菌株WYT降解還原藍(lán)4的關(guān)鍵基因

馬 倩,李海紅,王洋濤 (西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710600)

蒽醌染料是紡織工業(yè)中普遍存在的合成著色劑[1].由于蒽醌染料價(jià)格低廉,容易獲取且染色效果好,是繼偶氮染料之后應(yīng)用量最大的一類染料.蒽醌染料結(jié)構(gòu)復(fù)雜并穩(wěn)定,對(duì)微生物和人體細(xì)胞的毒性甚至大于偶氮染料[2].若將未徹底處理的印染廢水排放到環(huán)境中,會(huì)對(duì)水、土壤造成嚴(yán)重的污染.目前,處理印染廢水方法主要有物理、化學(xué)和生物處理法,包含吸附、絮凝、光催化、離子交換及生化氧化等方法[3-5].生物法處理蒽醌染料具有效率高、成本低且環(huán)保的優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)成為研究熱點(diǎn).還原藍(lán)4(VB4)作為一種蒽醌類染料,不易被降解,具有良好的色牢度[6-7].微生物主要通過(guò)生物降解和生物吸附將 VB4脫色.生物降解過(guò)程中,原始染料結(jié)構(gòu)被微生物的酶分解成小分子化合物,芳香族聚合物被轉(zhuǎn)化為CO2、H2O和一些無(wú)機(jī)鹽[8].在生物吸附過(guò)程中,作為污染物的染料被吸收到微生物細(xì)胞質(zhì)中或者表面,而不是結(jié)構(gòu)被破壞[9].由于細(xì)胞表面富含多糖成分,被含有官能團(tuán)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)包圍,染料可以與菌體表面的活性基團(tuán)相互作用從而被吸附固定[10].池振明等[11]從印染廠排出水中分離出的鄰單胞菌Plesiomonas sp.X13脫色率可達(dá)75%以上.Velayutham等[12]篩選出一株Staphylococcus sp.K2204菌株,在12h內(nèi)可完全降解活性藍(lán) KN-R.Yang等[13]利用混合菌群降解活性藍(lán)19,可在 48h內(nèi)脫色 89.2%的染料.雖然目前已篩選出一些高效降解脫色蒽醌染料的菌株,但對(duì)其降解機(jī)理研究較少,尤其缺乏對(duì)降解的關(guān)鍵基因和酶的研究.

本文對(duì)前期篩選出的一株高效降解 VB4的菌株 WYT進(jìn)行研究,通過(guò)全基因組測(cè)序,確定該菌株中降解脫色的關(guān)鍵基因 DyP,通過(guò)基因敲除回補(bǔ)驗(yàn)證DyP基因?yàn)榻到釼B4的關(guān)鍵基因.以期為印染廢水的微生物處理技術(shù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Pseudomonas aeruginosa(銅綠假單胞菌)WYT,是本課題組前期從印染廠活性污泥中篩選出的一株可高效降解VB4的革蘭氏陰性菌.

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(ISM):KH2PO41.0g, Na2HPO4?12H2O 2.0g, MnSO4?7H2O 0.02g,FeSO4?7H2O 0.01g,MgSO4?7H2O 0.2g,CaCl20.02g,NH4Cl 0.5g,2.0mL/L微量鹽溶液,用1mol/L NaOH與1mol/L HCl調(diào)節(jié)初始pH 7.0.121℃,20min高溫高壓滅菌備用.微量鹽溶液(mg/L):CoCl2?6H2O 4.0,MnSO4?H2On2.8,H3BO34.0, CuSO4?5H2O 0.02,ZnSO4?7H2O 28.0,MoO34.0.0.24μm 濾膜過(guò)濾備用.用于培養(yǎng)菌株時(shí),按需要加入VB4染料及其他底物.LB培養(yǎng)基(g/L)、LB固體培養(yǎng)基.培養(yǎng)條件:Pseudomonas aeruginosa WYT菌株在ISM或LB中活化培養(yǎng),大腸桿菌在 37℃恒溫培養(yǎng),抗生素添加的濃度為:慶大霉素(Gm)50μg/mL,四環(huán)霉素(Tc)10μg/mL.異丙醇-β-D 硫代半乳糖苷(IPTG)添加至所需濃度,2,6-二氨基庚二酸(2,6-DAP)終濃度為0.3mmol/L.

