酶法輔助提取柚皮多糖工藝條件的優(yōu)化探究

梁昌祥，林云曉，陳兵兵

（賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣西賀州 542899）

柚子又名“文旦”，是蕓香料植物柚柑橘屬的成熟果實，果皮厚，果實鮮甜可口，有沙田柚、蜜柚、胡柚、葡萄柚、龍都早山柚和枰山柚等品種[1]，柚子在秋季成熟，一般在10—11 月成熟可采摘上市，果皮厚耐貯藏，因而獲得“天然水果罐頭”的稱號。柚皮內(nèi)富含營養(yǎng)元素，如磷鉀元素，是對植物生長有利的營養(yǎng)元素，可作為植物的優(yōu)質(zhì)肥料，而且柚子皮內(nèi)還富含化合物，如多糖、揮發(fā)油、維生素、黃酮類、粗纖維、香豆素類、天然色素、柚皮甙等化合物成分。柚皮成分中的多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，多糖具有抗菌、抗病毒、抗衰老、降血脂等藥理作用，以及副作用小、不易造成殘留等優(yōu)點，相關(guān)研究人員把開發(fā)多糖資源、深入研究保健功能等的推進(jìn)作為研究熱點和焦點[2]。在國內(nèi)外食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域研究是熱點。

柚子樹在我國栽培不僅歷史悠久，而且品種資源豐富。起源于東南亞、印度北部或中國南部一帶[3]，我國現(xiàn)在栽種柚類果樹原產(chǎn)地眾多，貴州、重慶、浙江、江西、廣東、廣西、福建、湖南、四川、湖北等省份較多。我國柚類水果每年產(chǎn)量和銷量都較大，2017 年國內(nèi)消費增加4%，約達(dá)到了460 萬t。其中，中國柚類的種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[4]。福建柚類種植面積、產(chǎn)量、出口量、市場份額等名列全國第一[5]，有“中國柚都”的美稱。柚子經(jīng)過工廠加工和人們食用后，產(chǎn)生大量的柚子皮一般會被當(dāng)作垃圾處理，資源既得不到充分利用，又沒有經(jīng)濟效益，還會發(fā)生污染環(huán)境等一系列問題。因此，如果這些柚子皮得以利用，實現(xiàn)變廢為寶，對經(jīng)濟及環(huán)境有重大作用。例如，柚子皮具有多孔結(jié)構(gòu)，可以吸附有毒有害物質(zhì)，可用于廢水處理等工序；柚子皮內(nèi)含有許多生理活性物質(zhì)，這些生理活性物質(zhì)有抑菌、抗輻射、預(yù)防心臟病、預(yù)防腦血管疾病等作用，在發(fā)展制藥和保健品方面的市場前景十分廣闊；柚子皮含有一些維生素、礦物質(zhì)、葡萄糖、鐵、鈣等營養(yǎng)成分，可以直接加工成食品。柚皮還具有保護(hù)心血管、驅(qū)蟲、去角質(zhì)、治小兒肺炎、治療凍瘡、去污去異味等作用，具有很大發(fā)展空間。

