梅奇酵母轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化

史榮超,劉灑灑,侯陽陽,張夢(mèng)瑤,龔佳,江曉楠,楊曉兵

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌,712100)

2-苯乙醇(2-phenylethanol,2PE)是一種廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域的芳香醇,全球年產(chǎn)量約1萬t[1],也可用于調(diào)配草莓、焦糖、蜜香、奶油等類型的食用香精(GB 2760—2014)[2]。目前,天然提取和化學(xué)合成是生產(chǎn)2PE的主要方式。玫瑰、矮牽牛、番茄、茉莉等植物精油是天然原料[3-5],但易受地域和氣候的影響,2PE含量低,導(dǎo)致天然2PE價(jià)格昂貴(1 000 USD/kg)[1]。苯-環(huán)氧乙烷法和氧化苯乙烯加氫法是化學(xué)合成2PE主要方式,其反應(yīng)條件苛刻,產(chǎn)品存在有毒殘留[6-7]。微生物合成具有低碳環(huán)保、不受地域和氣候影響、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì),是天然提取和化學(xué)合成的有效替代策略。2PE微生物合成按底物不同分為從頭合成和非從頭合成。從頭合成途徑廣泛存在于微生物中,其底物為簡(jiǎn)單碳源(如葡萄糖等),但路徑長(zhǎng)、支路多,存在多種抑制作用,2PE產(chǎn)量較低[8]。非從頭合成(主要指艾氏途徑)的底物主要是L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe),因在微生物中轉(zhuǎn)化效率高而被廣泛開發(fā)利用[3]。

許多微生物具有合成2PE的能力,如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、梅奇酵母屬(Metschnikowiasp.)、肉桂內(nèi)生菌屬(Sphingomonassp.)等[9-14]。美極梅奇酵母(Metsc-hnikowiapulcherrima)在高糖(>200 g/L)[15]、高酸(pH 3～4)條件下生長(zhǎng)旺盛[16],能夠合成普切明酸[17]、2PE[16]等多種化合物,也可作為生物防控劑用于果蔬采收后的雜菌防控[18],同時(shí)也可在開放、非滅菌條件下生產(chǎn)微生物油脂[19]。M.pulcherrima利用天然葡萄汁僅可產(chǎn)生0.25 g/L的2PE[20]。對(duì)于Metschnikowiasp.轉(zhuǎn)化L-Phe合成2PE而言,已報(bào)道的轉(zhuǎn)化效率通常較低。CHANTASUBAN等[16]利用M.pulcherrimaNCYC 373在單水相發(fā)酵條件下合成的2PE為1.71 g/L(L-Phe 30 g/L),但摩爾得率僅0.08。CHREPTOWICZ等[21]利用梅奇酵母合成的2PE為2.3～2.71 g/L(L-Phe 5 g/L),摩爾得率為0.62～0.73。為提高2PE合成效率,本研究通過篩選高產(chǎn)2PE的梅奇酵母菌株,調(diào)整培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件(碳源、溫度和pH等)探究梅奇酵母在非滅菌(工業(yè)上滅菌通常伴隨著高能耗和高成本)、補(bǔ)充碳源條件下高效轉(zhuǎn)化L-Phe合成2PE。研究將為梅奇酵母高效轉(zhuǎn)化L-Phe合成2PE的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

美極梅奇酵母(M.pulcherrima)CICC 1467、桔梅奇酵母(M.citriensis)CICC 33213、梅奇酵母屬(Metschnikowiasp.)CICC 33020、美極梅奇酵母(M.pulcherrima)CICC 32343,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。所用菌株均采用YPD固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng),培養(yǎng)條件為28 ℃,48 h。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑

固體YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,瓊脂粉20,自然pH值,121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：大量成分(g/L),葡萄糖26、L-Phe 20；微量成分(μg/L),維生素H2,泛酸鈣400,葉酸2,肌醇2000,煙酸400,對(duì)氨基苯甲酸200,鹽酸吡哆醇400,核黃素200,鹽酸硫胺素400,H3BO3500,CuSO440,KI 100,FeCl3200,MnSO4400,MoNa2O4200,ZnSO4400,KH2PO41 000,MgSO4500,NaCl 100,CaCl2100,pH 4.0。0.22 μm水系濾膜過濾。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,自然pH值,121 ℃滅菌20 min。

