全反式維甲酸暴露對(duì)斑馬魚的神經(jīng)毒性效應(yīng)

楊玉瑩，李平燈，金英偉，丁 強(qiáng)，戶業(yè)麗

1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢430205；2.宜昌三峽制藥有限公司，湖北 宜昌 443004

全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，atRA）是膳食維生素A的代謝衍生物，又名維甲酸、維A甲酸等［1］。atRA作為哺乳動(dòng)物中的內(nèi)源性維生素A活性代謝物，它是脊椎動(dòng)物發(fā)育必不可少的形態(tài)形成因子，能夠調(diào)節(jié)身體軸的形成和許多器官系統(tǒng)的發(fā)育［2］。由于atRA對(duì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)分化以及免疫調(diào)節(jié)作用，被廣泛應(yīng)用于包括急性早幼粒白血病等各種血液惡性疾病的治療中［3-4］。此外，atRA可以抑制角化過程，減少皮膚溢脂，具有抗炎殺菌作用，是臨床上治療痤瘡、銀屑病、魚鱗病等皮膚角質(zhì)化異常等疾病的首選藥物［5-6］。同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)，過量atRA對(duì)人體具有較大的副作用，主要包括肝臟毒性［7］、發(fā)育毒性［8］、生殖毒性［9］等。Borracci P和Coluccia A研究指出成年大鼠孕期暴露atRA會(huì)造成后代長(zhǎng)期的認(rèn)知障礙［10-11］，提示人類孕期應(yīng)遠(yuǎn)離atRA。atRA作為過量使用的藥物，無疑會(huì)造成水生環(huán)境的污染，通過長(zhǎng)期接觸可能進(jìn)入體內(nèi)并進(jìn)而影響人類和野生動(dòng)物的健康。

目前，關(guān)于atRA的神經(jīng)發(fā)育毒性機(jī)制僅在人胚胎干細(xì)胞與大鼠中進(jìn)行了初步研究［8，10-11］，atRA在水生動(dòng)物中的神經(jīng)毒性研究鮮見報(bào)道。相較于哺乳類動(dòng)物，斑馬魚繁殖力高、胚胎發(fā)育快速且特征明確，與人類大腦組織區(qū)域具有高度相似性，具有豐富的社會(huì)學(xué)行為，是毒理學(xué)中研究神經(jīng)毒性的良好體外動(dòng)物模型［12-13］。因此，本研究以斑馬魚為水生動(dòng)物模型，探討atRA暴露對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的神經(jīng)毒性和相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

atRA，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），甲基纖維素（methyl cellulose），多聚甲醛（美國(guó)Sigma公司）；乙醇，氯仿，異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR-GREEN熒光染料，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（TMG3000，武漢漢科實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司），斑馬魚行為分析儀（DanioVison，瑞士Noldus公司），體視顯微鏡（Stereo，德國(guó)ZEISS公司），光學(xué)顯微鏡（S22-ST，日本Olympus公司），純水儀（Milli-Q Advantage A10，法國(guó)Merck Millipore公司），恒溫培養(yǎng)箱（Blue pard，上海一恒科技公司），萊卡熒光倒置顯微鏡（Leica Application Suite，美國(guó)Leica公司），熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（CFXconnec，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚為AB系野生魚及轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg［mbp（myelin basic protein）：EGFP］，均購(gòu)買于國(guó)家斑馬魚資源中心中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。飼養(yǎng)條件如下：光照周期14 h（光）/10 h（暗）（電腦自動(dòng)控制），水溫（28±0.5）℃，水體溶氧6 mg/L，水中含鹽0.25%。實(shí)驗(yàn)前一晚，將成年的斑馬魚按照雌魚和雄魚2∶2（個(gè)體數(shù)目比）的比例放置于產(chǎn)卵缸內(nèi)，次日清晨完成交配和產(chǎn)卵，挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎用于藥物暴露實(shí)驗(yàn)。

1.3 斑馬魚胚胎暴露實(shí)驗(yàn)

將atRA溶解于DMSO中，配置成1 mol/L的母液，4℃避光保存，待用。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4個(gè)atRA濃度梯度：對(duì)照（0 nmol/L，DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%），5，10和20 nmol/L，暴露液現(xiàn)配現(xiàn)用。取已受精1 h（hour post fertilization，1 hpf）的斑馬魚胚胎置于恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行暴露，6孔板每孔含30枚胚胎，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，每24 h更換暴露液。

1.4 胚胎自發(fā)運(yùn)動(dòng)測(cè)定

從不同濃度暴露組中挑選15枚發(fā)育至24 hpf的斑馬魚胚胎，于顯微鏡下視頻記錄斑馬魚胚胎的自發(fā)胎動(dòng)情況，每次1 min，重復(fù)觀察3次，使用DanioScope軟件統(tǒng)計(jì)單位時(shí)間內(nèi)胚胎的活躍度。采用單位時(shí)間內(nèi)胚胎運(yùn)動(dòng)時(shí)間占總測(cè)量時(shí)間的百分比作為活躍度的分析指標(biāo)，以自發(fā)運(yùn)動(dòng)活力百分比表示。

