微生物污染源解析技術(shù)研究進展

鄭前興,張 楊,于曉巍,韋思業(yè),黃建洪,吳仁人* (.昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650500；.生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 50655)

隨著人口的激增和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,我國地表水體受人和動物糞便污染的情況日益嚴(yán)重[1].水體遭受糞便污染后,糞便中攜帶的致病微生物進入水體,會引起水源性疾病的爆發(fā),對人類健康構(gòu)成重大威脅[2-4].另一方面,糞便中含有的氮、磷等物質(zhì)進入水體中,會導(dǎo)致水體的富營養(yǎng)化,造成水質(zhì)惡化[5-6].

目前,大多數(shù)國家采用糞大腸菌群(Fecal coliform)或大腸埃希氏菌(Escherichia coli)等傳統(tǒng)指示微生物(FIB)來反映水體微生物污染狀況[7-9],包括我國的《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[10](GB38382002)也一直采用糞大腸菌群作為評價水環(huán)境受微生物污染的指標(biāo)[11].然而,FIB不能提供微生物污染宿主來源方面的相關(guān)信息[12-14],無法幫助研究和管理人員準(zhǔn)確識別污染來源以達(dá)到“精準(zhǔn)治污”的目的[15].此外,來自于不同宿主糞便中的致病微生物對于人體的致病機理和致病程度也有較大差異,因此識別糞便排放來源也有助于準(zhǔn)確評估人類接觸水體后的患病風(fēng)險.

微生物污染源解析技術(shù)(MST)是一種通過檢測水體中特異性生物標(biāo)記或特定微生物群落結(jié)構(gòu)而識別糞便污染來源的新技術(shù)[16-17].相比于 FIB,該方法不僅可以識別水體中的微生物污染來源,還能夠有效預(yù)測部分潛在致病菌的水環(huán)境行為,可對健康風(fēng)險評估提供更準(zhǔn)確的信息[18].目前,常用的MST主要有非庫依賴法和庫依賴法.非庫依賴法主要以PCR技術(shù)為主,通過擴增特異性生物標(biāo)記基因識別糞便污染的排放源,具有時效強、成本低等特點[19-20];庫依賴法則主要以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ),通過基于貝葉斯思想開發(fā)出的 SourceTracker源解析程序[21]、最大化微生物源跟蹤工具[22]和隨機森林[23]等識別特定的微生物群落結(jié)構(gòu),提供污染源信息,具有通量高、微生物信息全面等優(yōu)勢[24-25].然而,2種源解析方法均有其特定的適用條件和缺陷.本文通過對前人的研究進行歸納、總結(jié),闡明不同源解析方法存在的不足和使用條件,指出微生物污染源解析研究的最新發(fā)展方向,為建立準(zhǔn)確、完善的微生物污染源解析技術(shù)提供幫助.

1 非庫依賴法

1.1 qPCR-MST基本原理

由于飲食結(jié)構(gòu)和生存環(huán)境的差異,不同宿主腸道中的微生物種類、群落結(jié)構(gòu)存在一定的區(qū)別,并且分類相同的指示微生物在不同宿主腸道中基因片段也有所不同.MST正是利用這一基因上的差異,通過檢測受污染水體中是否存在特異性生物標(biāo)記,可以判斷不同糞便污染來源[26].目前,研究人員已針對反芻動物(牛、羊、鹿等)、哺乳動物(人、狗、馬、豬、貓等)和禽類(海鷗、雞、鴨、鴿子、雁等)等開發(fā)出了不同特異性標(biāo)記物,并以PCR技術(shù)為基礎(chǔ),在世界各地區(qū)成功識別出環(huán)境水樣中來自各種動物的糞便污染[15,26-28].例如,Bower等[29]識別出美國密歇根湖地區(qū)水體中的糞便污染主要來自于人和牛.張楊等[11]在珠江三角洲地區(qū)識別出城市地表水中的微生物污染主要來自人、禽類和反芻動物糞便.