主要試劑：L-苯丙氨酸(純度98.5%)、2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%)、棕櫚酸異丙酯(純度97.0%),上海麥克林生化科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF,純度≥99.5%),天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB,純度98.0%),上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ZQZY-85CS振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司；GC9790Ⅱ氣相色譜儀,浙江福立分析儀器股份有限公司；LC—2030 PLUS高效液相色譜儀,日本島津制作所；EVOLUTION 220紫外可見分光光度計(jì),賽默飛世爾科技有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所；FE28 pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高產(chǎn)2PE菌株的篩選

將CICC 1467、CICC 32343、CICC 33213、CICC 33020在YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),28 ℃活化30 h。挑取3個(gè)大小一致的單菌落,分別接種到含有50 mL基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,20 ℃,180 r/min條件下發(fā)酵,定時(shí)取樣。

1.2.2 培養(yǎng)基成分、pH和發(fā)酵溫度對(duì)2PE合成的影響

將CICC 1467在YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),28 ℃活化30 h,挑取3個(gè)大小一致的單菌落,分別接種到含有50 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,20 ℃,180 r/min條件下發(fā)酵120 h。探究因素和水平,按以下順序進(jìn)行(無特殊說明,接種量均采用單菌落接種,溫度20 ℃,發(fā)酵時(shí)間120 h,pH 4.0)：

(1)L-Phe添加量(g/L)：0、4、8、12。

(2)碳源種類：葡萄糖、果糖、木糖、甘油(L-Phe 4 g/L)。

(3)葡萄糖添加量(g/L)：10、30、50、70、90、110(L-Phe 4 g/L)。

(4)初始pH：2.0、3.0、4.0、5.0、6.0(L-Phe 4 g/L,葡萄糖50 g/L)。

(5)發(fā)酵溫度(℃)：15、20、25、30(L-Phe 4 g/L,葡萄糖50 g/L,pH 3.0)。

1.2.3 接種量對(duì)2PE合成的影響

將CICC 1467在YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),28 ℃活化30 h。挑取1環(huán)單菌落至100 mL種子培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)26 h(OD600約10)。5 000×g離心5 min分離出菌體,用無菌水洗滌2次,接種到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。

將基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的葡萄糖、L-Phe和初始pH分別改為50、4 g/L和3.0以作為新的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。接種量分別為5%、10%、15%和20%(體積分?jǐn)?shù)),25 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵,定時(shí)取樣。

1.2.4 非除菌條件下發(fā)酵潛力的探究

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基同1.2.3。按5%接種量(體積分?jǐn)?shù))接種,25 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵44 h。培養(yǎng)基處理共3種：對(duì)照組為蒸餾水配制后過濾除菌,處理一為蒸餾水配制不除菌,處理二為自來水配制后過濾除菌,處理三為自來水配制后不除菌。

1.2.5 檢測(cè)分析

采用氣相色譜法測(cè)定2PE產(chǎn)量,發(fā)酵液于8 000×g離心3 min,取上清液,用等體積棕櫚酸異丙酯振蕩1 min,8 000×g離心3 min,取上清液,用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾。氣相檢測(cè)條件：KB-FFAP色譜柱(30 m×0.32 mm,0.25 mm)；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比：40∶1；進(jìn)樣器220 ℃；程序升溫條件：190 ℃保持6 min；20 ℃/min升至240 ℃,保持2 min；檢測(cè)器250 ℃；載氣為氮?dú)?柱前壓：0.07 MPa；氣體流量：空氣300 mL/min、氫氣30 mL/min。

采用反相高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)L-Phe殘留量,分別取300 μL發(fā)酵液,150 μL 10 g/L DNFB溶液,150 μL 0.5 mol/L NaHCO3溶液(5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.0)混合均勻,置于60 ℃水浴60 min(避光)[22]。用冰冷卻[23],恢復(fù)到室溫后,加入600 μL 0.01 mol/L KH2PO4溶液(5 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0),混合均勻后置于黑暗中15 min,0.22 μm濾膜過濾。色譜柱為Tnature C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),進(jìn)樣體積10 μL,柱溫26 ℃,流速0.8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm(紫外檢測(cè)器)；流動(dòng)相配制：A相為0.05 mol/L NaAc溶液(pH=6.45±0.05),稱取4.1015 g無水NaAc,溶解于950 mL超純水中,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.45,加10 mL DMF溶液,補(bǔ)水至1 L；B相為50%乙腈。洗脫程序如表1所示。

