鲅魚(yú)加工副產(chǎn)物水解液中ACE 抑制肽分離純化研究

章禹航，翟 雨，韓穎，張唯嘉，馮 濤，黃光榮

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE） 抑制肽，可以阻止血管緊張素II 的生成，從而起到降低血壓的作用，是近年來(lái)研究比較多的一種生物活性肽，最早于1970 年由Ferreira S H等人[1]從毒蛇毒液中分離得到。如今，已有大量報(bào)道從動(dòng)植物組織中獲得并鑒定的ACE 抑制肽，且有部分已商業(yè)化應(yīng)用。從動(dòng)植物組織中獲得ACE 抑制肽通常有2 種手段：直接分離純化天然ACE 肽，或者是以組織蛋白質(zhì)為原料進(jìn)行酶解獲得ACE 肽。海洋魚(yú)類(lèi)種類(lèi)眾多，是制備ACE 抑制肽的良好來(lái)源之一[2-4]。鲅魚(yú)，學(xué)名“藍(lán)點(diǎn)馬鮫”（Scomberomorus niphonius），作為一種低價(jià)值的海洋魚(yú)類(lèi)，以鮮食和初級(jí)加工為主，精深加工利用的報(bào)道相對(duì)較少。目前，在鲅魚(yú)加工副產(chǎn)物制備生物活性肽方面，主要有抗氧化肽[5-7]、抗菌肽[8]、礦物質(zhì)結(jié)合肽[9]等。以鲅魚(yú)加工副產(chǎn)物為原料，先經(jīng)脫脂后得到魚(yú)粉蛋白，再經(jīng)堿性蛋白酶酶解，最后經(jīng)超濾、層析分離和高效液相色分離得到純度較高的具有較強(qiáng)ACE 抑制活性的小肽，為下一步氨基酸序列鑒定提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲅魚(yú)加工副產(chǎn)物，浙江舟山某企業(yè)提供，實(shí)驗(yàn)室冷凍保存；堿性蛋白酶，酶活力為200 U/mg；DEAE-Sepharodse FF、Sephacryl S-100 等，美國(guó)GE公司提供；HHL，生化純；乙腈、甲醇、三氟乙酸等為色譜純，乙酸乙酯、無(wú)水硫酸銅、福林酚、石油醚、乙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Allegra X-30 型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；DGG-9140B 型鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；RV-10 型數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品；SHZ-A 型水浴恒溫振蕩器，常州人和儀器廠產(chǎn)品；UV1000 型分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；ATKA Pure 20 型蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE 公司產(chǎn)品；LC-6AD 型半制備高效液相色譜，日本島津公司產(chǎn)品；Masterflex L/S 型超濾系統(tǒng)，美國(guó)Cole-Pharmer 公司產(chǎn)品；8010S 型組織搗碎機(jī)，美國(guó)Waring 公司產(chǎn)品；Scientz-30 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鲅魚(yú)酶解液的制備

鲅魚(yú)加工副產(chǎn)物用流水解凍后，剔除骨頭和雜質(zhì)，經(jīng)組織搗碎機(jī)打成漿，以1∶5（W∶V） 比例的異丙醇于75 ℃下脫脂回流3h，然后過(guò)濾，得到的濾渣在55 ℃下鼓風(fēng)干燥1~2 h，再經(jīng)粉碎，過(guò)100 目篩，于玻璃瓶中密封，備用。

稱(chēng)取30 g 脫脂魚(yú)粉，分散到濃度為20 mmol/L，pH 值8.67 的Tris-HCl 緩沖液2 L 中，攪拌混勻，并在55 ℃下恒溫10 min 后加入75 mg 堿性蛋白酶，攪拌混勻，開(kāi)始計(jì)時(shí)，水解4.45 h。然后于沸水浴中加熱10 min，使酶失活，再經(jīng)流水冷卻到室溫后進(jìn)行離心（以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心20 min），收集上清液，4 ℃下保存，備用。

1.3.2 超濾分離

水解液先經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，再依次通過(guò)10，5，3 kDa 的膜包進(jìn)行超濾，收集到4 個(gè)組分：組分 I（>10 kDa）、組分 II（5~10 kDa）、組分III（3~5 kDa）、組分IV（<3 kDa）。組分經(jīng)冷凍干燥后，密封保存，備用。

1.3.3 離子交換層析分離

將超濾組分以蒸餾水溶解（20 mg/mL），在ATKA Pure 20 型蛋白純化系統(tǒng)中進(jìn)行DEAESepaherose FF 陰離子交換層析（1.0 cm×40 cm）。梯度洗脫緩沖液為：A 液，50 mmol/L，pH 值7.0 Tris-HCl 溶液；B 液，1.0 mol/L NaCl 溶液的 A 液；洗脫流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為5.0 mL。洗脫程序：①A 液洗脫30 min；②120 min 內(nèi)B 液升到100%；③B 液洗脫60 min；④A 液洗脫60 min。重復(fù)以上操作，收集A220nm組分，冷凍干燥保存。

1.3.4 凝膠過(guò)濾層析

將離子交換層析組分以蒸餾水溶解（20 mg/mL），在ATKA Pure 20 蛋白純化系統(tǒng)中進(jìn)行Sephacryl S-100 HR 凝膠過(guò)濾層析（1.6 cm×60 cm），以蒸餾水為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量0.5 mL。重復(fù)以上操作，收集A220nm組分，冷凍干燥保存。

