苯并[a]蒽與肺表面活性劑混合磷脂的相互作用

耿迎雪 ,李曼燾,曹 妍 ,趙 群 ,李英杰 ,劉 丹 ,師偉萌 (.昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650500；2.西昌學(xué)院土木與水利工程學(xué)院,四川 西昌 6503；3.昆明理工大學(xué)國土資源工程學(xué)院,云南 昆明 650093)

多環(huán)芳烴(PAHs)在大氣環(huán)境中廣泛存在[1?2],其可隨細(xì)顆粒經(jīng)呼吸作用到達(dá)肺泡[3?6],在肺泡的氣體交換界面與肺表面活性物質(zhì)(PS)接觸,PS是抵御PAHs進(jìn)入人體血液循環(huán)的最后一道屏障[7?9].PS位于肺泡液膜最外層,是由肺泡 II型上皮細(xì)胞合成和分泌的具有特殊生物活性的復(fù)合物,能有效降低肺泡表面張力、防止肺泡在呼氣最后階段發(fā)生塌陷[10?12].1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)和 1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC)是PS中重要活性組分,對PS生理功能的發(fā)揮起關(guān)鍵作用[13?14].在呼吸循環(huán)過程中,PS膜進(jìn)行周期性的壓縮?擴(kuò)張循環(huán),并伴有氣相(G)?液態(tài)擴(kuò)張相(LE)?液態(tài)凝聚相(LC)的規(guī)律性相轉(zhuǎn)變[15].DPPC是生理溫度下唯一能形成LC相的組分,是降低肺泡表面張力最主要的物質(zhì)[16],POPC能增強(qiáng)膜分子的流動,促進(jìn)PS自發(fā)擴(kuò)散及 LE相的形成[17?18],同時二者的比值對PS的空間構(gòu)型及界面行為有重要影響[19].不同哺乳動物含有大致相似的磷脂組成,在天然 PS中POPC是主要不飽和組分之一,研究表明小鼠肺內(nèi)DPPC與POPC摩爾占比約為4:1,新生小牛肺PS中DPPC與POPC分別占磷脂酰膽堿(PC)總量的(41.1±1.5)%、(14.3±0.6)%[16,19?21],這一比例關(guān)系會隨生理狀態(tài)的改變而變化.在胚胎發(fā)育過程中,隨著胎兒肺的成熟DPPC含量增加,POPC含量短期下降;患有囊性纖維性疾病及急性呼吸窘迫綜合征的兒童,肺內(nèi)DPPC濃度均會隨疾病的發(fā)展逐步減少,而POPC含量升高[14,22?23].DPPC與POPC的比例關(guān)系與肺的順應(yīng)性及阻力有關(guān),在一定程度上體現(xiàn)了不同生理狀態(tài)下PS的活性.

PAHs與PS接觸會發(fā)生一系列的界面化學(xué)反應(yīng).分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)PAHs會與磷脂疏水酰基鏈結(jié)合并對磷脂分子產(chǎn)生親和作用,這說明 PAHs會在PS單層累積并影響磷脂分子的構(gòu)象[24?25].但由于分子動力學(xué)模擬局限于小體系研究,PAHs對 PS膜宏觀結(jié)構(gòu)以及物理化學(xué)性質(zhì)的影響尚不清楚.本文前期研究中發(fā)現(xiàn)PS能使吸附在納米SiO2表面的PAHs析出,析出量與 PAHs疏水性呈正相關(guān)[26],這意味著PAHs隨細(xì)顆粒在PS膜累積后會進(jìn)一步反應(yīng),PS膜可能不是阻礙PAHs遷移的有效屏障.同時在不同的生理狀態(tài)尤其是肺部疾病下PS組分會發(fā)生變化,這是否會削弱PS膜的防御能力造成PAHs潛在毒性的加劇鮮有報道,值得深入探究.