表1 利用反相高效液相色譜法檢測(cè)L-Phe的洗脫程序

葡萄糖測(cè)定：采用DNS法；菌體生物量：以O(shè)D600值表示;乙醇體積分?jǐn)?shù)采用SBA-40D生物傳感分析儀測(cè)定;pH采用pH計(jì)測(cè)定。

2PE摩爾得率通過公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：ρ1,2PE產(chǎn)量,g/L；M1,2PE相對(duì)分子質(zhì)量；ρ2,L-Phe添加量,g/L；M2,L-Phe相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析(ANOVA)檢查各個(gè)結(jié)果的顯著性差異,組間多重比較采用Duncan法,P<0.05,差異顯著。采用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 高產(chǎn)2PE菌株的篩選

菌株的2PE合成能力決定了整個(gè)轉(zhuǎn)化過程的生產(chǎn)效率。為獲得高產(chǎn)2PE菌株,本研究對(duì)4株梅奇酵母合成2PE的能力進(jìn)行了比較(圖1)。當(dāng)培養(yǎng)基中以L-Phe為唯一氮源時(shí),艾氏途徑才會(huì)占主要優(yōu)勢(shì)[24],故本研究采用以L-Phe為唯一氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。結(jié)果表明,4株酵母的生長(zhǎng)速率和2PE合成速率在前36 h均較慢,之后進(jìn)入快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物快速合成階段,2PE合成與酵母生長(zhǎng)呈正相關(guān),4株酵母的2PE產(chǎn)量均在120 h達(dá)最大值,此時(shí)葡萄糖幾乎耗盡(小于2 g/L)。4株酵母中,CICC 1467合成2PE的能力最強(qiáng),終產(chǎn)量達(dá)1.76 g/L,摩爾得率為0.12。CICC 33020、CICC 33213和CICC 32343的2PE最大產(chǎn)量分別為1.48、1.46和1.53 g/L,無顯著性差異(P>0.05)。因此,后續(xù)研究均采用CICC 1467進(jìn)行。

a-生物量；b-葡萄糖消耗；c-2PE產(chǎn)量

2.2 L-Phe添加量對(duì)2PE產(chǎn)量的影響

L-Phe是通過艾氏途徑合成2PE的底物,添加適量的L-Phe可促進(jìn)2PE的合成效率,提高底物利用率[25]。在初篩中,CICC 1467合成的2PE為1.76 g/L(L-Phe 20 g/L),摩爾得率僅為理論值的12%。故本研究比較了L-Phe添加量對(duì)2PE合成的影響,為構(gòu)建2PE的高效轉(zhuǎn)化體系提供參考。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)L-Phe在0～12 g/L時(shí),隨著L-Phe添加量的增加,生物量先增加后減少,2PE產(chǎn)量同樣先增加后減少(圖2)。L-Phe為4 g/L時(shí),OD600達(dá)最大值19.45,相應(yīng)2PE產(chǎn)量為1.60 g/L,摩爾得率達(dá)0.54。L-Phe大于4 g/L時(shí),OD600無明顯差異(P>0.05),而葡萄糖消耗和副產(chǎn)物乙醇有所增加。L-Phe添加量為4、8和12 g/L的實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵結(jié)束后,L-Phe剩余量分別為1.28、5.09和8.86 g/L,利用率分別為68.0%、36.4%和26.2%。因此,L-Phe最適添加量為4 g/L。

