定性PCR法檢測(cè)牡蠣中的創(chuàng)傷弧菌

□ 董慧明 遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心

創(chuàng)傷弧菌也稱海洋弧菌，革蘭氏陰性菌，屬于弧菌屬，是一種嗜鹽菌，廣泛存在于海洋環(huán)境中。創(chuàng)傷弧菌是主要的海洋致病細(xì)菌之一，能夠引起食源性疾病、傷口感染、加劇肝病或基本疾病患者的病情。生牡蠣是創(chuàng)傷弧菌引起食源性疾病的主要傳染源［1］。牡蠣（俗稱生蠔）因味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者喜愛，但其易受到多種食源性病原菌和寄生蟲的感染，屬于眾多水產(chǎn)品中風(fēng)險(xiǎn)較高的一類傳染源［2］。感染創(chuàng)傷弧菌后易引起發(fā)燒、腹瀉、低血壓等急性腸胃炎癥狀，嚴(yán)重可致組織感染和敗血癥，甚至引起死亡。本研究依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.44-2020）對(duì)牡蠣進(jìn)行檢驗(yàn)，采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)（VITEK）獲得的生化結(jié)果用于驗(yàn)證定性PCR法鑒定創(chuàng)傷弧菌的準(zhǔn)確性［3］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白胨-氯化鈉-纖維二糖-多粘菌素E（PNCC）增菌液、CC瓊 脂培養(yǎng)基平板、mCPC瓊脂培養(yǎng)基平板、3%NaCl胰蛋白胨大豆瓊脂平板（3%TSA）、革蘭染色劑（北京陸橋技術(shù)有限公司）；革蘭陰性鑒定卡（生物梅里埃美國股份有限公司）；創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC2756、副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802（美國菌種保藏中心）；DNA提取試劑盒（上海生工生物技術(shù)有限公司）；PCR反應(yīng)配套試劑（大連寶生物工程有限公司）；瓊脂糖（美國sigma公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；A2型生物安全柜（美國NUAIRE公 司）；VITEK2 CompactOMPACT全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國梅里埃公司）；生物顯微鏡（日本Olympus公司）；定性PCR儀（美國ABI公司）；凝膠成像系統(tǒng)及電泳儀（美國GE公司）；離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司)；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；高壓滅菌鍋（日本Tomy Kogoy公司）；紫外分光光度計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

①樣品制備。從市場購買鮮活生牡蠣于4 h內(nèi)完成處理。在無菌條件下，打開牡蠣外殼，取其全部內(nèi)容物。②增菌培養(yǎng)。稱取處理后的樣品25 g加入225 mLPNCC增菌液中，均質(zhì)2 min，于36 ℃條件下培養(yǎng)18 h。③分離培養(yǎng)。將增菌培養(yǎng)物劃線接種至CC平板和mCPC平板，在36 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長特征。④革蘭氏染色。將純化后的單個(gè)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)和特征。

1.4 生化鑒定

①VITEK鑒 定。挑 取3%TSA平板純化后的菌落，用0.45%Nacl溶液配制菌懸液（麥?zhǔn)蠞舛葹?.5～0.7 MCF），選用革蘭陰性菌鑒定卡用VITEK進(jìn)行檢測(cè)。②嗜鹽性試驗(yàn)。根據(jù)創(chuàng)傷弧菌的嗜鹽性，挑取3株可疑菌分別接種于0%、3%、6%、8%和10%的Nacl胰蛋白溶液中，在36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用紫外分光光度法測(cè)定600 nm處創(chuàng)傷弧菌嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)后菌液的吸光度A［4］。

1.5 PCR檢測(cè)

（1）DNA提取。按DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。

（2）PCR擴(kuò)增。引物信息見表1。反應(yīng)體系按PCR反應(yīng)配套試劑說明書配制，反應(yīng)體積為25 μL。對(duì)照設(shè)置：①空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用ddH2O替代樣品DNA；②陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA替代樣品DNA；③陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA替代樣品DNA。

表1 創(chuàng)傷弧菌PCR檢測(cè)用引物

（3）擴(kuò)增條件。94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 凝膠電泳

所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳跑膠情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)

分離所得菌株在CC及mCPC培養(yǎng)基平板上呈邊緣透明、圓形、扁平的黃色至橘黃色菌落，革蘭染色結(jié)果為革蘭氏陰性，弧狀、無芽胞，與典型創(chuàng)傷弧菌特征相符，菌落特征見圖1。

圖1 分離菌株在CC及mCPC平板上的菌落形態(tài)

2.2 嗜鹽性試驗(yàn)

分離出的3株菌在含3%和6%Nacl的胰蛋白水中生長旺盛，在含0%、8%、10%Nacl的胰蛋白水中不生長，嗜鹽性試驗(yàn)表明分離的3株菌符合創(chuàng)傷弧菌最適宜生長濃度為3%～6%的生化特點(diǎn)。

2.3 VITEK鑒定

利用VITEK鑒定3株分離菌，其鑒定概率百分比在97%～99%，結(jié)果顯示置信度為“極好的鑒定”，鑒定3株分離菌均為創(chuàng)傷弧菌。

2.4 PCR檢測(cè)結(jié)果

陰、陽性對(duì)照、空白對(duì)照及3株分離菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖2。實(shí)驗(yàn)在陽性對(duì)照出現(xiàn)目標(biāo)條帶 （519 bp），陰性對(duì)照及空白對(duì)照無條帶出現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)成立。檢測(cè)結(jié)果顯示3株菌的vvh A基因全部陽性，鑒定為創(chuàng)傷 弧菌。

圖2 3株分離菌的PCR電泳圖

3 討論

創(chuàng)傷弧菌在我國南方溫?zé)釒ШＳ蜉^為常見，生吃海鮮，如腌制的螃蟹、牡蠣等這些貝殼類海鮮容易成為傳播載體。牡蠣是一種濾食性海洋動(dòng)物，易富集各種致病微生物及病毒，牡蠣中的創(chuàng)傷弧菌能夠感染人類，而且是一類感染率比較高的海產(chǎn)品。有研究表明，我國生食動(dòng)物性水產(chǎn)品中存在創(chuàng)傷弧菌污染［5］，對(duì)牡蠣進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)能有效保障廣大人民群眾的食品安全。

創(chuàng)傷弧菌的鑒定增添了新的PCR檢測(cè)方法。值得注意的是，在操作過程中，DNA的純度及濃度、PCR體系的配制、儀器的準(zhǔn)確度以及人為因素都會(huì)影響PCR鑒定結(jié)果，同時(shí)還要避免菌株和DNA氣溶膠污染。目前傳統(tǒng)的創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)是通過形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)、生化檢驗(yàn)及血清型試驗(yàn)，其步驟煩瑣，耗時(shí)費(fèi)力。實(shí)驗(yàn)證明，PCR法在牡蠣創(chuàng)傷弧菌的鑒定中具有高通量、簡單快速等優(yōu)點(diǎn)，與VITEK法相結(jié)合，更加提高了PCR食品檢驗(yàn)法的準(zhǔn)確率。PCR法不僅可實(shí)現(xiàn)對(duì)創(chuàng)傷弧菌準(zhǔn)確快速鑒定，而且可快速區(qū)分其他相似菌，如副溶血性弧菌等。