1.2 標(biāo)記物檢測-實時熒光定量PCR(qPCR)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一項體外擴增核酸片段的技術(shù),具有簡便易行、特異性強、靈敏度高等特點[30].通過使用特異性引物對水樣 DNA進行 PCR擴增,觀察是否出現(xiàn)目標(biāo)條帶,即可判斷水樣受到何種動物糞便污染[3].但 PCR技術(shù)只能定性并且易產(chǎn)生非特異性擴增.而實時熒光定量 PCR(qPCR)技術(shù),通過在 PCR反應(yīng)中加入熒光基團進行實時監(jiān)測,比PCR具有更高的特異性和靈敏度.還可以通過制備標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線或加入內(nèi)參基因的方法,確定每個反應(yīng)的基因拷貝數(shù),實現(xiàn)對污染物的定量分析[11].并且從采樣到分析全過程僅需幾小時就能完成,成為標(biāo)記物檢測的首選方法.

1.3 特異性生物標(biāo)記的適用性

特異性生物標(biāo)記是針對不同宿主腸道微生物中特定的基因序列開發(fā)而來,具有宿主遺傳性和特異性.然而,受不同地區(qū)的氣候、飲食習(xí)慣及生活方式等差異性的影響,各地區(qū)宿主體內(nèi)的腸道微生物種類和結(jié)構(gòu)也不盡相同.例如,Lu等在美國俄亥俄州對野鵝的糞便進行生物多樣性分析時發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌占腸道菌的 30.2%,而在加拿大安大略省則為46.3%[1,31].不同地區(qū)宿主腸道微生物結(jié)構(gòu)的變化也進一步導(dǎo)致了開發(fā)出的特異性標(biāo)記物表現(xiàn)出顯著的地區(qū)差異性.因此,在目標(biāo)研究區(qū)域驗證特異性標(biāo)記物的特性表現(xiàn),識別具有地區(qū)適用性標(biāo)記物是開展微生物污染源解析工作的重要前提.

1.3.1 定性靈敏度 靈敏度是指標(biāo)記物在目標(biāo)糞便樣本中的陽性率,計算公式 R=TP/(TP+FN),其中TP是對目標(biāo)樣本擴增顯示陽性的樣本數(shù);FN是對目標(biāo)樣本擴增顯示陰性的樣本數(shù)[32].標(biāo)記物的靈敏度與其對糞便污染物的檢出率息息相關(guān),靈敏度越高,該標(biāo)記物指示目標(biāo)宿主糞便污染的性能越好.然而,不同地區(qū)標(biāo)記物的靈敏度表現(xiàn)通常存在較大差異.例如,Schiaffino等[33]在秘魯識別出人源擬桿菌標(biāo)記物BacHum靈敏度為 80%,具有較好的適用性.在泰國和尼泊爾部分地區(qū) BacHum靈敏度甚至高達(dá)95%～100%[34].然而在印度[35]和肯尼亞[36]BacHum的靈敏度分別僅有 50%和 18%.導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因是擬桿菌的遺傳變異以及各地區(qū)氣候和生態(tài)壓力不同[33,37].

為克服傳統(tǒng)MST標(biāo)記物(如擬桿菌、線粒體標(biāo)記物)存在的靈敏度低或?qū)撛谥虏【甘拘暂^差等缺點,研究人員針對人腸道中豐度較高的噬菌體crAssphage開發(fā)出了人源特異性標(biāo)記物 CPQ_056和 CPQ_064[38].由于該類標(biāo)記物是針對噬菌體的特異性基因開發(fā)而來,被認(rèn)為與致病菌有近似的環(huán)境行為,成為目前標(biāo)記物驗證工作的熱點[39-40].Stachler等[41]在美國部分地區(qū)識別出CPQ_056和CPQ_064靈敏度高達(dá)100%.然而,本實驗室采用crAssphage標(biāo)記物對在我國 28個城市采集的糞便樣品進行檢測時,CPQ_056和 CPQ_064靈敏度表現(xiàn)較差分別為61%(71/117)和 67%(78/117)[15].Ahmed 等[26]在澳大利亞的研究中CPQ_056靈敏度也僅有38%.導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是crAssphage在不同地區(qū)人類腸道中的分布特征具有一定的差異性.已有研究報道歐洲和美國地區(qū)受糞便污染的水體中crAssphage的豐度顯著高于亞洲和非洲[42-43].說明盡管crAssphage廣泛存在于世界各地人類腸道中,但其豐度也具有明顯的地區(qū)差異性.此外,宿主年齡、健康或其它因素均會改變糞便中crAssphage的分布特征[44-46],從而影響 qPCR檢測結(jié)果[15,46].因此,在大尺度目標(biāo)區(qū)域內(nèi)開發(fā)出靈敏度表現(xiàn)穩(wěn)定的標(biāo)記物仍是目前MST技術(shù)需要進一步解決的難題.