圖2 L-Phe添加量對(duì)M.pulcherrima生長(zhǎng)、葡萄糖消耗、乙醇和2PE產(chǎn)量的影響

2.3 碳源對(duì)2PE產(chǎn)量的影響

艾氏途徑中苯乙醛到2PE的反應(yīng)需要還原性輔酶(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)來提供電子供體[26],活細(xì)胞需要吸收能量來生成還原型輔酶以保持正常的氧化還原狀態(tài),葡萄糖等碳源能保證還原性輔酶的再生[27]。本研究比較了木糖、甘油、葡萄糖和果糖(均為26 g/L)4種碳源對(duì)2PE產(chǎn)量的影響(圖3-a)。在相同質(zhì)量濃度下,甘油能夠提供高于葡萄糖、果糖和木糖的還原力NADH[28],但結(jié)果表明4種碳源對(duì)CICC 1467合成2PE和生物量的促進(jìn)效果依次為：葡萄糖=果糖>甘油>木糖。雖然甘油能夠提供更多的還原力NADH,但對(duì)于2PE合成的促進(jìn)作用并不明顯,可能是CICC 1467胞內(nèi)甘油代謝相關(guān)的酶活性不夠造成的。CICC 1467幾乎無法利用木糖,生物量和2PE分別僅有0.22和0.11 g/L。又因葡萄糖比果糖價(jià)格低,故后續(xù)研究均采用葡萄糖為碳源。當(dāng)葡萄糖為10～110 g/L時(shí),隨著添加量的增加,2PE產(chǎn)量先增加后不變(圖3-b),這與先前報(bào)道的結(jié)果(2PE產(chǎn)量先增加后減少)不一致[25],可能CICC 1467是耐高滲酵母,能夠在高糖環(huán)境下生長(zhǎng)[15],而先前報(bào)道的K.marxianus不適合在高糖環(huán)境下生長(zhǎng)[25]。當(dāng)葡萄糖添加量為50 g/L時(shí),2PE產(chǎn)量最高為1.85 g/L,摩爾得率為0.63。當(dāng)葡萄糖添加量大于50 g/L時(shí),2PE產(chǎn)量無顯著變化(P>0.05),而副產(chǎn)物乙醇產(chǎn)量增加。綜上,葡萄糖最適添加量為50 g/L。

a-碳源種類；b-葡萄糖添加量

2.4 初始pH對(duì)2PE產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基pH能夠顯著影響微生物生命活動(dòng),進(jìn)而影響目標(biāo)產(chǎn)物合成效率。其主要機(jī)理包括以下3方面：一是改變蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷,從而影響其生物活性；二是引起細(xì)胞膜電荷變化,改變微生物細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能力；三是改變環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性及有害物質(zhì)的毒性[29]。故本研究探討了初始pH(2.0～6.0)對(duì)2PE產(chǎn)量的影響(圖4)。結(jié)果顯示,隨著初始pH的升高,生物量先升高后降低,2PE產(chǎn)量也隨之先升高后降低,但乙醇呈升高趨勢(shì),表明較低pH有利于M.pulcherrima合成2PE,而不利于酒精發(fā)酵。但當(dāng)初始pH為2.0時(shí),菌體幾乎無法生長(zhǎng),OD600僅有0.08。當(dāng)初始pH 3.0時(shí),生物量和2PE產(chǎn)量最高,分別為18.35和2.20 g/L,2PE摩爾得率達(dá)0.74,乙醇體積分?jǐn)?shù)僅有0.25%。

圖4 初始pH對(duì)M.pulcherrima生長(zhǎng)、葡萄糖消耗、乙醇和2PE產(chǎn)量的影響

當(dāng)初始pH大于3.0時(shí),生物量和2PE產(chǎn)量均降低,乙醇的體積分?jǐn)?shù)升高,說明pH過高不利于CICC 1467的生長(zhǎng)和2PE的合成,反而有利于乙醇發(fā)酵。綜上,最適初始pH為3.0。

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)2PE產(chǎn)量的影響

溫度可通過改變細(xì)胞膜流動(dòng)性來影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入,進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)[30]。此外,胞內(nèi)的絕大多數(shù)反應(yīng)是在酶的催化下完成的,溫度也可通過影響酶活性來影響產(chǎn)物的合成。因此,本研究考察了CICC 1467在15～30 ℃下的2PE合成情況(圖5)。結(jié)果表明,CICC 1467在15 ℃下仍然能夠生長(zhǎng)(OD600為12.04),并產(chǎn)生1.27 g/L的2PE,具有一定耐受低溫的能力。隨著溫度的升高,乙醇產(chǎn)量逐漸升高,25 ℃和30 ℃時(shí)達(dá)到最高(1%)。生物量和2PE產(chǎn)量先升高后下降,25 ℃時(shí),生物量和2PE產(chǎn)量達(dá)到最高,分別為19.48和2.26 g/L,摩爾得率達(dá)0.76。因此,最適發(fā)酵溫度為25 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)M.pulcherrima生長(zhǎng)、葡萄糖消耗、乙醇和2PE產(chǎn)量的影響