1.3.5 反相高效液相色譜

將凝膠過(guò)濾層析組分以蒸餾水溶解（1.0 mg/mL），在LC-6AD 型半制備高效液相色譜中進(jìn)行分離，色譜條件：進(jìn)樣量10 μL，色譜柱為C18柱（Waters Sunfire，4.6 cm×250 mm，5.0 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速為0.6 mL/min，梯度洗脫（60 min 內(nèi)流動(dòng)相乙腈由5%線(xiàn)性增加到40%）。重復(fù)以上操作，收集A220nm組分，并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行蛋白質(zhì)和活性測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 水解度測(cè)定

采用茚三酮比色法測(cè)定游離氨基含量[10]，總蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測(cè)定[11]，用已水解的氨基數(shù)占原料總氨基百分?jǐn)?shù)表示水解度。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用福林酚法[12]。

1.4.3 ACE 抑制率測(cè)定

樣品根據(jù)測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度以蒸餾水稀釋到0.5 mg/mL 后，采用液相色譜法測(cè)定[13]，高效液相色譜樣品稀釋到0.1 mg/mL 后測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)3 次平行測(cè)定，以平均值±SD 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾

鲅魚(yú)脫脂粉以堿性蛋白酶水解，得到酶解液，測(cè)得其水解度為32.84%。將酶解液超濾分離，獲得4 個(gè)超濾組分：組分 I（>10 kDa）、組分 II（5~10 kDa）、組分 III（3~5 kDa） 和組分 IV （<3 kDa）。

超濾各組分的ACE 抑制率見(jiàn)圖1。

圖1 超濾各組分的ACE 抑制率

由圖1 可知，組分Ⅳ（分子量小于3 kDa） 的ACE 抑制活性最高，抑制率達(dá)45.6%，這與朱國(guó)萍等人[14]對(duì)蝦頭自溶釋放出的肽類(lèi)產(chǎn)物進(jìn)行超濾分離出的結(jié)果相類(lèi)似，有文獻(xiàn)報(bào)道很多ACE 抑制肽由15 個(gè)以下氨基酸組成[15]。因此，選擇組分Ⅳ進(jìn)一步分離純化。

2.2 離子交換層析

將超濾得到的分子量小于3 kDa 組分IV，進(jìn)一步經(jīng)DEAE-Seopharose FF 陰離子交換層析分離。

DEAE-Sepharose FF 陰離子交換層析分離圖見(jiàn)圖2，離子交換層析分離各組分ACE 抑制活性見(jiàn)表1。

圖2 DEAE-Sepharose FF 陰離子交換層析分離圖

表1 離子交換層析分離各組分ACE 抑制活性/%

由圖2 可知，經(jīng)DEAE-Seopharose FF 分離可得到3 個(gè)組分，大量重復(fù)收集組分，測(cè)定ACE 抑制率。結(jié)果表明，組分A2 的ACE 抑制率最高，達(dá)50.3%，組分A3 則最低，僅12.4%。將A2 組分進(jìn)行凍干，作為凝膠過(guò)濾層析用樣品。

2.3 凝膠過(guò)濾層析

Sephacryl S-100 HR 凝膠過(guò)濾層析分離圖見(jiàn)圖3，凝膠過(guò)濾層析分離各組分ACE 抑制活性見(jiàn)表2。

圖3 Sephacryl S-100 HR 凝膠過(guò)濾層析分離圖

表2 凝膠過(guò)濾層析分離各組分ACE 抑制活性/%

將組分A2 溶解于蒸餾水后，置于凝膠過(guò)濾柱層析分離，并收集組分，測(cè)定ACE 抑制率。由圖3 可知，經(jīng)Sephacryl S-100 HR 層析分離后得到2 個(gè)主要峰組分B1 和B2，測(cè)定其ACE 抑制活性。由表2可知，B1 和B2 組分的ACE 抑制率分別為31.1%和83.4%，顯然，分子量更小的B2 組分的ACE 抑制活性高于B1 組分。收集B2 組分，冷凍干燥后供反相高效液相色譜分離。

2.4 反相高效液相色譜

將凝膠過(guò)濾層析收集的具有最高ACE 抑制活性的組分B2，進(jìn)一步進(jìn)行半制備液相色譜分離純化。結(jié)果表明，在5 min 與7 min 處有2 個(gè)峰，分別標(biāo)記為組分C1 和C2，經(jīng)ACE 抑制活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)C2組分ACE 抑制率接近于0，C1 組分ACE 抑制率為87.6%（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度0.1 mg/mL）。

反相高效液相色譜分離圖見(jiàn)圖4。

圖4 反相高效液相色譜分離圖

3 結(jié)論

以鲅魚(yú)加工副產(chǎn)物為原料，經(jīng)堿性蛋白酶水解，以期獲得ACE 抑制肽。酶解液經(jīng)超濾、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和反相高效液相色譜等分離純化步驟，獲得具有較高純度的ACE 抑制活性組分，ACE 抑制率達(dá)87.6%（0.1 mg/mL）。研究結(jié)果為鲅魚(yú)加工副產(chǎn)物高附加值利用和預(yù)防高血壓的功能性食品開(kāi)發(fā)提供了參考，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)C1 組分進(jìn)行氨基酸序列鑒定，并人工合成該小肽，進(jìn)行活性驗(yàn)證，同時(shí)試驗(yàn)其在模型細(xì)胞中的ACE 抑制活性及試驗(yàn)動(dòng)物中的活性，還將進(jìn)一步研究其在消化道中穩(wěn)定性與吸收特性等，以期為鲅魚(yú)加工副產(chǎn)物制備降血壓肽的商業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。