1.1.3 試劑 基因組提取、質(zhì)粒提取、膠回收、核酸純化采用 Omega公司的試劑盒(E.Z.N.A.TM).其他常規(guī)的化合物購(gòu)于阿拉丁、國(guó)藥集團(tuán)或美國(guó)Sigma-Aldrich科技有限公司,且均為分析純以上.

1.2 基因組文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序分析方法

首先對(duì)菌株WYT處理后的樣品進(jìn)行檢測(cè),將合格的樣品用于文庫(kù)構(gòu)建,用g-tubes將DNA基因組隨機(jī)打斷,產(chǎn)生 DNA 片段,利用 PacbioSMRTBELL建庫(kù)試劑盒構(gòu)建,將大片段的連接產(chǎn)物用 BluPippin回收,最后對(duì)合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序.

利用 SMRTAnalysisv2.3軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,計(jì)算得到有效數(shù)據(jù).用三代數(shù)據(jù)拼接算法,對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝和糾錯(cuò),將處理后的優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)優(yōu)化,得到基因組拼接序列.分析基因組進(jìn)行組分,得到基因成分,參考 GO、KEGG 和 Swiss-Prot,以及NR和COG數(shù)據(jù)庫(kù),將預(yù)測(cè)獲得的ORF區(qū)域進(jìn)行功能注釋.

基因組提取、質(zhì)粒提取、割膠回收及核酸純化等操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.

1.3 關(guān)鍵目的基因分析比對(duì)

為探索影響 VB4降解脫色的關(guān)鍵基因,將測(cè)得的全基因組序列與主要基因庫(kù)中的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),并未發(fā)現(xiàn)與VB4降解相關(guān)的基因.分析其他染料降解的過(guò)氧化物酶,根據(jù) PeroxiBase數(shù)據(jù)庫(kù),將DyP-type過(guò)氧化物酶分為4個(gè)類型,分別為A型、B型、C型以及D型.下載4個(gè)分組中的基因序列,用Bioedit軟件與原基因序列比對(duì),然后利用MEGA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析,在WYT基因組的hits找到目的基因.

1.4 基因敲除與回補(bǔ)

1.4.1 抗生素敏感性測(cè)試 參考文獻(xiàn)[14],將WYT菌液分別接種到含有慶大霉素(GM)、四環(huán)霉素(Tc)青霉素(P)、氯霉素(C)、卡那霉素(Kan)等抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng),每種抗生素設(shè)不同濃度,慶大霉素(Gm)50μg/mL,四環(huán)霉素(Tc)10μg/mL.異丙醇-β-D 硫代半乳糖苷(IPTG)添加至所需濃度,2,6-二氨基庚二酸(2,6-DAP)終濃度為0.3mmol/L,觀察菌株的生長(zhǎng)情況.

1.4.2 線性化質(zhì)粒 PEX18Tc線性化:利用含有10μLTc的液體LB活化培養(yǎng)PEX18Tc菌株,提取2管質(zhì)粒備用.選擇雙酶切位點(diǎn):BamHI與 HindIII,質(zhì)粒添加量需根據(jù)提取的濃度計(jì)算.酶切溫度選擇 2個(gè)內(nèi)切酶溫度比較低的參數(shù),酶切時(shí)間為 4h,然后跑膠驗(yàn)證是否酶切完全.將酶切成功的質(zhì)粒進(jìn)行純化,用Nanodrop確定純化后的線性質(zhì)粒濃度,濃度不可過(guò)低,過(guò)低導(dǎo)致后續(xù)連接效率變低.酶切反應(yīng)的體系(50μL) 如下 :5μL Buffer10×K,1μL BamHI,1μL HindIII,40μL PEX18Tc質(zhì)粒,3μL 無(wú)菌水.

1.4.3 構(gòu)建敲除載體 利用 VectorNTI軟件構(gòu)建敲除質(zhì)粒[15],為保證敲除目的基因不受兩端堿基的影響,選擇擴(kuò)增目的基因的上下游長(zhǎng)度為1000bp的同源臂序列,模擬構(gòu)建敲除載體[16-18].敲除質(zhì)粒的構(gòu)建順序?yàn)?質(zhì)粒序列-上游1000bp上游同源臂-替代目的基因的抗性基因-1000bp下游同源臂-質(zhì)粒序列,保證以上序列 ORF方向與待敲除的目的基因序列的方向一致.