PAHs與 PS的作用關(guān)系十分復(fù)雜,由于實驗周期、倫理方面等原因進(jìn)行體內(nèi)原位監(jiān)測難以實現(xiàn).本文以DPPC/POPC混合磷脂為PS模型,采用體外模擬法研究苯并[a]蒽與DPPC/POPC混合磷脂的相互作用,通過 Langmuir?Wilhelmy(L?W)膜天平模擬呼吸過程苯并[a]蒽對PS膜相行為的影響,結(jié)合彈性模量分析PS膜抗形變能力的變化,利用布儒斯特角顯微鏡(BAM)觀測苯并[a]蒽存在下 PS膜微觀形貌的改變,隨后通過苯并[a]蒽溶出實驗、磷脂膠束粒度分析及透射電鏡表征進(jìn)一步探究DPPC/POPC混合磷脂與苯并[a]蒽的作用機(jī)制.苯并[a]蒽與肺表面活性物質(zhì)混合磷脂膜間的界面化學(xué)作用,有利于苯并[a]蒽健康危害機(jī)制的闡釋,也有利于解釋其他污染物聯(lián)合暴露的健康影響,為空氣污染物肺健康風(fēng)險評估提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DPPC(純度≥99%)、POPC(純度≥99%)購自Sigma 公司;苯并[a]蒽(純度≥98%)購自百靈威科學(xué)有限公司;氯仿、無水乙醇、氯化鈉均為分析純,購自成都市科龍化工試劑廠;實驗用水均為超純水,其室溫下的電阻率為18.25MΩ·cm.

1.2 實驗設(shè)備

多功能 L?W 膜天平(JML04C2,上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司);布儒斯特角顯微鏡(Nanofilm?EP4BAM,Accurion GmbH,德國);馬爾文納米粒度分析儀(Zetasizer Nano ZS90,Malvern,英國);場發(fā)射透射電鏡(日立 HT7700,日本);紫外可見分光光度計(Evolution 220,Thermo Scientific,美國).

1.3 實驗方法

1.3.1 表面壓?面積等溫線(π?A 等溫線)的測定DPPC、POPC分別溶于氯仿,按不同比例混合,制備1.0mmol/L的混合膜液(POPC比例 XPOPC=0,0.4,0.6,1.0),同時在每組膜液中加入適量苯并[a]蒽使磷脂總量與苯并[a]蒽的摩爾比為 8:1.配制 0.9%的氯化鈉溶液為實驗的亞相,通過L?W膜天平測量苯并[a]蒽對混合磷脂膜π?A等溫線的影響[27].通過水浴恒溫裝置控制實驗溫度為(37±0.5) ℃.每組實驗測量3次以確保其重現(xiàn)性.

1.3.2 BAM 測定 借助 BAM 可對苯并[a]蒽存在下混合磷脂膜的微觀形貌進(jìn)行觀測[28?29].將適量的亞相溶液加入聚四氟乙烯液槽中,在氣?液界面滴加適量的磷脂膜液,待氯仿?lián)]發(fā)完畢,對磷脂膜的微觀形貌進(jìn)行圖像捕捉.在呼吸循環(huán)過程中,肺泡內(nèi)PS膜會在35～40mN/m的壓力下受到周期性擾動[13,16],為接近真實的生物膜狀態(tài),本實驗選取 π=35mN/m 為實驗?zāi)?

1.3.3 DPPC/POPC混合磷脂對苯并[a]蒽的增溶作用 制備濃度為200mg/L的DPPC、POPC水溶液,二者以不同比例混合制備DPPC/POPC混合溶液,并稀釋成一系列的濃度梯度.向20mL具有不同濃度的混合磷脂溶液中加入等量的苯并[a]蒽.在恒溫?fù)u床中以 120r/min的速度振蕩 24h,溫度控制為(37±0.5)℃.反應(yīng)結(jié)束后靜置 2h,將樣品以 3000r/min的轉(zhuǎn)速離心 30min以分離出未溶解的苯并[a]蒽粉末.取上清液,用正己烷萃取后在287nm處用紫外/可見分光光度計測吸光度.

1.3.4 DPPC/POPC混合磷脂膠束粒徑及形態(tài)測定制備濃度為200mg/L的DPPC、POPC溶液,二者以不同比例混合制備DPPC/POPC混合溶液,測其粒徑及粒徑分散性指數(shù)(PDI).另取樣品懸液滴在干燥的封口膜上,把銅網(wǎng)放在懸浮液中漂浮2min,用濾紙吸干銅網(wǎng)上的多余懸液,然后磷鎢酸染色1～2min,用濾紙將染液吸干,在透射電鏡下觀察磷脂膠束的形態(tài),加速電壓為80kV.