1.3.2 源強特征 如果標(biāo)記物僅具有較高的定性靈敏度,而源強特征(即標(biāo)記物在目標(biāo)物種中的檢出濃度分布特征)較差,則當(dāng)微生物污染源被稀釋或是樣本處理過程中DNA濃度損失時,可能會導(dǎo)致檢測的標(biāo)記物濃度低估水體污染水平,甚至無法檢出水樣中的糞便污染[15,26].因此,近年來部分研究人員在開展標(biāo)記物驗證時,除識別標(biāo)記物的定性靈敏度外,進一步探究了標(biāo)記物的源強特征.

研究表明,不同源指示微生物在目標(biāo)宿主腸道內(nèi)的豐度會影響標(biāo)記物的檢出濃度.Zhang等[15]的研究發(fā)現(xiàn)人源擬桿菌標(biāo)記物 HF183、BacHum 和BacH在人糞樣本中的檢出濃度比假定蛋白BF3236標(biāo)記物 Hum163和Hum2以及 crAssphage標(biāo)記物CPQ_064和CPQ_056檢出濃度高1～2個數(shù)量級.導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是在大部分哺乳動物腸道中,擬桿菌的相對豐度高于其它種類的腸道微生物[47-48].此外,相同源指示微生物種類在不同宿主之間的分布差異也對標(biāo)記物的檢出濃度有顯著影響.例如,Reischer等[49]在世界六大洲針對擬桿菌標(biāo)記物適用性開展的研究發(fā)現(xiàn),用于指示反芻動物糞便污染的擬桿菌標(biāo)記物BoBac、BacR以及BacCow的檢出濃度均高出人源擬桿菌標(biāo)記物 BacH和BacHum 1～2個數(shù)量級,且濃度分布的離散程度更低,說明反芻動物標(biāo)記物具有較好的源強特征,這與Zhang等[15]在我國調(diào)查的擬桿菌標(biāo)記物源強特征的結(jié)果一致.這可能是反芻動物腸道中的擬桿菌豐度要高于人類所致.Hong等[50]在分析哺乳動物腸道菌群時發(fā)現(xiàn),反芻動物和豬腸道內(nèi)擬桿菌相對豐度普遍高于人類,同時大部分?jǐn)M桿菌屬如 Bacteroides caccae、Bacteroides uniformis、Bacteroides vulgatus和 Bacteroides fragilis等在牛和豬腸道微生物群落結(jié)構(gòu)中的豐度表現(xiàn)也更為穩(wěn)定.由此可見,源指示微生物在宿主腸道中的分布特征與特異性標(biāo)記物的源強特征具有極強的關(guān)聯(lián)性,在標(biāo)記物的開發(fā)、設(shè)計階段,應(yīng)充分考慮源指示微生物的分布及穩(wěn)定性等情況,以提高源解析結(jié)果的準(zhǔn)確性.