1.4.4 擴(kuò)增基因片段 設(shè)計(jì) 3對(duì)引物,設(shè)計(jì)規(guī)則根據(jù)無(wú)縫克隆設(shè)計(jì)[19-20].基因片段連接處重復(fù) 15bp,加18～22bp待擴(kuò)增基因序列,總長(zhǎng)為33～37bp且一對(duì)上下游引物設(shè)計(jì)的Tm值差距較小(無(wú)需考慮15bp的重復(fù)序列),將設(shè)計(jì)好的引物用于擴(kuò)增目的基因的上游同源臂、下游同源臂及抗性基因序列.用高保真酶(fastPfu)對(duì)各個(gè)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增[21-22]的體系及程序如下:擴(kuò)增體系:正向引物(10μmol/L)1μL,反向引物(10μmol/L)1μL,5×高保真酶緩沖液 10μL,2.5mmol/L 底物4uL,高保真酶DNA聚合物1uL,蒸餾水適量.擴(kuò)增程序;95℃ 20s,33個(gè)循環(huán)為95℃ 20s,55℃ 20s,72℃ 20s,72℃ 5min,16℃ 1min.等待 3 個(gè)基因片段擴(kuò)增完成后,跑膠驗(yàn)證條帶大小是否正確,若準(zhǔn)確則開(kāi)始純化,用核酸純化試劑盒純化后測(cè)序,若未發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn),進(jìn)行下一步的研究.

1.4.5 無(wú)縫克隆 無(wú)縫克隆[23-25]參考?HDCloning Kit的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,主要是上游同源臂、GM抗性基因片段、下游同源臂、線性化的PEX18Tc等4個(gè)片段的連接.無(wú)縫克隆的體系為:5×無(wú)縫克隆HD復(fù)合酶制劑2μL,上游同源臂50ng,下游同源臂50ng,線性化后質(zhì)粒 50ng,基因組片段 50ng,加至10μ超純水.

研究需在冰上進(jìn)行,完成后在 50℃的金屬浴中孵育 10min,迅速取出冰浴 2～3min,將無(wú)縫克隆后的產(chǎn)物導(dǎo)入 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂抗性平板進(jìn)行后續(xù)研究.在 DH5α平板上挑取單克隆,驗(yàn)證各個(gè)片段的連接是否成功.重新設(shè)計(jì) 2對(duì)引物,最外端的引物需包含所有的片段,即200bp質(zhì)粒上游-1000bp上游同源臂-GM 抗性基因序列-1000bp下游同源臂序列-200bp質(zhì)粒下游片段.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠,驗(yàn)證條帶大小后測(cè)序.用VectorNTI軟件將測(cè)序結(jié)果與模擬序列比對(duì),若無(wú)突變點(diǎn),可進(jìn)行下一步.

1.4.6 基因敲除 提取測(cè)序后的 DH5α質(zhì)粒,用熱激法[26-27]導(dǎo)入 E.coli WM3064感受態(tài)細(xì)胞中,將含有E.coliWM3064菌液涂布到抗生素平板中,挑取單克隆后PCR擴(kuò)增,跑膠驗(yàn)證條帶大小.分別在LB(需添加 DAP 及抗生素)培養(yǎng)液中活化含有敲除載體的E.coli WM3064及待敲除菌株(WYT).收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的菌體,用 LB培養(yǎng)液清洗 3遍,以E.coliWM3064與WYT菌株的體積比為2:1均勻混合,涂布到含有DAP的LB平板,放置在30℃下培養(yǎng),直到結(jié)合菌液周?chē)霈F(xiàn)暈圈,用 LB清洗下來(lái),涂含有抗生素(GM)的平板.在同源臂之外需再次設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后測(cè)序驗(yàn)證,若菌液中擴(kuò)增出了完整的1000bp上游同源臂-GM序列-1000bp下游同源臂,則獲得敲除菌株.

1.4.7 基因回補(bǔ) 當(dāng)菌株的 DyP基因被敲除且該菌株不具備降解VB4能力時(shí),應(yīng)設(shè)計(jì)回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),將敲除的基因回補(bǔ),驗(yàn)證其降解能力.選取革蘭氏陰性菌質(zhì)粒pRK415作為載體進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn).將pRK415質(zhì)?；罨囵B(yǎng)后,用HindIII與EcoRI作雙酶切,導(dǎo)入完整的 DyP基因序列,保證啟動(dòng)子下游的翻譯起始框和DyP基因序列同框.擴(kuò)增后的DyP基因與線性質(zhì)粒無(wú)縫克隆連接,導(dǎo)入DH5α中后涂Tc抗性平板,挑取單克隆,將新設(shè)計(jì)的引物用于驗(yàn)證,跑膠驗(yàn)證和測(cè)序結(jié)果正確后,將質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliWM3064,再涂抗性平板,挑取單克隆,條帶大小準(zhǔn)確則進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).將帶有DyP基因序列的E.coliWM3064和WYT菌株過(guò)夜結(jié)合,洗脫結(jié)合菌體后涂抗性平板篩選,挑取單克隆做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證是否產(chǎn)生了雙交換,如果發(fā)生了改變就證明已經(jīng)獲得敲除株△DyP.