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用 Origin2016和 Microsoft Power Point軟件處理并作圖,采用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,P<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 苯并[a]蒽對 DPPC/POPC混合磷脂膜 π?A等溫線的影響

π?A等溫線是體外研究呼吸過程 PS膜的重要手段,通過對滑障壓縮過程磷脂分子間表面壓力的實時監(jiān)測,可獲取壓縮?擴(kuò)張循環(huán)PS膜的相變節(jié)點、最大表面壓(πmax)等重要界面特征參數(shù)[30?31].由圖 1可知,不同實驗組 π?A等溫線呈現(xiàn)相似的特征:擴(kuò)張曲線在壓縮曲線的下方,近似呈封閉、兩端尖的長梭形狀.不同的是隨POPC含量增加,膜的相態(tài)改變,純組分DPPC單分子膜主要表現(xiàn)為LE相和LC相;在相同表面壓力下POPC向較高的單分子面積區(qū)域移動,在壓縮階段大都以LE相存在;而DPPC/POPC混合組分介于單組分之間并出現(xiàn)明顯的 LE?LC共存平臺,如單分子面積A=80?2時,DPPC膜和POPC膜的表面壓力分別為 15.47和 35.12mN/m,混合組分DPPC/POPC(XPOPC=0.4)的表面壓力介于純組分之間,為 20.63mN/m.同時 POPC 占比增多會使πmax降低,由 DPPC膜的 58.17mN/m降至 POPC膜的44.56mN/m.由于πmax代表磷脂膜崩解前能承受的最大表面壓力[14],這表明 POPC會使混合膜的界面穩(wěn)定性減弱.

圖1 苯并[a]蒽對DPPC/POPC混合磷脂單分子膜π?A等溫線的影響Fig.1 Effect of benz[a]anthracene on surface pressure?area isotherms of mixed DPPC/POPC monolayers

加入苯并[a]蒽,每組滯回曲線的形狀未發(fā)生變化,但均出現(xiàn)滯后效應(yīng)且滯回面積增加.苯并[a]蒽對磷脂膜相變的影響可能和它的親脂性有關(guān).滯回曲線的變化過程與膜分子的流動性和排列組裝有關(guān),相變的滯后說明苯并[a]蒽對磷脂分子的有序排列產(chǎn)生影響.Lilland等[32]在研究PAHs與磷脂雙層的作用時發(fā)現(xiàn),菲(3環(huán))和苯并[a]芘(5環(huán))對磷脂雙層具有親和力,會改變磷脂的相變溫度,同時較大尺寸的PAHs對膜分子的有序排列影響更大,會插入?；溨g或取代脂分子.苯并[a]蒽作為一種 4環(huán)結(jié)構(gòu)的PAHs具有較強(qiáng)的親脂性(logkow=5.910)[33],會與DPPC、POPC的酰基鏈結(jié)合使磷脂分子的自組裝及再擴(kuò)散受阻,并導(dǎo)致相變的延后.另一方面,滯回面積反映了單分子膜的能量耗散,能量耗散越大則所需的呼吸功越多,這意味著苯并[a]蒽會使呼吸過程尤其是呼氣過程的呼吸功增加,對肺通氣的順應(yīng)性產(chǎn)生不利影響,而 POPC由于一個不飽和鍵的存在可能和苯并[a]蒽的結(jié)合力更強(qiáng),會使苯并[a]蒽的負(fù)面效應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大.

2.2 苯并[a]蒽對 DPPC/POPC混合磷脂膜彈性模量的影響

彈性模量(Cs-1)是表征單層膜物理狀態(tài)的重要參數(shù),反映了膜的抗形變能力,值越大表明膜的剛性越強(qiáng).Cs-1可由公式(1)計算得出:

式中:π表示單分子膜的表面壓力,mN/m;A表示單分子面積,?2;T 表示溫度,℃[34?35].如圖 2 所示,在壓縮?擴(kuò)張2階段,不同實驗組Cs-1值均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢.純組分 DPPC單層膜的 Cs-1值高達(dá)122.4mN/m,說明在對抗外界壓力下,DPPC膜體現(xiàn)出較好的剛性及穩(wěn)定性.POPC的加入導(dǎo)致Cs-1最大值降低至 72.06mN/m,大小順序依次為 Cs-1(DPPC)>Cs-1(DPPC/POPC)>POPC,同時在 35～50mN/m 時曲線出現(xiàn)“凹槽”,表明LE相到LC相的相變發(fā)生.這可能是由于POPC分子擴(kuò)散到DPPC分子之間,造成磷脂分子的重新排列并出現(xiàn)相的分離.加入苯并[a]蒽,Cs-1值呈現(xiàn)出類似的變化趨勢,并均在 π=40mN/m 附近出現(xiàn)最大值,不同的是在壓縮階段,苯并[a]蒽存在下每個實驗組的 Cs-1最大值均不同程度下降,純組分DPPC單分子膜的Cs-1最大值由122.4mN/m降低至81.7mN/m.隨著POPC含量的增加,苯并[a]蒽對混合磷脂膜的擾動更大,Cs-1值變化明顯,尤其是磷脂膜的前期擴(kuò)張階段.上述結(jié)果說明苯并[a]蒽會削弱混合磷脂膜的抗形變能力,這一不利影響隨 POPC含量的增多會進(jìn)一步擴(kuò)大至膜的前期擴(kuò)張階段.