2.6 接種量對(duì)2PE產(chǎn)量的影響

低接種量有利于提高2PE產(chǎn)量和得率,但接種量過低會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期,增加生產(chǎn)成本；接種量過高雖然能夠縮短發(fā)酵時(shí)間,但會(huì)降低2PE產(chǎn)量和得率[31]。因此,接種量對(duì)合成2PE至關(guān)重要。本研究按照5%、10%、15%和20%的接種量(體積比,種子液OD600約為10)分別進(jìn)行接種,考察其對(duì)2PE合成的影響(圖6)。結(jié)果表明,接種量越高,菌體增殖速率、糖消耗速率和乙醇合成速率越高。2PE合成速率與菌體增殖速率正相關(guān)(圖6-d),證明2PE合成與微生物生長(zhǎng)相偶聯(lián),這與CHANTASUBAN等[16]的研究相吻合。就乙醇合成而言,接種量在10%以上時(shí),終產(chǎn)量無顯著差異(P>0.05),但均高于接種量為5%的發(fā)酵組(P<0.05)。當(dāng)接種量為5%時(shí),2PE產(chǎn)量在44 h達(dá)到最大值1.85 g/L,顯著高于其他發(fā)酵組(P<0.05)；而接種量為10%、15%和20%的發(fā)酵組合成的2PE最大產(chǎn)量分別為1.66、1.70和1.69 g/L,三者無顯著性差異(P>0.05)。因此,最佳的接種量為5%。

a-生物量；b-葡萄糖消耗；c-2PE產(chǎn)量；d-乙醇產(chǎn)量

2.7 非除菌條件下發(fā)酵潛力的探究

在工業(yè)生產(chǎn)上,培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌過程會(huì)有較高的能耗成本和物料損失。美極梅奇酵母能夠產(chǎn)生普切明酸抑制微生物生長(zhǎng)[17],SANTAMAURO等[19]已在未滅菌條件下成功合成微生物油脂。因此,本研究對(duì)CICC 1467在非除菌條件下的發(fā)酵潛力進(jìn)行了探究,初始L-Phe、葡萄糖、pH、接種量分別采用：4 g/L、50 g/L、pH 3.0和5%。結(jié)果表明,培養(yǎng)基除菌與否對(duì)2PE產(chǎn)量、葡萄糖剩余量和乙醇產(chǎn)量均無顯著影響(P>0.05)(圖7)。

圖7 培養(yǎng)基處理方式對(duì)M.pulcherrima生長(zhǎng)、葡萄糖消耗、乙醇和2PE產(chǎn)量的影響

具體而言,以蒸餾水為溶劑制培養(yǎng)基時(shí),除菌組2PE產(chǎn)量和得率為2.25 g/L、0.76,非除菌組則為2.27 g/L、0.77；用自來水配制培養(yǎng)基時(shí),除菌組2PE產(chǎn)量和得率為2.28 g/L、0.77,非除菌組則2.24 g/L、0.76。本研究證明在搖瓶發(fā)酵水平上,自來水中可能存在的微生物對(duì)發(fā)酵過程不會(huì)造成影響,CICC 1467可以在非除菌條件下利用自來水配制的培養(yǎng)基高效合成2PE。

3 結(jié)論

微生物合成2PE是天然提取和化學(xué)合成的有效替代策略。當(dāng)L-Phe 4 g/L、葡萄糖50 g/L、初始pH 3.0、發(fā)酵溫度25 ℃、接種量5%,用自來水配制培養(yǎng)基后,直接在非除菌條件下進(jìn)行發(fā)酵,2PE摩爾得率達(dá)0.76,是目前利用美極梅奇酵母單水相生產(chǎn)2PE的最高水平。雖然本文中,美極梅奇酵母可在搖瓶中利用未除菌培養(yǎng)基高效轉(zhuǎn)化L-Phe合成2PE,但在更大體系中的轉(zhuǎn)化效果需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,進(jìn)一步提高2PE產(chǎn)量還需要解決其對(duì)微生物的細(xì)胞毒性問題?？傊?本研究證明CICC 1467具備在非滅菌條件下高效轉(zhuǎn)化L-Phe合成2PE的能力,這對(duì)實(shí)際應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值。