國內(nèi)關(guān)于從柚皮中提取多糖的相關(guān)論文非常少。劉國聰?shù)热薣6]經(jīng)2 h 回流脫脂，在高溫90 ℃條件下提取3 h，最后得到柚皮多糖的平均產(chǎn)率為7.28%，雖然提取率不低，但回流時間長、效率低。郭文等人[1]采用熱水浸提的方法提取柚皮多糖，最佳條件下柚皮多糖的提取率為6.45%，在經(jīng)過2.5 h 的提取、提取2 次，但此最佳條件需要的時間長次數(shù)多且產(chǎn)率和效率都不高。孔夢曉等人[7]用水提醇沉法從柚皮中提取粗多糖，最佳提取條件下粗多糖平均提取率為8.14%，要經(jīng)2.5 h 提取，再經(jīng)3 次反復(fù)提取，此提取條件需要耗費的時間較長，且需要多次的反復(fù)提取，耗能耗時。岳賢田[2]和張荔菲等人[8]分別采用微波輔助、超聲波酶法輔助提取多糖，前者浸提時間要4 h，且需浸提4 次；后者要酶解時間1.2 h，超聲時間29 min，雖提取率較高，但是提取效率較低、成本較高。楊喆茗等人[9]用纖維素酶輔助提取柚皮多糖，反應(yīng)時間為5.5h，提取3 次得率僅為6.3%，不僅提取時間長而且效率低。多糖是一類重要的大分子物質(zhì)，主要廣泛來源于高等植物，對人體的毒副作用小，免疫調(diào)節(jié)劑將具有很大的開發(fā)潛力，并且將多糖開發(fā)為新型抗腫瘤藥物也具有較高的潛在價值[10]?，F(xiàn)在心血管疾病的致死率高且治療費驚人，腫瘤成為多發(fā)病、常見病，多糖在醫(yī)藥方面有很大的發(fā)展?jié)摿?。國?nèi)目前主要采用傳統(tǒng)的溶劑提取法提取柚皮多糖[5]，近年來用酶法提取、微波輔助法、超聲波輔助法等提取柚皮多糖，雖然能夠在一定程度提高產(chǎn)率，但在優(yōu)化提取條件方面有待提升。試驗以柚子皮作為原料，經(jīng)切片烘干后粉碎，過一定目篩，加酶輔助提取后濾液蒸發(fā)濃縮，加醇沉淀得到多糖。以柚子皮多糖提取率為指標(biāo)，并采用分光光度計法測定柚子皮中的多糖提取率，研究分析4 個單因素酶用量、提取溫度、反應(yīng)時間、濃縮液與乙醇用量比對柚子皮多糖提取率的影響作用。先對各個單因素進(jìn)行試驗，再根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗方案對工藝提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

柚子皮，取黃色橢圓形柚子皮，厚度0.8~1.5 cm。

1.1.2 試劑

葡萄糖（AR），廣東光華科技股份有限公司提供；果膠酶（酶活力5 萬U/g）、纖維素酶（酶活力10 萬U/g），寧夏和氏璧生物科技有限公司提供；硫酸（AR），西隴科學(xué)股份有限公司提供；95%乙醇（AR），成都市科龍化工試劑廠提供；10%苯酚。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ102 型粉碎機，河北省黃馬華市新興電器廠產(chǎn)品；DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；AR224CN 型電子分析天平，上海舜宇科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JJ500 型電子天平，江蘇常熟徐市產(chǎn)品；HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋，上?！憧茖W(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；722 型可見光分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D（Ⅲ） 型循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 柚子皮提取多糖的流程及測定方法

1.3.1 提取多糖的工藝步驟

從柚子皮中提取多糖的工藝流程：

柚子皮→80 ℃下烘干→粉碎→過40 目篩→稱質(zhì)量→移入錐形瓶→加蒸餾水→加酶→水浴提取→真空抽濾→取濾液蒸發(fā)濃縮至1/5→加95%乙醇沉淀→過濾收集沉淀→干燥箱70 ℃下烘干→得到粗多糖。

1.3.2 提取多糖的具體方法流程

參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]有所改動，將柚子剝皮，把柚子皮切成1 cm 寬的薄片放進(jìn)80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中約烘干3 h，再用粉碎機粉碎，過40 目篩，準(zhǔn)確稱取5 g 柚皮粉倒入250 mL 錐形瓶中，再加入果膠酶和纖維素酶（按質(zhì)量1∶1），再加蒸餾水至150 mL刻度，攪拌搖勻，pH 值5.5~5.8，在一定溫度恒溫水浴中浸提一定時間后過濾，浸提過程中適當(dāng)攪拌，避免柚皮粉渣粘在瓶壁，其濾液蒸發(fā)濃縮至體積的1/5，濃縮液冷卻后緩慢加入一定體積的95%乙醇，邊加入邊攪拌，靜置3 h 后抽濾收集沉淀，將沉淀放置干燥箱中70 ℃烘干得到粗多糖。

1.3.3 粗多糖的提取率計算

1.3.4 繪制葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考相關(guān)文獻(xiàn)的硫酸-苯酚法[11-13]，方法步驟如下。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟和方法見表1。