1.3.3 交叉反應(yīng)(假陽性反應(yīng)) 特異性是評價標(biāo)記物的另一重要指標(biāo),是指標(biāo)記物在非目標(biāo)糞便樣本中的陰性率,計算公式S=TN/(TN+FP),其中TN是對非目標(biāo)樣本擴增顯示陰性的樣品數(shù);FP是對非目標(biāo)樣本擴增顯示陽性的樣品數(shù)[32].一個高度宿主特異性的標(biāo)記物可以準(zhǔn)確識別糞便污染的來源.迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)一種標(biāo)記物可對其宿主表現(xiàn)出絕對的特異性[15].在非目標(biāo)樣品中發(fā)生的交叉反應(yīng)是導(dǎo)致標(biāo)記物特異性降低的主要原因[51],例如 Malla等[34]發(fā)現(xiàn)人源特異性標(biāo)記物 crAssphage與狗、鴨、雞,豬產(chǎn)生較高比例的假陽性反應(yīng),導(dǎo)致其特異性下降至 63%.目前,關(guān)于標(biāo)記物與非目標(biāo)動物產(chǎn)生交叉反應(yīng)的機理尚不明確,部分研究推測不同動物在特定環(huán)境中存在的共居關(guān)系可能會導(dǎo)致含有標(biāo)記基因的微生物在腸道內(nèi)短暫定殖,進而使得標(biāo)記物產(chǎn)生假陽性結(jié)果.例如,Nshimyimana等[52]在新加坡的研究發(fā)現(xiàn)人源特異性標(biāo)記物 HF183中來自兔子糞便的假陽性信號比例較高,而該地區(qū)兔子是常見的寵物.同時,相似的飲食也會引起標(biāo)記物與非目標(biāo)宿主產(chǎn)生交叉反應(yīng)[33,39,53].如在本文前期研究中,馬和驢與反芻動物標(biāo)記物 Rum-2-Bac、Bac708、BacCow產(chǎn)生較高水平的交叉反應(yīng)[15],進一步分析可能是因為馬、驢和反芻動物飲食均以草料為主,其腸道微生物具有同源性或相似性[54].

盡管標(biāo)記物均會產(chǎn)生假陽性擴增,但大多數(shù)標(biāo)記物僅與部分非目標(biāo)動物產(chǎn)生交叉反應(yīng),且不同標(biāo)記物產(chǎn)生的交叉反應(yīng)動物也不盡相同,這為有效排除假陽性反應(yīng),準(zhǔn)確識別微生物污染來源提供了可能.已有諸多研究報道,標(biāo)記物與糞便樣品的交叉反應(yīng)可以通過同時檢測兩個或多個標(biāo)記物來解決[15,26].例如,本文前期研究表明,Hum2在驢糞樣品中存在的交叉反應(yīng)可以通過使用人源標(biāo)記物CPQ_056進行識別,并且CPQ_056在狗和鴨糞樣本中的假陽性擴增也可用Hum2識別[15].Ahmed等[26]也發(fā)現(xiàn)HF183在雞、鴯鹋和考拉糞便中的假陽性擴增可以用crAssphage標(biāo)記物CPQ_056來識別.

1.3.4 假陽性信號強度 盡管標(biāo)記物對非目標(biāo)宿主糞便樣品產(chǎn)生的假陽性擴增給微生物污染源解析的應(yīng)用帶來了一個重大挑戰(zhàn),但大多數(shù)假陽性信號強度顯著低于標(biāo)記物的源強特征.例如,Reishcer等在 16個國家開展評估人和反芻動物擬桿菌標(biāo)記物表現(xiàn)時,發(fā)現(xiàn)BacH、BacHum、BacCow、BacR和BoBac 的源強特征較假陽性信號強度高出 2～4個數(shù)量級[49].Ahmed等[26]的研究也發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物CPQ_056、HF183和Lachno3的源強特征比假陽性信號強度高 1～5個數(shù)量級.因此,通過稀釋樣品、純化DNA等方法,可以將標(biāo)記物的假陽性信號降低至檢測限以下,從而準(zhǔn)確識別糞便污染來源[55-56].例如,Hundesa等[7]和Li等[57]在進行微生物污染源解析工作時,通過稀釋 DNA,降低了假陽性信號水平,準(zhǔn)確識別出目標(biāo)區(qū)域的豬源糞便污染.值得注意的是,部分非目標(biāo)動物與標(biāo)記物產(chǎn)生的假陽性信號強度可能與目標(biāo)動物中的檢出濃度位于同一數(shù)量級.此類假陽性信號可能無法通過實驗手段予以排除[15].在開展微生物污染源解析工作時,應(yīng)注意篩選出對標(biāo)記物產(chǎn)生假陽性信號強度較高的物種,通過標(biāo)記物組合的方式對其進行識別,甚至避免使用此類標(biāo)記物.然而,盲目增加標(biāo)記物個數(shù),會導(dǎo)致組合中存在冗余的標(biāo)記物,增加監(jiān)測成本.因此,建立不同標(biāo)記物組合的工具箱(toolbox)對于準(zhǔn)確識別污染源具有重大意義.基于此,Ballesté等[58]和 Blanch 等[59]研究了影響標(biāo)記物組合的因素.Ballesté等考慮了標(biāo)記物衰減對MST結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)水樣老化和稀釋后,標(biāo)記物的源強特征降低,而難以識別污染源[58].Blanch等人提出,如果標(biāo)記物在環(huán)境中具有相似的衰減規(guī)律,則此類標(biāo)記物組合能較好地識別環(huán)境水體中糞便污染,適合建立“toolbox”,在檢測被稀釋或混合樣品時也具有優(yōu)勢[59].然而根據(jù)本文目前正在開展的研究結(jié)果,使用具有不同衰減趨勢的標(biāo)記物,建立“toolbox”可以幫助研究人員獲得糞便污染的更多背景信息,包括定性和定量信息.如擬桿菌標(biāo)記物BacHum具有較高的靈敏度,crAssphage標(biāo)記物CPQ_056衰減速率較小,同時使用BacHum和CPQ_056可以幫助識別不同時期(近期和遠(yuǎn)期)甚至是遠(yuǎn)離監(jiān)測點的污染源.