1.5 幼魚運(yùn)動(dòng)行為測(cè)定分析

經(jīng)atRA暴露后，每組隨機(jī)取出12條發(fā)育至120 hpf的斑馬魚幼魚進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為分析測(cè)定。將選取的幼魚置于24孔板內(nèi)，每孔1尾幼魚。完成準(zhǔn)備工作后，將24孔板置于斑馬魚行為分析儀，給予光照刺激。刺激條件：5 min光照/5 min黑暗循環(huán)，測(cè)試3個(gè)循環(huán)，共30 min。各組斑馬魚平均運(yùn)動(dòng)速率以及總移動(dòng)距離由斑馬魚行為分析儀的Ethovision軟件統(tǒng)計(jì)并計(jì)算。

1.6 轉(zhuǎn)基因斑馬魚形態(tài)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（mbp：EGFP），轉(zhuǎn)基因斑馬魚的髓鞘被標(biāo)記綠色熒光蛋白，可用于研究斑馬魚神經(jīng)組織特異性。取不同濃度組發(fā)育至72 hpf的轉(zhuǎn)基因魚Tg（mbp：EGFP），通過萊卡熒光顯微鏡，采用單熒光通道（綠色熒光激發(fā)）觀察并拍攝轉(zhuǎn)基因斑馬魚的形態(tài)變化，評(píng)估atRA不同暴露濃度對(duì)斑馬魚神經(jīng)組織的毒性作用（評(píng)價(jià)指標(biāo)：大腦及脊椎熒光強(qiáng)度）。

1.7 總RNA提取

斑馬魚胚胎暴露至72 hpf時(shí)，不同濃度組各取30條幼魚于1.5 mL EP管內(nèi)，吸干水分，使用高通量組織研磨器破碎研磨斑馬魚。隨后，按照總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒操作說明提取總RNA。利用NanoDrop 2000測(cè)定提取RNA的純度（A280/A260值1.8～2.0）和濃度，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［revertaid first strand cdna（complementary deoxyribonucleic acid）synthesis kit］逆轉(zhuǎn)錄RNA，獲得cDNA，?20℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 qRT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)

使 用SYBRTM Select Master Mix（Thermo Fisher Scientific，USA）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）。熒光定量PCR總反應(yīng)體系10.0μL：上下游引物各0.8μL，cDNA模板1.0μL，SYBR GREEN染料酶5.0μL，無菌水2.4μL。PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s；55℃退火10 s；72℃延伸20 s（循環(huán)40次）。以擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（cycle threshold，CT）值表示達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)，β-actin為內(nèi)參，利用2-ΔΔT來計(jì)算mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)變化。

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)使用的引物序列如表1所示。

表1 qPCR的引物序列Tab.1 Primer sequence for qPCR

1.9 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0（SPSS Company，Chicago，IL，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并在Graphpad Prism 7（Graphpad Software，La Jolla，CA，USA）軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。顯著性差異由單因素方差分析法（One way-ANOVA）計(jì)算，其中*p＜0.05代表有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 atRA暴露對(duì)胚胎自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響

斑馬魚自主胎動(dòng)是胚胎尾部的自主擺動(dòng)，不受大腦神經(jīng)元的控制，是能夠檢測(cè)到的最早神經(jīng)行為［14］，常常被作為評(píng)估斑馬魚早期神經(jīng)發(fā)育毒性的指標(biāo)之一。對(duì)照組及不同atRA濃度暴露24 hpf斑馬魚胚胎的自發(fā)運(yùn)動(dòng)活力測(cè)定結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比，atRA暴露可顯著抑制斑馬魚早期自發(fā)的神經(jīng)活動(dòng)，且具有濃度依賴性，當(dāng)暴露濃度在10和20 nmol/L時(shí)，自發(fā)運(yùn)動(dòng)活力百分比相對(duì)于對(duì)照組分別下降25.6%和50.8%（p＜0.05）。這提示atRA對(duì)斑馬魚幼魚具有神經(jīng)毒性，可通過影響斑馬魚脊柱區(qū)域的一些神經(jīng)細(xì)胞，從而改變斑馬魚胚胎的自主胎動(dòng)行為。

圖1 不同濃度atRA暴露對(duì)胚胎自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響：（a）胚胎自發(fā)運(yùn)動(dòng)，（b）胚胎自發(fā)運(yùn)動(dòng)活力百分比Fig.1 Effects of exposure to ATRA with different concentrations on embryo spontaneous movement：（a）embryo spontaneous movement，（b）percentage of embryo spontaneous movement