圖2 苯并[a]蒽對DPPC/POPC混合磷脂膜彈性模量的影響Fig.2 The elastic modulus Cs-1 vs.surface pressure (π) dependencies for mixed DPPC/POPC monolayers with/without benz[a]anthracene

2.3 苯并[a]蒽對 DPPC/POPC 混合磷脂膜微觀形貌的影響

BAM 技術(shù)依據(jù)表面膜在不同相區(qū)時折光指數(shù)不同而有不同的反射強(qiáng)度,能提供磷脂單層橫向結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息.進(jìn)一步探究苯并[a]蒽與磷脂分子的作用細(xì)節(jié),借助BAM對磷脂膜的微觀形貌進(jìn)行動態(tài)捕捉.觀察圖 3可發(fā)現(xiàn),不同實驗組的磷脂膜微觀形貌不同.純DPPC膜在π=35mN/m的膜壓下形成液晶疇,表現(xiàn)為均一連續(xù)的 LC相,與前人的研究結(jié)果一致[36],XPOPC=0.4,磷脂分子均勻分布,以 LC 相為主體、部分區(qū)域出現(xiàn)相的分離,這說明 XPOPC=0.4時DPPC與 POPC接近理想混合,XPOPC=0.6,磷脂分子的聚集程度減弱,有磷脂膠束形成,膠束大多呈梅花形,純組分 POPC膜呈現(xiàn)明顯流態(tài)化,以 LE相存,所得結(jié)果與上述 π?A等溫線的分析相吻合.DPPC、POPC以不同比例混合形成的膜相態(tài)不同,與二者?；湹臉?gòu)型有關(guān).DPPC兩條飽和?；湵粔嚎s后成直線排列,而POPC?；湷蕪澢螤?這會使POPC分子相互靠近變得困難、流動性增加,不能在界面形成致密有序的LC相[37?38].

苯并[a]蒽加入后,膜的形貌發(fā)生改變.由圖3(e)、圖 3(f)可知,苯并[a]蒽會嵌入膜分子之間并干擾其有序排列;由圖 3(g)可見,苯并[a]蒽會與磷脂膠束結(jié)合并形成復(fù)合體;對于 POPC膜則會引起界面成膜分子的數(shù)量明顯減少(圖3(h)).這說明磷脂分子在苯并[a]蒽的親和作用下有序度降低,而 POPC可能與苯并[a]蒽的結(jié)合力更強(qiáng),在這種約束作用下有更多的 POPC分子不能在界面自由移動.這一結(jié)果再次表明:苯并[a]蒽會影響磷脂分子的排列結(jié)構(gòu)及成膜過程,苯并[a]蒽的作用行為會因DPPC、POPC相對含量的不同具有差異性.另一方面,苯并[a]蒽與磷脂分子的親合作用可能對苯并[a]蒽的溶解遷移造成影響.由于在較高的表面壓力下,磷脂膜會發(fā)生崩解并伴有部分膜分子進(jìn)入到水相,苯并[a]蒽極有可能在膠束的“拉扯”作用下一同被擠壓到水溶液中,若DPPC/POPC磷脂膠束具有常規(guī)表面活性劑的增溶性能,則會導(dǎo)致苯并[a]蒽的溶出量增多、潛在毒性加劇.

圖3 苯并[a]蒽對DPPC/POPC混合磷脂膜原位微觀形貌的影響Fig.3 Effect of benz[a]anthracene on morphology of mixed DPPC/POPC monolayers

2.4 DPPC/POPC混合磷脂對苯并[a]蒽的增溶作用

為考察DPPC/POPC混合磷脂對苯并[a]蒽的增溶效果,通過公式(2)[39]進(jìn)行定量計算.