本文前期研究識別出部分適用于我國的標(biāo)記物(見表 1)[15],并成功識別出龍江流域人源污染>反芻動物(牛)>豬和禽類.從表 1可以看出標(biāo)記物的靈敏度和特異性呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)關(guān)系,較難同時滿足靈敏度、特異性>80%.根據(jù)美國國家環(huán)境保護局(US EPA)建議,表現(xiàn)好的標(biāo)記物靈敏度和特異性應(yīng)大于80%[26,60].同時,在同一宿主中不同種類標(biāo)記物的源強特征差異較大,這在以往的研究中容易被忽略,而這為選取何種標(biāo)記物作為評價污染源貢獻率和潛在的健康風(fēng)險水平提出了重大挑戰(zhàn).例如,在開展微生物定量風(fēng)險評估以 USEPA感染胃腸道疾病的風(fēng)險閾值(30/1000)為標(biāo)準(zhǔn)時,擬桿菌標(biāo)記物 HF183濃度為4100GC/100mL[61],而crAssphage標(biāo)記物CPQ_056濃度為9100GC/100mL[62].未來應(yīng)進一步探索致病菌的分布特征和傳統(tǒng)水質(zhì)指標(biāo)與各類標(biāo)記物檢出濃度的內(nèi)在關(guān)系,以期為相關(guān)水質(zhì)指標(biāo)的制定以及人類健康風(fēng)險的評估提供關(guān)鍵信息.

表1 不同標(biāo)記物表現(xiàn)Table 1 Different marker performance in China

2 庫依賴法

高通量測序(HTS)又叫下一代測序或深度測序,可一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子同時進行序列測定.大量序列數(shù)據(jù)的產(chǎn)生,讓研究人員能更深入地挖掘基因組信息,擴展到以前難以深入的領(lǐng)域,極大地促進了人們對腸道微生物多樣性的理解,也使得研究人員可通過分析微生物群落的結(jié)構(gòu)特征來識別微生物污染的來源[63-66].庫依賴法的基本原理是通過對不同來源動物糞便16S rRNA基因進行高通量測序[67-71],然后構(gòu)建糞便源解析文庫(FTL),并通過開發(fā)出的機器學(xué)習(xí)方法與水樣中的微生物群落進行對比,最終識別出微生物污染來源及相對貢獻量.目前,已開發(fā)出的機器學(xué)習(xí)方法有SourceTracker、最大化微生物源跟蹤工具(FEAST)、隨機森林(Random Forest)等[21-23],SourceTracker因具有準(zhǔn)確性好,靈敏度高和特異性強等優(yōu)勢得到了較為廣泛的應(yīng)用[6].因此,本文主要對采用SourceTracker開展源解析的方法進行論述.