1.5 敲除回補(bǔ)表型驗(yàn)證

準(zhǔn)備50mg/L的VB4培養(yǎng)液,將野生株、敲除株及回補(bǔ)株接入進(jìn)行降解脫色實(shí)驗(yàn),每隔 4h提取0.5mL培養(yǎng)液,以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min去除菌體,測(cè)其在特征波長(zhǎng)615nm下的吸光度,計(jì)算脫色率率.公式如下:

式中:A1為初始的吸光度,At為培養(yǎng) t h的吸光度值[28].

2 結(jié)果與討論

2.1 全基因測(cè)序結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序后對(duì)菌種的堿基修飾類型進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)該基因組的編碼區(qū)及非編碼RNA結(jié)構(gòu)、串聯(lián)重復(fù)序列、微衛(wèi)星 DNA序列、CRISPR結(jié)構(gòu)組件,最后對(duì)預(yù)測(cè)的編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的功能注釋.利用軟件得到有效數(shù)據(jù)后,統(tǒng)計(jì)其中的數(shù)量、數(shù)據(jù)產(chǎn)量、序列的平均長(zhǎng)度等參數(shù),見(jiàn)表1.

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Sequencing data of WYT

通過(guò)基因預(yù)測(cè)、重復(fù)序列預(yù)測(cè)、非編碼 RNA預(yù)測(cè)等方法,可獲取測(cè)序基因組的組成情況,見(jiàn)表2.

由表 2可知,基于測(cè)序數(shù)據(jù)組裝得到基因組的大小為6.94Mb,GC含量65.86%.基因組組分分析后發(fā)現(xiàn),基因組含有6357個(gè)基因,總長(zhǎng)度為6190347bp,平均長(zhǎng)度 974bp,占基因組全長(zhǎng)的 89.19%.簡(jiǎn)單重復(fù)序列共 59個(gè),總長(zhǎng)為 11017bp,占基因組全長(zhǎng)的0.16%.tRNA 67個(gè),rRNA 12個(gè),其他ncRNA 126個(gè).對(duì)預(yù)測(cè)出的基因蛋白序列,通過(guò) blastp與 GO、KEGG、Swiss-Prot、NR、COG等通用的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋.

表2 基因組組分分析Table 2 Genomic component analysis

2.2 疑似目的基因的查找與確定

在通用的數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的基因注釋,分析菌株WYT降解VB4的代謝途徑可以確定,該催化過(guò)程為氧化還原反應(yīng),結(jié)合前人已經(jīng)報(bào)道的脫色酶及其特異性底物[29],推測(cè)是在水解酶、單加氧酶或過(guò)氧化物酶的共同作用下,使蒽醌環(huán)開(kāi)環(huán)從而降解脫色,因此關(guān)注主要基因組中所有過(guò)氧化物酶的基因注釋.過(guò)氧化物酶是氧化還原酶的一種,且大多是血紅素過(guò)氧化物酶,其在生命合成以及污染物降解中發(fā)揮重要的作用[30].血紅素過(guò)氧化物酶可分為 3類:原核起源的過(guò)氧化物酶;真菌分泌的過(guò)氧化物酶;植物起源的過(guò)氧化物酶[31].近年來(lái),隨著數(shù)據(jù)的不斷更新,在 PeroxiBase數(shù)據(jù)庫(kù)中將血紅素過(guò)氧化物酶分為 5個(gè)家族,分別為:過(guò)氧化氫酶超家族、環(huán)氧酶超家族、鹵素過(guò)氧化物酶超家族、雙鐵色素過(guò)氧化物酶超家族以及染料過(guò)氧化物酶.DyP-type過(guò)氧化物酶最早是在真菌的水稻紋枯病菌(Thanatephorus cucumeris Dec1)中首次發(fā)現(xiàn)[32].