表1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟和方法

1.4 單因素試驗設(shè)計

參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，采用酶輔助水提醇沉法，影響柚皮提取多糖的因素有很多，如酶添加量、浸提時間、提取溫度、料液比、pH 值、乙醇用量等。通過預(yù)試驗確定影響提取效果較大的因素，故選用酶添加量、提取時間、提取溫度、濃縮液與乙醇用量比作為探究柚子皮提取粗多糖的單因素條件。

1.4.1 不同酶添加量對柚皮多糖提取率的影響

稱取5 g 柚皮粉，保持固定的提取時間為80 min，溫度50 ℃，濃縮液加入95%乙醇60 mL，酶添加量（果膠酶∶纖維素酶= 1∶1） 分別為1%，2%，3%，4%，5%進(jìn)行提取試驗，分別重復(fù)3 次。

1.4.2 不同提取時間對柚皮多糖提取率的影響

稱取5 g 柚皮粉，保持固定加入的酶添加量3%，水浴提取溫度50 ℃，濃縮液加入95%乙醇60 mL，提取時間分別取40，60，80，100，120 min 進(jìn)行試驗，分別重復(fù)3 次。

1.4.3 不同提取溫度對柚皮多糖提取率的影響

稱取5 g 柚皮粉，保持固定酶添加量3%，提取時間為80 min，濃縮液加入95%乙醇60 mL，提取溫度分別為30，40，50，60，70 ℃進(jìn)行試驗，分別重復(fù)3 次。

1.4.4 不同濃縮液與乙醇用量比對柚皮多糖提取率的影響

稱取5 g 柚皮粉，保持固定加入的酶添加量3%，溫度50 ℃，提取時間為80 min，25 mL 濃縮液與加入95%乙醇比例分別為5∶4，5∶8，5∶12，5∶16，5∶20 （即乙醇用量分別為 20，40，60，80，100 mL）進(jìn)行試驗，分別重復(fù)3 次。

1.5 柚子皮多糖工藝提取條件的優(yōu)化

1.5.1 設(shè)計正交試驗

從每個單因素的研究范圍內(nèi)選擇合適的3 個水平設(shè)計因素水平表，選取合適的正交表按編號進(jìn)行試驗，尋求最優(yōu)水平搭配。

1.5.2 正交試驗最佳條件的驗證

通過正交表的試驗結(jié)果分析得到提取多糖的最優(yōu)水平組合，結(jié)合實際，用最佳提取工藝條件進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)3 次，檢查預(yù)測值與試驗值之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

由試驗得出的結(jié)果以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度（Y） 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

柚皮粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 柚皮粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)計算得到葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：

式中：A——吸光度；

C——標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，mg/mL。

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 不同酶添加量對柚皮多糖提取率的影響

酶添加量對提取率的影響見圖2。

圖2 酶添加量對提取率的影響

由圖2 可知，酶添加量（纖維素酶和果膠酶）為2%~3%時，可明顯提高多糖提取率，當(dāng)酶添加量到達(dá)3%時，多糖提取率升高趨勢變得緩慢，也沒有下降趨勢，由于纖維素酶和果膠酶對植物細(xì)胞去除細(xì)胞壁起到很好的作用，所以加快細(xì)胞內(nèi)多糖的流出，當(dāng)酶添加量在3%~5%時，提取率無明顯變化，可能因為多糖在3%時已基本全部提取出來，避免生產(chǎn)應(yīng)用中成本的增加，應(yīng)盡可能節(jié)省試劑用量。因此，選取2%，3%，4%酶含量進(jìn)行正交試驗。

2.2.2 不同提取時間對柚皮多糖提取率的影響

提取時間對提取率的影響見圖3。

由圖3 可知，提取時間分別為40，120 min 時提取率很低，提取時間從40~60 min 提取率顯著升高，100 min 后多糖提取率明顯下跌，可能加熱時間太長會使多糖發(fā)生水解，如果時間過短，反應(yīng)不完全也會使提取率過低，60~100 min 區(qū)間內(nèi)提取率都較高，說明浸提時間加長在一定時間內(nèi)是有利于多糖溶出，綜合考慮選提取時間為60，80，100 min 進(jìn)行正交試驗。