2.1 SourceTracker

通過對不同宿主糞便以及環(huán)境水樣 16S rRNA基因進行高通量測序,SourceTracker源解析程序?qū)⒉煌S便來源微生物群落和待分析的水體微生物群落當(dāng)做一個整體,基于貝葉斯算法,識別水樣中不同宿主來源微生物所占比例,解析水樣糞便污染來源[21].目前,研究人員已在不同區(qū)域應(yīng)用此方法識別出了水環(huán)境中不同糞便污染來源及其貢獻率[71-72].例如,Brown等[73]使用SourceTracker成功識別出蘇必利爾湖河口糞便污染主要來自污水處理廠排放的廢水(70%)和海鷗糞便(30%),與qPCR方法所得結(jié)果一致[74-75].為了進一步評估 SourceTracker解析污染源的能力,Staley等[76]將5種來源糞便以不同比例添加到淡水中,發(fā)現(xiàn)其識別糞便污染準(zhǔn)確性高達(dá)91%;即使在較低濃度下也未出現(xiàn)假陰性結(jié)果,其特異性超過現(xiàn)有大部分MST標(biāo)記物.此外,有研究表明庫依賴法源解析結(jié)果的準(zhǔn)確性與 SourceTracker運行參數(shù)設(shè)置存在一定的內(nèi)在聯(lián)系[77-78].Brown等[73]在解析蘇必利爾湖河口的污染源時,發(fā)現(xiàn)多次運行SourceTracker所得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)與預(yù)測結(jié)果呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,污水處理廠排放廢水的糞便污染比例為68.3%,其RSD為2.48%;而鵝糞便污染比例為6.1%,RSD達(dá)20.71%.Henry等[79]評估近海岸糞便污染時觀察到類似的現(xiàn)象,當(dāng)人源污染比例為 10%時,RSD為8%;而人源污染比例為0.1%時,RSD高達(dá)55%,其預(yù)測準(zhǔn)確性較低.因此,可以通過增加SourceTracker的運行次數(shù),利用RSD值排除假陽性結(jié)果(RSD>100%)[80],以獲取更為準(zhǔn)確的污染源信息[81].此外,Henry等[79]研究了抽平深度、burn-in次數(shù)、dirichlet超參數(shù)α和β對SourceTracker預(yù)測的靈敏度和準(zhǔn)確性影響;發(fā)現(xiàn)隨著 SourceTracker抽平深度從1000增加到50000,檢測靈敏度可以從90%增加到100%,α和β值的改變也提高了SourceTracker預(yù)測的靈敏度和準(zhǔn)確性,而burn-in次數(shù)對結(jié)果影響較小.可見,SourceTracker運行參數(shù)顯著影響源解析結(jié)果,而目前相關(guān)研究較少,尚未確定SourceTracker運行最優(yōu)參數(shù).綜上所述,SourceTracker為識別不同污染來源提供了便利,但仍需對程序運行參數(shù)進行優(yōu)化,使預(yù)測結(jié)果更加準(zhǔn)確.

2.2 糞便源解析文庫(FTL)

2.2.1 宿主種類對FTL的影響 庫依賴法解析污染源的準(zhǔn)確性與糞便源解析文庫息息相關(guān).由于不同區(qū)域、不同宿主之間糞源微生物結(jié)構(gòu)的變異性有較大差異,使用SourceTracker解析污染源時,必須考慮 FTL 的不同組成.Brown等[82]在使用SourceTracker分析已知污染源(牛糞和污水)的水樣時,發(fā)現(xiàn)當(dāng)FTL中納入過多的宿主類型(海貍、貓、雞、牛、鹿、狗、鵝、鷗、馬、兔子、豬、火雞、污水)時,預(yù)測結(jié)果出現(xiàn)了禽類和馬的假陽性結(jié)果,而禽類和馬糞污染在目標(biāo)研究區(qū)域內(nèi)實際是不存在的.與此相對,當(dāng)FTL中僅納入牛、馬和污水樣本時,雖然禽類污染的假陽性結(jié)果消失,但馬糞污染的假陽性結(jié)果仍然存在.由此可見,FTL中涵蓋宿主種類過多或過少均會影響SourceTracker源解析結(jié)果.另一方面,解析目標(biāo)研究區(qū)域的污染源時,能否采用其它地區(qū)糞便樣本建立 FTL也是研究者關(guān)注的重點.例如,Staley等[76]發(fā)現(xiàn),使用非目標(biāo)區(qū)域采集的糞便樣本構(gòu)建FTL時,難以準(zhǔn)確識別區(qū)域內(nèi)水環(huán)境中的糞便污染來源,轉(zhuǎn)而使用目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的糞便樣本構(gòu)建FTL后,運用SourceTracker模型則能夠準(zhǔn)確將不同的污染源準(zhǔn)確區(qū)分開來.因此在使用SourceTracker解析污染源時,對目標(biāo)區(qū)域潛在糞便來源調(diào)查以構(gòu)建合適 FTL對于準(zhǔn)確識別污染源至關(guān)重要.此外,還有研究發(fā)現(xiàn)不同時期收集的糞便樣本構(gòu)建的 FTL可能對源解析結(jié)果也具有一定影響.O'Dea等[6]在探究 FTL的變異性時發(fā)現(xiàn),兩次收集的糞便樣本微生物群落相似性最大僅為 15%,主要原因是宿主腸道微生物群落可能受到氣候變化的影響,同種類宿主在不同時期表現(xiàn)出的糞源微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大.綜上所述,FTL也具有“地區(qū)適用性”,在目標(biāo)區(qū)域解析污染源時,應(yīng)考慮糞源微生物群落組成的地理以及種間變異性,定期更新FTL以保證源解析結(jié)果的準(zhǔn)確性.