分析全基因數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),6個(gè)CDS區(qū)已經(jīng)注釋為過(guò)氧化酶基因序列,將這 6個(gè)片段與各類型的目的基因比對(duì),發(fā)現(xiàn)在CDS區(qū)中的1713643～1714542有900bp的疑似染料脫色相關(guān)基因,用 MEGA(7.0版)軟進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)其屬于染料過(guò)氧化物酶基因中的B型,命名為DyP,其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示.

圖1 DyP的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of DyP gene

2.3 菌株的抗生素抗性

抗生素抗性測(cè)試可以得出菌株對(duì)不同抗生素的耐藥性[33].在LB固體平板上測(cè)試8種常用抗生素的抗性,生長(zhǎng)狀態(tài)如圖2.

圖2 8種抗生素抗性測(cè)試Fig.2 Resistance test of 8antibiotic

由圖2可知,菌株與多粘菌素、四環(huán)素、慶大霉素等沒(méi)有抗性.在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需多次使用LB進(jìn)行活化培養(yǎng),且菌株在不同培養(yǎng)條件下抗性程度存在差異,因此需驗(yàn)證菌株在 LB液體中的生長(zhǎng)情況,結(jié)果表明,WYT菌株對(duì)GM和Tc抗生素不具抗性,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用GM和Tc抗生素進(jìn)行突變株的篩選實(shí)驗(yàn).

2.4 DyP基因敲除

本研究利用高保真酶,從菌株中擴(kuò)增待敲除基因(DyP)的上下同源臂,并在 pBBR1McS5中擴(kuò)增GM 的抗性基因,其中上下游同源臂各 1000bp,GM為 900bp左右,對(duì)其進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果如圖3.

圖3 凝膠電泳圖及構(gòu)建的PEX18TcSacB-GM載體Fig.3 Gel-electrophoresis diagram and constructed PEX18TCSACB-GM vector

由圖3中a可知,由于擴(kuò)增條帶中存在較多雜質(zhì),需要割膠純化,將3個(gè)片段與線性化的PEX18Tc連接,隨后擴(kuò)增,結(jié)果如圖3中b,待敲除基因(DyP)的上下同源臂和 GM 抗性基因擴(kuò)增成功.測(cè)序驗(yàn)證堿基無(wú)突變,構(gòu)載成功.

載體構(gòu)建成功后,利用同源重組法對(duì)目的基因進(jìn)行敲除.通過(guò)同源重組法對(duì)目的基因進(jìn)行敲除是一種經(jīng)典的基因編輯技術(shù),在動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌等各類生物的遺傳操作研究中被廣泛應(yīng)用[34].林丹楓等[35]以自殺型質(zhì)粒 pSVP202為載體,成功敲除類球紅細(xì)菌的八氫番茄素合成基因.韓武洋等[36]利用自殺載體 pKB18mobsacB,采用無(wú)抗性標(biāo)記的同源重組法,成功敲除了野生型菌株谷氨酸棒桿菌中關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因.圖4(a)為將所構(gòu)的PEX18TcSacB-GM質(zhì)粒導(dǎo)入到 DH5α中,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高,隔夜可明顯的觀察到單克隆.然后將測(cè)序正確的樣品提質(zhì)粒,導(dǎo)入到自殺質(zhì)粒 WM3064中,凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果圖 4(b)所示.WYT菌株與構(gòu)建的敲除載體發(fā)生了雙交換,凝膠電泳如圖 4(f)所示,測(cè)序驗(yàn)證正確,敲除成功.第 3個(gè)樣品為用擴(kuò)增 DyP基因序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增,并沒(méi)有條帶,再次驗(yàn)證敲除成功.敲除的一段DyP基因組所在的基因簇如圖4(e)所示.

圖4 同源重組法進(jìn)行基因敲除Fig.4 Homologous recombination was used for gene knockout

將敲除成功的 WYT△DyP轉(zhuǎn)接至降解脫色培養(yǎng)液中進(jìn)行表型驗(yàn)證,具體結(jié)果如圖5所示.

由圖5可知,在24h后,在敲除株的作用下VB4濃度從50mg/L下降到34.24mg/L.對(duì)比前期的研究發(fā)現(xiàn),加熱致死菌體在24h后的濃度為39.753mg/L,所以推測(cè)敲除株WYT△DyP幾乎失去了降解VB4染料的功能.在野生株WYT降解脫色VB4染料的實(shí)驗(yàn)組中,24h后染料的濃度僅為 1.65mg/L,脫色率率達(dá) 96.7%,野生株 WYT可高效降解 VB4,敲除株WYT△DyP失去了降解VB4染料的功能.可見(jiàn)DyP基因是降解脫色VB4染料的關(guān)鍵基因.