式中:Sw*是 PAHs在表面活性劑溶液中的表觀溶解度,mg/L;Sw是PAHs在37℃水中的初始溶解度, mg/L.由圖 4(a)可見,DPPC 能促進(jìn)苯并[a]蒽的溶出,表觀溶解度隨DPPC濃度的增加而變大,當(dāng)CDPPC= 200mg/L時,苯并[a]蒽的表觀溶解度為 1.152mg/L,接近水溶液的3倍,增溶效果較好.由圖4(b)可知,DPPC/POPC混合組分同樣對苯并[a]蒽具有較好的增溶作用,并隨POPC占比的增加效果越明顯,當(dāng)磷脂總濃度 C=100mg/L時,各組的增溶能力依次為:DPPC

圖4 DPPC/POPC混合磷脂對苯并[a]蒽的增溶作用Fig.4 Solubilization of benz[a]anthracene by mixed DPPC/POPC phospholipids

由表1及圖5可知,不同組分的磷脂形成的膠束形態(tài)不同,POPC含量增多會使膠束的平均粒徑變小、分散性指數(shù) PDI降低,隨 POPC含量增加 PDI依次為:0.494>0.405>0.348>0.178.結(jié)合圖 6透射電鏡結(jié)果可見,膠束的形狀也會發(fā)生改變.DPPC膠束形狀不規(guī)則,有層狀、球狀及 DPPC游離分子出現(xiàn),雙組分磷脂膠束形狀趨于規(guī)則同時聚集數(shù)降低,而POPC膠束以球形為主,這說明POPC比DPPC的分散性更好.POPC由于不飽和鍵的存在,分子間的間距較大,這會造成 POPC更低的疏水性以及更強(qiáng)的流動性[40?41],PAHs可能更易滲透到POPC的疏水區(qū),導(dǎo)致在水溶液的分配量增加,這可能是二者增溶能力差異的主要原因.這一結(jié)果表明,對于特殊工作環(huán)境的人員如長期暴露于交通污染的環(huán)衛(wèi)人員、焦化廠從事一線作業(yè)的職工等,由PAHs暴露導(dǎo)致的患病風(fēng)險極高.對于不同生長階段或處于不同生理狀態(tài)的人群更是具有特別重要的意義,由于生理條件改變引起PS組分的變化可能造成PAHs潛在毒性的差異,PAHs對患有相關(guān)肺部疾病的人群造成的肺損傷可能更嚴(yán)重.

表1 DPPC/POPC混合磷脂膠束粒徑及分散性指數(shù)(PDI)Table 1 Particle size and dispersion index(PDI) of DPPC /POPC mixed phospholipid micelles

圖5 DPPC/POPC混合磷脂膠束粒徑分布及TEM表征Fig.5 Particle size distribution and TEM characterization of mixed DPPC/POPC micelles

圖6 DPPC/POPC混合磷脂膠束TEM表征Fig.6 TEM characterization of mixed DPPC/POPC micelles

3 結(jié)論

3.1 由 π?A等溫線結(jié)果可知,苯并[a]蒽對 DPPC/POPC混合磷脂膜的相變影響顯著,會引起磷脂膜壓縮?擴(kuò)張過程中的能量耗散增大,呼吸功增加;結(jié)合彈性模量 Cs-1值分析可得,苯并[a]蒽會明顯削弱膜的抗形變能力,造成膜的有序度降低.苯并[a]蒽產(chǎn)生的不利影響隨POPC含量的增加更加明顯.

3.2 BAM及增溶實驗結(jié)果表明苯并[a]蒽嵌入于磷脂分子之間,DPPC/POPC混合磷脂對苯并[a]蒽有增溶作用.混合磷脂中 POPC含量增加會使形成的磷脂膠束平均粒徑減小、分散性更好,進(jìn)一步促進(jìn)苯并[a]蒽的溶出.

3.3 苯并[a]蒽與 DPPC/POPC混合磷脂的相互作用既抑制PS的生理功能,又會影響苯并[a]蒽的溶解遷移,進(jìn)一步增加苯并[a]蒽的暴露風(fēng)險.同時DPPC、POPC相對含量的變化會使苯并[a]蒽的作用行為具有差異性,可能導(dǎo)致苯并[a]蒽與肺功能損傷的劑量?效應(yīng)關(guān)系改變.