2.2.2 樣本量對 FTL的影響 FTL構(gòu)建使用每個糞便來源共同的 OTU,高種內(nèi)變異性可能會使SourceTracker難以識別污染源,因此每類宿主應(yīng)納入的個體數(shù)量成為困擾建庫源解析法準(zhǔn)確性的重要因素.已有部分研究嘗試通過權(quán)重分析來確定源文庫中各宿主應(yīng)囊括的樣本量,以保證源解析結(jié)果的準(zhǔn)確性[83].例如,Brown等[82]在使用SourceTracker解析蘇必利爾湖河口的污染源時,用權(quán)重分析確定了使 FTL中具有統(tǒng)計意義的樣本數(shù),發(fā)現(xiàn)當(dāng)每類宿主的樣本量小于12時,權(quán)重在31%以下,而樣本量大于 12時,權(quán)重達(dá)到了 100%,能夠準(zhǔn)確識別各污染源.Staley等[76]的研究表明,即使FTL中僅包含10個樣本,采用 SourceTracker仍然能夠準(zhǔn)確識別盲樣中的糞便污染來源.甚至有研究人員僅采用了 2個樣本即可建立 FTL,并準(zhǔn)確識別水體中的污染來源[84].值得注意的是,除了權(quán)重分析,部分研究還通過 RSD來評估宿主樣本量大小對源解析結(jié)果的影響.當(dāng)FTL中樣本量較小時,SourceTracker解析污染源的準(zhǔn)確性相對較低.例如,當(dāng)蝙蝠、人、牛和兔子樣本數(shù)量分別為8、2、3和4時,SourceTracker預(yù)測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差高達(dá) 68%,運行結(jié)果難以真實地反映出水體中污染物的宿主來源[79].由此可見,未來仍需加強對 FTL最適樣本量的研究,在保證源解析結(jié)果的同時避免資源的浪費.

2.3 土著微生物對庫依賴法源解析結(jié)果影響

水環(huán)境中的土著微生物對維持生態(tài)平衡,修復(fù)和改善水質(zhì)狀況起到重要作用,但同時也給建庫源解析方法的應(yīng)用帶來較多的不確定性.已有研究表明,源文庫中與土著微生物分類較為接近的物種可能會導(dǎo)致難以準(zhǔn)確區(qū)分微生物污染來源[85].例如,在Brown等[73]的研究中,由于海鷗和鵝的糞源微生物群落與研究區(qū)域水體中的部分土著微生物分類較為接近,導(dǎo)致源解析結(jié)果中出現(xiàn)了海鷗和鵝等動物的假陽性信號.Brown等[82]在驗證源文庫的有效性時也發(fā)現(xiàn)由于污水中存在接近 40%的微生物種類與湖水中的土著微生物較為接近,導(dǎo)致源解析結(jié)果的準(zhǔn)確性顯著降低.此外,土著微生物與水體中糞源微生物存在的相互作用也可能顯著干擾建庫源解析法的準(zhǔn)確性.Byappanahalli等[86]在探討土著微生物與糞源微生物的共存關(guān)系時發(fā)現(xiàn),在土著微生物的抑制作用下,糞源微生物繁殖數(shù)量減少了 1～2個數(shù)量級,這顯著影響糞源微生物與源文庫的對應(yīng)關(guān)系.相反,部分腸道微生物也可能在環(huán)境中與土著微生物產(chǎn)生共生效應(yīng),進而導(dǎo)致源解析結(jié)果中包含部分假陰性結(jié)果.目前,關(guān)于環(huán)境中生物因素對于測序源解析方法的影響研究較少,未來應(yīng)加強土著微生物與源文庫中各類微生物相互作用機制的研究.