圖5 WYT△DyP表型驗(yàn)證Fig.5 Phenotype verification of WYT△DyP

2.5 DyP基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

將敲除的關(guān)鍵基因回補(bǔ),驗(yàn)證基因敲除是否成功.從WYT菌株基因組中擴(kuò)增 DyP基因序列,跑凝膠電泳圖并測(cè)序,結(jié)果如圖6.

圖6 基因回補(bǔ)Fig.6 Genes to cover

由圖6a可知,回補(bǔ)質(zhì)粒并未發(fā)生突變,跑膠條帶大小為1000bp左右.隨后用無(wú)縫克隆進(jìn)行連接后導(dǎo)入E.coli.DH5α中,驗(yàn)證是否連接成功,凝膠電泳結(jié)果如圖6b示,跑膠條帶大小均為1000～2000bp,測(cè)序后與模擬序列對(duì)比,無(wú)突變點(diǎn),提質(zhì)粒導(dǎo)入 E.coli.WM3064并構(gòu)建載體.

載體構(gòu)建成功后,將 WYT ΔDyP與 E.coli.pRK415-DyP以1:2的菌體量滴在含有0.3mmol/L DAP 的 LB平板上(圖 7a),直到菌落周?chē)忻黠@的暈圈(圖 7b).由于結(jié)合的效率較低,所以在結(jié)合篩選時(shí),LB 平板中添加較高濃度的 Tc(50μg/mL)進(jìn)行篩選,3d后長(zhǎng)出明顯的單克隆(7c).挑取結(jié)合成功的單克隆,并進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證(圖 7d)后測(cè)序無(wú)突變點(diǎn),獲得了WYTΔDyP::DyP回補(bǔ)株.

圖7 WYT△DyP::DyP回補(bǔ)株Fig.7 WYTΔDyP::DyP complementary strain

2.6 野生株、敲除株、回補(bǔ)株表型驗(yàn)證

VB4的降解脫色是由于蒽醌基團(tuán)的開(kāi)環(huán),導(dǎo)致發(fā)色基團(tuán)裂解.在相同條件下測(cè)試野生株、敲除株及回補(bǔ)株對(duì) VB4染料的降解效果,記錄菌株降解過(guò)程VB4濃度的變化,得到菌株的脫色率,如圖8所示.

圖8 野生菌株WYT、突變株WYT△DyP及回補(bǔ)株WYT△DyP::DyP對(duì)VB4的脫色率Fig.8 Growth and degradation curves of VB4 by DyP strains WYT△DyP and WYT△DyP

由圖8可知,敲除株24h后對(duì)VB4的脫色率為22.17%,而在前期實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)活細(xì)胞和加熱至死細(xì)胞對(duì)VB降解研究中對(duì)比發(fā)現(xiàn),加熱致死菌24h后染料脫色率為20.49%,與敲除株相似,推測(cè)敲除株的少量脫色效果是由菌體的生物吸附引起的.Walker等[37]將菌株Bacillus gordonae,Bacillus benzeovorans和Pseudomonas putida在110℃高溫下加熱15min,測(cè)試對(duì)酸性藍(lán)277的脫色性能,結(jié)果3株菌分別可去除 13%、19%和 18%的染料.基因回補(bǔ)后,回補(bǔ)株的脫色率為96%,與野生株相近,基因回補(bǔ)成功.

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)全基因組測(cè)序分析推測(cè)了關(guān)鍵基因,WYT菌株的關(guān)鍵基因?qū)儆谌玖线^(guò)氧化物酶基因中的B型.

3.2 通過(guò)基因敲除和回補(bǔ)驗(yàn)證推測(cè)的基因是 VB4降解脫色的關(guān)鍵基因.

3.3 測(cè)試野生株、敲除株、回補(bǔ)株降解VB染料的效果,發(fā)現(xiàn)敲除株幾乎失去降解染料的功能,而回補(bǔ)株恢復(fù)了降解能力.因此,DyP基因是VB4降解脫色的關(guān)鍵基因.

致謝：感謝論文完成過(guò)程中給予我意見(jiàn)的安鳳秋老師和李海紅老師,同時(shí)感謝課題組的同學(xué),謝謝你們！