化合物[3-8]。近年來的研究表明：中藥的次生代謝產(chǎn)物，如黃酮、多酚、皂苷等，具有抗氧化、抗炎、促細(xì)胞凋亡多種生物活性[9-10]。目前，國內(nèi)外對(duì)傣百解的化學(xué)成分及藥理活性研究報(bào)道較少，本文依據(jù)傣百解的臨床及民間應(yīng)用，以醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇和水部位作為研究對(duì)象，通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥基自由基的清除實(shí)驗(yàn)，以及對(duì)大腸桿菌和綠膿假單胞菌的抑菌活性，考察傣百解不同極性部位的體外抗氧化和抑菌活性，為傣百解的臨床應(yīng)用和開發(fā)利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 流水式粉碎機(jī)（DF-35，溫州大德），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-100，瑞士步琦），恒溫水浴鍋（HWS-24，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），電子天平（ME204，梅特勒-托利斯），鼓風(fēng)干燥箱（BGZ-246，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱（ST20H，冠森生物科技上海公司），超凈工作臺(tái)（HCB-1300V，青島海爾特種電器有限公司），高壓滅菌鍋（GI80TW，廈門致微儀器有限公司），臺(tái)式離心機(jī)（L420，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 傣百解有西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所張麗霞副研究員鑒定為蘿藦科牛奶菜屬植物傣百解Marsdenia tenacissima 的根莖，材料經(jīng)過粗粉后，備用。原標(biāo)本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用 植 物 研 究 所 云 南 分 所 標(biāo) 本 館（標(biāo) 本 號(hào)D20100720008）。FeSO4·7H2O（天津索羅門生物科技有限公司），水楊酸（天津索羅門生物科技有限公司），福林酚試劑（BR，南京奧多尼生物科技有限公司），DPPH（BR，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司），LB培養(yǎng)基（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司），瓊脂（美國Invitrogen公司），葡萄糖（美國Sigma公司），瓊脂粉（日本Japan公司），DMSO（美國Sigma公司）。

1.1.3 菌種 綠膿假單胞菌（Pa.，博偉生物技術(shù)有限公司），大腸桿菌（Ec.，天津賽爾生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟[11-13]

1.2.1 提取物的制備 傣百解藥材采自西雙版納，根切段后，烘干粉碎、過20目篩，加入10倍量的95%乙醇回流提取2次，每次2 h，將提取液減壓濃縮至無醇，適量熱水混懸后放置至室溫，依次用等體積的乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取至萃取液色淺量少。合并各極性萃取液，減壓濃縮至干，稱重，獲得傣百解乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水部位，分別標(biāo)記為DBJ-1、DBJ-2和DBJ-3。

DBJ-3用超純水溶解，DBJ-1和DBJ-2用0.2%的DMSO-水溶液溶解，母液濃度為1000 mg/mL，備用。

樣品濃度設(shè)置為200、400、600、800、1000、1200 μg/mL，用于抗氧化活性檢測(cè)。

母液稀釋至終濃度25 mg/mL，0.22 μm過濾器過濾除菌，用于抑菌活性檢測(cè)。

1.2.2 試劑的配制 （1）DPPH貯備液的制備：準(zhǔn)確稱取19.72 mgDPPH，用無水乙醇定容至500 mL，得到濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液貯備液，置于冰箱中冷藏備用。（2）9 mmol/L乙醇-水楊酸的制備：稱1.243 g水楊酸，乙醇溶解，定容至100 mL，稀釋10倍。（3）9 mmol/L FeSO4的制備：稱2.502 g，F(xiàn)eSO4·7H2O，蒸餾水溶解，定容至100 mL，稀釋10倍。（4）8.8 mmol/L H2O2的制備：量取1 mL 30%雙氧水，蒸餾水定容至100 mL，稀釋10倍。（5）LB培養(yǎng)基的制備：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉、15 g瓊脂粉，加蒸餾水至950 mL，混勻后，NaOH調(diào)pH至7.0，加水至1000 mL，121℃高壓滅菌20 min。（6）營養(yǎng)胨培養(yǎng)基的制備：10 g蛋白胨、3 g牛肉膏、氯化鈉5 g，15 g瓊脂粉，加蒸餾水至950 mL，混勻后，NaOH調(diào)pH至7.2～7.4，加水至1000 mL，121℃高壓20 min。

1.2.3 含菌平板的制備 將15 mL滅菌瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿制平板，待平板完全凝固冷卻，取100 μL稀釋好的濃度1×107 cfu/mL菌液至培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌棒涂抹均勻，封口膜密封后放4 ℃冰箱備用。

