RNF181與Hippo/YAP對腦膠質瘤SHG44細胞惡性程度的影響及其可能機制

裴美娟，孫中磊，黃生炫，劉英富，李學文

腦膠質瘤是一種高侵襲性的中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤，與其他神經系統(tǒng)腫瘤相比，腦膠質瘤有更高的轉移趨勢，整體預后較差及生存率較低[1,2]。目前，腦膠質瘤缺乏合適的治療靶點，因此，臨床迫切需要發(fā)現(xiàn)腦膠質瘤的致癌機制和新型靶向療法。近年來，越來越多的證據(jù)表明，Hippo/YAP信號通路在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育和腦腫瘤中有重要作用[3]，耗竭YAP或藥物抑制YAP可能導致細胞死亡和細胞生長抑制[4]。有研究表明，RNF181可以穩(wěn)定YAP蛋白并抑制K48連接的多聚泛素化，從而導致乳腺癌的進展[5]。RNF181作為E3泛素連接酶可以抑制抗原受體信號轉導到CARD11下游NF-κB信號通路負調控淋巴瘤細胞生存[6]，但關于RNF181在腦膠質瘤中的功能報道較少。本研究通過探究RNF181與Hippo/YAP對膠質瘤細胞惡性度的影響及其可能機制，旨在為臨床診治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質瘤細胞系SHG-44(上海中科院細胞庫)，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶(美國Gibco公司)，過表達RNF181mRNA腺病毒表達載體AAVrh.10 RNF181與無表達基因腺病毒衣殼AAVrh.10 Negative(濟南思科生物科技有限公司)，RNF181、YAP(美國abcam公司)，MTT、Trizol及去RNA酶試劑(美國Cayman Chemical公司)，RT-PCR引物(賽默飛世爾科技中國有限公司)。Tranwell小室、細胞培養(yǎng)板及計數(shù)板(美國康寧公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞與分組 SHG-44細胞在DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，分為3組：對照組(Control組)、陰性對照組(Negative組)和RNF181過表達組(RNF181組)。Negative組和RNF181組SHG-44細胞分別加入等滴度純化的腺病毒表達載體AAVrh.10 Negative、AAVrh.10 RNF181，Control組加入等體積PBS，共培養(yǎng)12 h。根據(jù)細胞的密度進行換液或者傳代。每次傳代時，加入2.5 μg/ml嘌呤霉素繼續(xù)篩選穩(wěn)定的細胞株，每隔1 d于熒光顯微鏡觀察細胞GFP熒光強度，直至熒光強度無明顯變化，無死亡漂浮的細胞。將一部分細胞用于后續(xù)實驗，其余冷凍保存。

1.2.2 RT-qPCR實驗 使用Trizol試劑盒提取細胞內總RNA，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA鏈，利用Real-timePCR試劑盒檢測細胞內各蛋白mNRA的表達，GAPDH作為內參。引物序列如表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.2.3 MTT試驗 取細胞懸液100 μl在有完全培養(yǎng)液的96孔板中培養(yǎng)至 2×105/孔(37 ℃、5%CO2)。用20 μl的MTT處理后，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加150 μl DMSO終止反應，用酶標儀測定各孔在490 nm 處的吸光值。

1.2.4 Transwell實驗 利用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸各組細胞至1×104/ml，取200 μl加入Transwell小室中，并將盛有細胞懸液的Transwell小室置于含有培養(yǎng)液的實驗孔中培養(yǎng)24 h；取出后，PBS清洗，用棉簽擦去小室結晶紫染色薄膜下層細胞后，置于顯微鏡下計數(shù)拍照。

1.2.5 Western blot檢測 轉染72 h后，取各組細胞破碎提取蛋白質。常規(guī)電泳分離蛋白后轉膜。10%脫脂奶粉4 ℃封閉1 h，然后在含一抗的10%脫脂奶粉的TBST緩沖液過夜： RNF181(1∶1000)、Hippo(1∶1000)、YAP(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)。二抗孵育后ECL plus檢測信號，Image J軟件定量分析。

1.2.6 免疫熒光檢測 將細胞接種到培養(yǎng)玻片上，用4%多聚甲醛固定，并用0.1%Triton X-100透化。封閉后按照常規(guī)方法進行染色，將細胞與一抗GFAP(1∶2000)、RNF181(1∶2000)和抗YAP(1∶2000)抗體孵育，其中熒光共定位檢測RNF181與YAP抗體同時加入樣本，然后與二抗孵育，通過用DAPI染色細胞核。熒光顯微鏡掃描后Image J軟件用于定量分析。