2.2 atRA暴露對(duì)幼魚運(yùn)動(dòng)行為的影響

在30 min檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，120 hpf的幼魚在不同濃度暴露組以及不同光暗周期的運(yùn)動(dòng)活力如圖2所示。結(jié)果顯示幼魚對(duì)光暗轉(zhuǎn)換的刺激較為敏感，表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)活力交替上升和下降。在明亮期，20 nmol/L組斑馬魚幼魚的游動(dòng)速率為0.5 mm/s，對(duì)照組為1.3 mm/s；在黑暗期，20 nmol/L組斑馬魚幼魚的游動(dòng)速率為0.6 mm/s，對(duì)照組為1.5 mm/s。且幼魚游動(dòng)速度在暗環(huán)境下降趨勢(shì)表現(xiàn)得更加明顯，表明幼魚對(duì)暗刺激反應(yīng)更為強(qiáng)烈；而在同一光暗周期內(nèi)，其運(yùn)動(dòng)活力隨著atRA暴露濃度的增加出現(xiàn)明顯下降，且降低程度具有一定的濃度依賴性。低濃度暴露劑量對(duì)斑馬魚的運(yùn)動(dòng)速率影響較低，無論是光環(huán)境還是暗環(huán)境，其運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)速率變化均不明顯；而隨著atRA暴露濃度的升高，幼魚平均運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)速度均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)閍tRA的暴露造成了斑馬魚幼魚神經(jīng)組織受損，引發(fā)神經(jīng)肌肉協(xié)調(diào)性的中斷，從而造成幼魚行為異常且反應(yīng)遲鈍。

圖2 不同濃度atRA暴露對(duì)幼魚運(yùn)動(dòng)行為的影響：（a）幼魚的運(yùn)動(dòng)軌跡，（b）幼魚游動(dòng)距離的變化，（c）幼魚游動(dòng)平均速度的變化Fig.2 Effects of exposure to atRA at different concentrations on motor behavior of larval fish：（a）movement trajectory of larval fish，（b）variation of swimming distance of larval fish，and（c）variation of average swimming speed of larval fish

2.3 atRA暴露誘導(dǎo)斑馬胚胎神經(jīng)毒性

MBP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘中的主要蛋白，具有神經(jīng)組織特異性［15］，熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因魚Tg（mbp：EGFP）神經(jīng)元可以直接觀測(cè)斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況。在atRA（20 nmol/L）暴露至72 hpf，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（mbp：EGFP）胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育狀況如圖3所示。結(jié)果顯示，斑馬魚神經(jīng)發(fā)育出現(xiàn)明顯異常，主要表現(xiàn)為腦部神經(jīng)中樞的形態(tài)缺陷和結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度的顯著減少。整體熒光強(qiáng)度定量結(jié)果顯示，20 nmol/L atRA暴露組胚胎的總熒光強(qiáng)度相對(duì)對(duì)照組下降38.7%，表明mbp蛋白表達(dá)減少，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了atRA可以導(dǎo)致斑馬魚神經(jīng)發(fā)育畸形。

圖3 atRA暴露對(duì)斑馬魚胚胎具有神經(jīng)發(fā)育毒性：（a）斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育畸形，（b）mbp熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度Fig.3 Neurodevelopmental toxicity of exposure to atRA over zebrafish embryos：（a）neurodevelopmental malformations in zebrafish embryos，（b）expression intensity of mbp fluorescent protein

2.4 atRA對(duì)斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

有研究［16-17］報(bào)道，有毒化合物通過抑制斑馬魚神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因mbp和突觸蛋白基因syn2a的表達(dá)來誘導(dǎo)神經(jīng)毒性。本研究利用熒光PCR儀測(cè)定了mbp與syn2a基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示，syn2a的表達(dá)量在高濃度（20 nmol/L）暴露組中出現(xiàn)明顯下調(diào)，僅為對(duì)照組的41.2%；mbp的表達(dá)也明顯受到了atRA的抑制，為對(duì)照組的54.6%，這與atRA暴露mbp標(biāo)記熒光蛋白轉(zhuǎn)基因斑馬魚的總體熒光強(qiáng)度變化是一致的。揭示atRA可能通過調(diào)節(jié)這些神經(jīng)基因的表達(dá)，從而影響斑馬魚的運(yùn)動(dòng)，誘導(dǎo)了神經(jīng)毒性。

圖4 atRA暴露對(duì)斑馬魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of exposure to atRA on expression of neurodevelopmental genes in zebrafish

3 結(jié) 論

atRA暴露斑馬魚胚胎后，能顯著抑制斑馬魚胚胎自主運(yùn)動(dòng)、幼魚游動(dòng)的總運(yùn)動(dòng)距離和平均運(yùn)動(dòng)速度，并且在分子水平上抑制神經(jīng)相關(guān)基因mbp與syn2a的表達(dá)，從而干擾斑馬魚胚胎早期的神經(jīng)發(fā)育及行為活力，具有典型的神經(jīng)毒性，更深入的內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究可為atRA在水生動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供有價(jià)值的理論依據(jù)，并為atRA臨床使用的劑量及安全性提供一定的參考作用。