近年來,MST在準(zhǔn)確識別和量化環(huán)境中的糞便污染來源上取得了較大的進展,2種源解析方法均得到了廣泛應(yīng)用.基于 PCR技術(shù)的庫依賴法可以在較短時間內(nèi)獲得糞便污染信息,基于高通量測序的庫依賴法可一次識別和量化多個污染源.總體而言,2種源解析方法有其各自的適用條件(表 2),在幫助管理和研究人員識別環(huán)境水體中的糞便污染上各有優(yōu)勢.

表2 2種源解析方法對比Table 2 Comparison of two MST methods

3 結(jié)論

非庫依賴法識別污染源的性能與標(biāo)記物表現(xiàn)相關(guān),對地區(qū)適用性標(biāo)記物的識別和評估應(yīng)基于定性(即靈敏度和特異性)和定量(即源強特征)兩方面的研究.在開展微生物溯源工作時,使用具有不同衰減規(guī)律的標(biāo)記物,建立標(biāo)記物組合“toolbox”有助于排除假陽性信號,提高污染源識別的準(zhǔn)確性.庫依賴法識別污染源的準(zhǔn)確性受 SourceTracker運行參數(shù)和 FTL組成的影響.FTL構(gòu)建仍需考慮“地區(qū)適用性”,在通過權(quán)重分析確定FTL中應(yīng)涵蓋的宿主種類及個體數(shù)量的同時增加程序運行次數(shù)可顯著提高SourceTracker識別污染源的能力.

4 展望

對于非庫依賴法,大多數(shù)研究對標(biāo)記物的適用性評價主要以定性靈敏度和特異性為主,而忽略了標(biāo)記物的源強特征.此外,對導(dǎo)致標(biāo)記物特異性下降的交叉反應(yīng)產(chǎn)生的機理尚不明確,影響源解析結(jié)果的準(zhǔn)確性.而建立不同標(biāo)記物組合的“toolbox”可以提高識別污染源的能力,基于此本文課題組已構(gòu)建模擬反應(yīng)器探究不同標(biāo)記物的衰減規(guī)律,以期為“toolbox”建立提供理論依據(jù).未來應(yīng)加強對標(biāo)記物源強特征產(chǎn)生差異的成因以及交叉反應(yīng)產(chǎn)生機理方面的探索,為標(biāo)記物的開發(fā)提供理論支撐.

對建庫源解析方法而言,由于糞源微生物群落結(jié)構(gòu)具有變異性,導(dǎo)致 FTL表現(xiàn)出時間和空間上的差異,進而影響源解析結(jié)果.因此,未來應(yīng)加強種內(nèi)和種間變異程度對建庫源解析方法影響的研究,探究構(gòu)建 FTL時應(yīng)涵蓋的宿主種類、個體數(shù)量及 FTL更新周期,提高識別糞便污染的能力.

環(huán)境中土著微生物的種類對于建庫源解析方法影響較為顯著,但由于土著微生物群落結(jié)構(gòu)變化及地區(qū)差異性較大,使得關(guān)于土著微生物對建庫源解析方法的影響規(guī)律認(rèn)識還不夠深入.基于此,本文課題組已對不同樣本進行高通量測序,以期揭示不同糞源微生物群落結(jié)構(gòu)的異同,區(qū)分糞源微生物與土著微生物的豐度及分布特征.未來應(yīng)加強對土著微生物與糞源微生物競爭機制的研究,闡明 FTL受土著微生物種類的影響機理,提高在土著微生物影響下SourceTracker識別污染源的能力.

致謝：感謝哈爾濱工業(yè)大學(xué)汪磊博士對本論文英文摘要以及表的英文表題的審閱和修訂.