1.2.4 傣百解提取物的抗氧化活性 采用DPPH自由基、羥基自由基清除率等方法，評(píng)價(jià)傣百解提取物不同極性部位的抗氧化活性，明確活性部位。

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 將傣百解提取物的各萃取部位配成濃度為200、400、600、800、1000、1200 μg/mL濃度的溶液，移取1 mL提取物與3 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液搖勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)1;同時(shí)測(cè)定1 mL對(duì)應(yīng)濃度提取液加入3 mL無水乙醇反映30 min后的吸光值A(chǔ)2;作為對(duì)照，在1 mL蒸餾水中加入3 mL DPPH溶液做空白試驗(yàn)并測(cè)吸光值A(chǔ)0。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3份平行試驗(yàn)，取平均值。以同濃度梯度的抗壞血酸做為陽性。

1.2.4.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定 將傣百解提取物的各萃取部位配成濃度為200、400、600、800、1000、1200 μg/mL濃度的溶液，各取1 mL稀釋后的溶液，依次先加入9 mmol/L FeSO4溶液1 mL，9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液1 mL，及8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，搖勻。37℃加熱30 min后取出，510 nm處測(cè)其吸光度A1;以蒸餾水替代水楊酸在相同條件下測(cè)吸光值A(chǔ)2，將提取液用蒸餾水代替水楊酸在相同條件下測(cè)吸光值為A0，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，取平均值，清除率按照下式計(jì)算：

式中：A0—用蒸餾水代替提取液與過氧化氫-水楊酸體系反應(yīng)后測(cè)得的吸光值;

A1—提取物與體系反應(yīng)后測(cè)得的吸光值;

A2—用蒸餾水代替水楊酸與體系反應(yīng)后測(cè)得的吸光值

1.2.5 傣百解提取物體外抑菌活性研究 選取大腸桿菌和綠膿假單胞菌菌種，將供試菌涂布于固體培養(yǎng)基斜面上，37℃活化培養(yǎng)24 h;挑取單個(gè)菌落接種無菌液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18～24 h，制得初始菌懸液;用無菌生理鹽水將菌懸液稀釋至含菌體約107 CFU/mL，備用。

將15 mL滅菌瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿制平板，待平板完全凝固冷區(qū)，取100 μL稀釋好的濃度為1×107CFU/mL菌液至培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌棒涂布均勻，封口膜密封后放4℃冰箱備用。

1.2.5.1 抑菌圈測(cè)定 取滅菌雙層圓形濾紙片（6 mm），將濾紙浸在各樣品溶劑中，設(shè)DMSO和純水空白對(duì)照，對(duì)羥基甲酸乙酯陽性對(duì)照。取出濾紙片晾干，輕輕放在含菌平板的相應(yīng)位置;貼好濾紙片的含菌平板倒置放入4℃冰箱靜置2 h后，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h;培養(yǎng)結(jié)束后，用精確度為1/10 mm的游標(biāo)卡尺十字交叉測(cè)量抑菌圈直徑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3個(gè)平行組的平均值。抑菌圈越大，表示抑菌效果越好。

1.2.5.2 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用試管等倍稀釋法，量取1.0 mL樣品濃度為50 mg/mL的溶液加入到第一支試管中，再加入1 mL滅菌培養(yǎng)基;從第一支試管中取出1 mL溶液，滴加到第二支試管中，依此類推至第九管。第10管含有2 mL培養(yǎng)基，并棄去1 mL;同時(shí)以1 mL 相同濃度的DMSO和純水代替藥物提取物與培養(yǎng)基混合做空白對(duì)照，相同濃度的對(duì)羥基苯甲酸乙酯為陽性對(duì)照;采用微量加樣器向各試管中均加入制備好的菌懸液100μL（1×107 CFU/mL），搖勻后放入培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，取出試管充分震蕩混勻，并對(duì)各個(gè)試管進(jìn)行檢查，用肉眼觀察期渾濁度，以此來判斷有無菌生長;對(duì)照管中菌呈現(xiàn)渾濁狀生長，溶液開始出現(xiàn)澄清的最低濃度確定為樣品的MIC值。

1.2.5.3 最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 自樣品濃度高于MIC值（包括MIC濃度）的試管中各吸取100 μL混懸液分別滴加到滅菌的平板培養(yǎng)基上，涂布均勻，培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察結(jié)果，菌落數(shù)小于5個(gè)或無菌落生長的最低樣品濃度確定為MBC值。