2 結 果

2.1 RT-qPCR實驗結果 (1)轉染后SHG-44膠質瘤細胞過表達RNF181：與對照組和Negative組相比，膠質瘤細胞系SHG-44中RNF181 mRNA及蛋白表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05，表2)。(2)RNF181過表達促進Hippo/YAP表達：與對照組和Negative組相比，RNF181過表達組YAP mRNA及蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 SHG44細胞3組實驗結果比較

2.2 RNF181過表達促進SHG-44細胞增殖、遷移和侵襲 實驗72 h MTT實驗結果顯示， 與對照組和Negative組細胞增殖率相比，RNF181過表達組細胞增殖率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫熒光結果顯示，與對照組和Negative組細胞數(shù)相比，RNF181過表達組細胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1，表3)。Transwell實驗結果顯示，與對照組和Negative組穿膜細胞數(shù)相比，RNF181過表達組的SHG-44穿膜細胞數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2，表3)。

表3 3組RNF181過表達促進SHG-44細胞增殖、遷移和侵襲結果比較

圖1 SHG-44細胞免疫熒光(×200)

圖2 SHG-44細胞transwell(×200)

2.3 RNF181與YAP蛋白共表達 免疫熒光共定位染色顯示，SHG-44細胞中YAP和RNF181共定位于細胞核內(圖3)。

圖3 RNF181與YAP蛋白共表達(×200)

3 討 論

腦膠質瘤是最危及生命的原發(fā)性腦腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個涉及抑癌基因和致癌基因間平衡的多步驟過程，受到多基因的調控[7]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，RNF181過表達能顯著提高Hippo/YAP信號的表達，提高SHG-44的增殖能力與惡性度。與既往研究一致，YAP在人腦膠質瘤中表達上調，與患者預后惡化相關[8]。并且，通過免疫熒光共定位實驗，本研究還發(fā)現(xiàn)RNF181與YAP共表達于細胞核中。因此，本研究推測RNF181過表達可能是腦膠質瘤Hippo/YAP信號激活的啟動機制，RNF181可能作為腦膠質瘤治療和診斷的新靶點。

Hippo信號通路從黑腹果蠅到哺乳動物高度保守，在器官大小控制、組織再生和腫瘤抑制等方面發(fā)揮重要作用，YAP是一種重要的轉錄共激活因子，受Hippo信號通路負調控[9]。Hippo信號通路也受到各種上游調控因子的調控，如細胞極性、黏附蛋白和其他信號通路(Wnt/β-catenin、Notch和MAPK通路)[8]。大量研究表明，Hippo/YAP信號對有些腫瘤有重要的致癌作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，YAP表達提高后SHG-44的增殖和侵襲能力明顯增強。還有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中YAP被激活可能導致肝癌和肺癌[11]。此外，YAP被證明可介導幾種與癌癥相關的表型，包括遷移、侵襲、抗凋亡和上皮-間質轉化(EMT)[12]。并且近年來，越來越多的證據(jù)表明，Hippo/YAP信號通路在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育和腦腫瘤(包括膠質瘤)中發(fā)揮著重要作用[10]。因此，本研究結果提示YAP在膠質瘤細胞中至關重要，針對膠質瘤細胞的YAP靶點可能是一個很有前途的方向。

RNF181屬于RING家族E3連接酶家族，而RING域負責E3連接功能，多種生理功能需要RNF181。 有研究發(fā)現(xiàn)，RNF181在幾種人類惡性腫瘤中升高，RNF181可以與CARD11相互作用，并促進淋巴瘤細胞中的NF-κB信號傳導[13]。此外，RNF181被證明可以促進結腸癌的生存能力和血管生成[14]。本研究證明了在膠質瘤細胞內過表達RNF181促進YAP蛋白表達，然而抑制RNF181 對YAP蛋白及膠質瘤細胞的作用仍不清楚，能否應用于腦膠質瘤臨床治療還有待研究。

綜上所述，本研究結果表明，RNF181可以通過非蛋白水解的方式穩(wěn)定YAP蛋白，促進Hippo/YAP信號傳導，促進膠質瘤中的細胞增殖和遷移，這可能為泛素修飾在YAP蛋白和 Hippo信號傳導中的作用提供新見解，為腦膠質瘤的臨床治療提供新的方向。