圖3 提取時間對提取率的影響

2.2.3 不同提取溫度對柚皮多糖提取率的影響

提取溫度對提取率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對提取率的影響

由圖4 可知，50，60 ℃時趨勢線平緩，提取結(jié)果相差微小，溫度在45 ℃左右出現(xiàn)峰值，提取效果最好。纖維素酶和果膠酶的酶活性為50 ℃時最佳，溫度在30，70 ℃時多糖提取效果都較低，因為溫度過高或過低酶活性都會下降，影響反應(yīng)速率，所以提取效果會下降。因此，選取提取溫度為40，50，60 ℃進(jìn)行正交試驗。

2.2.4 不同濃縮液與乙醇用量比對柚皮多糖提取率的影響

乙醇用量對提取率的影響見圖5。

圖5 乙醇用量對提取率的影響

由圖5 可知，25 mL 濃縮液所加的乙醇用量為40 mL（濃縮液與乙醇用量比5∶8） 時提取率最高，以此為中心點加入過多或過少的95%乙醇都對多糖的沉淀量有較大影響，乙醇用量為40 mL（濃縮液與乙醇量比5∶8） 時可能多糖已全部發(fā)生沉淀，且要考慮到實際生產(chǎn)中加入過多95%乙醇會造成成本的增加，故選取濃縮液與加乙醇用量比分別為5∶4，5∶8，5∶12 （即加乙醇分別為 20，40，60 mL） 作為進(jìn)行正交試驗的因素水平。

2.3 正交試驗結(jié)果與分析

2.3.1 正交試驗因素水平表

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果分析，從每個單因素中選擇合適的3 個水平，設(shè)計合理的四因素三水平的試驗方案，并列出L9（34）正交表。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設(shè)計

2.3.2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

正交表和試驗分析結(jié)果見表3。

表3 正交表和試驗分析結(jié)果

由直觀分析可知，RC>RA>RB>RD，4 個影響多糖提取效果的因素按影響作用大小排序分別是C>A>B>D，因此可進(jìn)行的排列順序如下：提取溫度>酶添加量>提取時間> 濃縮液與乙醇用量比，提取溫度最顯著，根據(jù)實際生產(chǎn)中提取效率和提取率的考慮，最優(yōu)組合為A2B1C1D2，即酶添加量為3%，提取時間為60 min，提取溫度40 ℃，濃縮液與乙醇用量比為5∶8（加乙醇量40 mL） 時多糖提取率最高。

2.3.3 最優(yōu)條件的優(yōu)化

通過研究分析單因素試驗和進(jìn)行正交試驗后的數(shù)據(jù)得到最優(yōu)組合，再依據(jù)最優(yōu)水平組合進(jìn)行3 次重復(fù)試驗，驗證試驗結(jié)果第1 次為7.6%，第2 次為9.0%，第3 次為8.0%，平均提取率為8.2%，大于正交試驗中的最大值，驗證試驗成功。

95%乙醇沉淀見圖6，烘干的粗多糖見圖7。

圖6 95%乙醇沉淀

圖7 烘干的粗多糖

3 結(jié)論

通過進(jìn)行酶添加量、提取時間、提取溫度、濃縮液與乙醇用量比的單因素試驗分析，并合理設(shè)計正交試驗方案，對數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)處理分析得到最佳的工藝條件為酶添加量3%，提取時間60 min，提取溫度40 ℃，濃縮液與乙醇用量比5∶8（加乙醇用量40 mL） 時多糖提取率為8.2%。測出的提取率大于正交試驗中的最大值，實現(xiàn)了最佳條件優(yōu)化。細(xì)胞壁中的纖維素和果膠會在纖維素酶和果膠酶作用下酶解，加快細(xì)胞壁破裂，有利于多糖的溶出。酶法輔助提取比傳統(tǒng)水溶性、熱水浸提縮短提取時間和降低提取溫度，便于在實際生產(chǎn)中成本的節(jié)省和效率的提高，并且工藝簡便、經(jīng)濟環(huán)保無毒。試驗過程中產(chǎn)生的柚皮渣可充分利用起來，可在發(fā)酵原料、飼料等方面的用途發(fā)展，其開發(fā)潛力都有待進(jìn)一步的研究。