2 結(jié)果與討論

2.1 傣百解提取物具有清除DPPH自由基和·OH自由基的活性 傣百解提取物抗氧化活性研究的結(jié)果顯示：隨著提取物濃度的升高，對(duì)DPPH自由基和·OH自由基的清除率逐漸升高，具有濃度依賴性。由下圖結(jié)果顯示，傣百解不同極性提取物對(duì)兩種自由基的清楚能力依次為DBJ-2>DBJ-1>DBJ-3。三者對(duì)DPPH自由基的IC50分別為1.34 mg/mL、075 mg/mL和2.55 mg/mL;對(duì)·OH的IC50分別為1.09 mg/mL、0.98 mg/mL和2.15 mg/mL，相同質(zhì)量濃度條件下，對(duì)DPPH自由基的清除率由于羥基自由基。見圖1。

2.2.1 濾紙片法檢測(cè)傣百解提取物對(duì)大腸桿菌和綠膿假單胞菌抑菌圈的大小 大腸桿菌和綠膿假單胞菌均為臨床常見條件致病菌，可引起皮膚、腸道等部位的疾病。由表1結(jié)果顯示，傣百解不同極性提取物對(duì)大腸桿菌和綠膿假單胞菌的生長均具有抑制作用，抑菌強(qiáng)弱順序?yàn)椋篋BJ-2>DBJ-1>DBJ-3，DBJ-2顯示了較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)EC.和Pa.的抑菌圈分別（2.79±0.10）cm和（1.89±0.06）cm，各個(gè)極性部位對(duì)大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于對(duì)綠膿假單胞菌的抑制作用。見表1。

2.2.2 傣百解提取物對(duì)大腸桿菌和綠膿假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC） 最小抑菌濃度越小，說明藥物的抗菌活性越強(qiáng)。表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，不同極性傣百解提取物均檢測(cè)出最小抑菌濃度，對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為0.391 mg/mL、0.195 mg/mL和1.563 mg/mL;對(duì)綠膿假單胞菌的最小抑菌濃度分別為3.125 mg/mL、0.781 mg/mL和6.250 mg/mL。說明不同極性提取物對(duì)大腸桿菌敏感性由于綠膿假單胞菌，抑菌活性最強(qiáng)的為正丁醇萃取物（DBJ-2）。見表2。

2.2.3 傣百解提取物對(duì)大腸桿菌和綠膿假單胞菌的最小殺菌濃度（MBC） 在檢測(cè)了抑菌圈和最小抑菌濃度的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了3種提取物對(duì)兩種細(xì)菌的最小殺菌濃度，由表3結(jié)果顯示：三種提取物均檢測(cè)出對(duì)大腸桿菌的最小殺菌濃度，而只有DBJ-2檢測(cè)出對(duì)綠膿假單胞菌的最小殺菌濃度。說明傣百解提取物對(duì)大腸桿菌的殺菌效果優(yōu)于綠膿假單胞菌。見表3。

3 小結(jié)

現(xiàn)代研究結(jié)果表明，自由基堆積引起的氧化應(yīng)激和線粒體損傷是肝損傷的重要原因。在病理狀態(tài)下，自由基產(chǎn)生或多或清除過慢，則可引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)、核算變形，造成生物體損害，甚至加速機(jī)體的衰老和死亡[14]。傣百解在臨床和民間主要用于肝保護(hù)和解酒，通過本研究，理論上為傣百解開發(fā)成解酒保肝藥物奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

感染性疾病在臨床上很普遍，是各科醫(yī)生經(jīng)常面臨的問題。但是，目前對(duì)感染性疾病的診治也較普遍地存在著誤區(qū)，使得臨床中的感染問題變得愈發(fā)復(fù)雜和嚴(yán)重[15]?，F(xiàn)代研究表明，中藥中的很多次生代謝產(chǎn)物具有顯著的抑菌活性。本項(xiàng)目依據(jù)傣百解民間用于治療皮膚疾病的應(yīng)用歷史，選取大腸桿菌和綠膿假單胞菌為指示菌株，進(jìn)行抑菌圈、最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：傣百解提取物具有較好的抑菌活性，且對(duì)大腸桿菌的抑菌作用優(yōu)于對(duì)綠膿假單胞菌的抑制作用。

通過研究，為傣百解健康產(chǎn)品和輔助治療的藥品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，為傣百解的推廣提供支持。

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（收稿日期：2021-01-27）